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方法文章

动脉粥样硬化动物模型中暴露于颗粒物加重心肌缺血

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DOI：

10.3791/63184

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2021年12月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种复合型动物模型，通过暴露于可吸入颗粒物（PM）以加重动脉粥样硬化背景下的心肌缺血。

摘要

空气污染（尤其是颗粒物污染）引发的健康问题正受到越来越多的关注，特别是在心血管疾病患者中，其会加剧复杂病症并导致不良预后。单纯的急性心肌缺血（MI）或颗粒物（PM）暴露模型不适用于多因素疾病的此类研究。本文介绍了一种构建复合模型的方法，该模型结合了PM暴露、动脉粥样硬化和心肌缺血。ApoE−/−小鼠接受高脂饮食喂养16周以诱导动脉粥样硬化；通过气管滴注PM标准悬液模拟PM的肺部暴露；在末次暴露后一周结扎左前降支冠状动脉。气管滴注PM可模拟急性肺部暴露，同时显著降低实验成本；结合无创气管插管与新型辅助扩张装置的经典左前降支动脉结扎术，可提高动物存活率并降低操作难度。该动物模型能够合理地模拟空气污染加重心肌梗死患者病理变化的过程，为涉及多因素疾病研究的相关动物模型构建提供参考。

引言

空气污染与高全因死亡率相关，其造成的疾病负担远超水污染、土壤污染和职业暴露的总和1。世界卫生组织的一份报告指出，2016年全球城市和农村地区因室外空气污染导致了420万例过早死亡2。全球91%的人口生活在空气质量超过世界卫生组织指南限值的地区2。此外，细颗粒物（PM）（直径≤2.5 µm，PM2.5）被公认为对全球公共卫生最具威胁的空气污染物3，尤其对低收入和中等收入国家城市居民的健康影响更为严重。

空气污染对心血管疾病的不良影响值得更多关注。既往研究表明，颗粒物（PM）暴露会增加心血管疾病（CVDs）的风险4。暴露于高浓度超细颗粒物数小时可导致心肌梗死死亡率上升。对于有心肌梗死病史的人群，暴露于超细颗粒物会显著增加复发风险5。此外，普遍认为颗粒物暴露会加速动脉粥样硬化的进展6。

在医学研究中，选择合适的动物模型至关重要。目前已有简单的动脉粥样硬化动物模型7、心肌缺血动物模型8以及颗粒物暴露动物模型9。载脂蛋白E基因敲除（ApoE−/−）小鼠是动脉粥样硬化研究中常用的传统小鼠模型。ApoE−/−小鼠清除血浆脂蛋白的能力严重受损，通过高脂饮食喂养可诱发严重的动脉粥样硬化，类似于人类动脉粥样硬化性心脏病的饮食依赖性7。结扎左前降支冠状动脉（LAD）是诱导心肌缺血事件的经典方法8,10。气管灌注已广泛应用于多项研究，在暴露模型中尤为突出11,12，因其具有更好的模拟效果和更低的成本。

然而，单一疾病的动物模型在科学研究中存在显著局限性。仅通过结扎左前降支（LAD）诱导的心肌缺血并不能模拟实际临床情况。在自然状态下，心肌缺血通常由斑块破裂和冠状动脉阻塞引起13。缺血性心肌病患者通常伴有动脉粥样硬化基础病变13，体内还存在脂质代谢异常和炎症反应14。因此，由物理因素引起的心肌缺血与自然条件下发生的心肌缺血具有不同的病理表现。现有研究表明，伴有动脉粥样硬化的心肌缺血模型中，心肌梗死和炎症程度更为严重15,16。颗粒物（PM）暴露可通过诱导炎症和氧化应激进一步加重动脉粥样硬化和心肌缺血1。由于这三种因素在自然状态下通常共存，因此采用复合模型可更真实地模拟实际病理情况。

本方案描述了一种结合动脉粥样硬化（AS）和细颗粒物（PM）急性暴露的动物心肌缺血（MI）模型的建立方法。通过给予ApoE−/−小鼠高脂饮食以诱导动脉粥样硬化。通过气管滴注PM悬液模拟肺部PM暴露。采用结扎小鼠左前降支（LAD）的方法诱导心肌缺血。上述方法经过组合与优化，以更好地模拟疾病状态并提高动物存活率。该方法无需大型暴露装置或气体麻醉机，实验操作简便。该模型可用于研究空气污染中PM暴露对动脉粥样硬化及缺血性心肌病的影响，并可用于针对此类复杂因素所致疾病的新型药物研发。

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方案

本研究所涉及的所有动物实验均经中国中医科学院中药研究所动物伦理委员会批准。实验选用6至8周龄的雄性ApoE−/− 小鼠（C57BL/6背景）。

1. 实验准备

  1. 制备三溴乙醇麻醉剂（15 mg/mL）：将 0.75 g 三溴乙醇溶解于 1 mL 叔戊醇中（见材料表）。完全溶解后，用无菌生理盐水稀释至 50 mL。将溶液置于无菌容器中，4 °C 保存，避免光照。
    注意：本实验方案采用三溴乙醇，因其具有理想的麻醉恢复时间和较高的动物存活率。选择麻醉方案时，请遵循当地动物伦理委员会的建议。
  2. 制备颗粒物（PM）悬液：在 10 mL 离心管中称取 5 mg DPM（柴油颗粒物，见材料表），加入 5 mL 生理盐水，反复倒置混匀。用石蜡膜密封管口，置于超声清洗仪中进行超声破碎处理 2–3 小时（40 kHz，80 W）。
    注意：悬液应均匀，无颗粒团聚现象。使用前需充分振荡混匀。

2. 小鼠动脉粥样硬化的诱导

  1. 用高脂饮食（蛋黄粉 10%、猪油 10%、固醇 1%、维持饲料 79%，参见材料表）喂养小鼠 12 周。
  2. 为评估动脉粥样硬化进展，随机选取 2–3 只小鼠，通过超声成像或直接解剖观察检查主动脉弓是否存在斑块17。
    注意：进行解剖观察时，通过随机抽样选择动物，在麻醉后实施安乐死，随后打开胸腔，直接观察血管。由于超声成像可能无法检测到所有斑块，因此解剖观察通常更为可靠。
  3. 一旦判断动脉粥样硬化已形成，即可准备进入下一步实验操作。

3. 经口气管插管及颗粒物急性暴露

注意：在高脂饮食喂养 12 周后，每周暴露于 PM 一次，持续 4 周，同时继续给予高脂饮食。

  1. 准备一个解剖板（参见材料表），用橡皮筋固定在距顶部边缘1.5 cm处。将解剖板固定在与桌面呈60°角的位置。
  2. 通过腹腔注射三溴乙醇麻醉剂对小鼠进行麻醉（每10 g体重注射0.1 mL）。2–3分钟后，翻转小鼠以检查其是否失去翻正反射。通过夹趾实验确认麻醉状态。在眼睛上滴加无菌润滑液。
  3. 用酒精擦拭纸对解剖板进行消毒。
  4. 将麻醉后的小鼠仰卧位放置在解剖板上，并将其上门齿钩挂在橡皮筋上。
  5. 使用带有柔性管道的小型LED聚光灯（参见材料表），将光线聚焦于气管位置，该位置大约位于腋中线的中点。
  6. 将一小块无菌棉签放入小鼠口腔内，然后滚动棉签以使舌头伸出。
  7. 握住舌头并轻轻向上牵拉，使口腔、咽部和气管处于同一纵轴方向。气管入口即声门，会呈现为一个随每次呼吸开合的亮点。
  8. 持续轻柔地牵拉舌头。将套管（22 G）对准声门插入小鼠气管，套管进入气管后取出针芯。
  9. 使用移液枪吸取少量生理盐水，检测导管是否正确插入气管。如果导管位置正确，移液枪内的液柱会随着每次呼吸上下波动。
  10. 用移液枪将50 µL DPM悬液（按步骤1.2制备）滴入导管中。随着小鼠呼吸，悬液将自然吸入肺部。
    注意：为确保呼吸顺畅，建议分两次给予DPM悬液（每次25 µL），间隔10秒。
  11. 颗粒物暴露后移除宠物用留置针。将小鼠留在加热垫上，直至其恢复意识（10–20分钟），然后放回原饲养笼中。

4. 冠状动脉结扎

注意：心肌缺血建模操作（冠状动脉结扎）在第16步进行th 周

  1. 准备手术器械。高压灭菌后，将所有手术工具存放于密封的器械盒中。术前用75%酒精浸泡20–30分钟。
  2. 构建手术平台。为获得合适的平台坡度，使用细胞培养皿盖（150 mm × 25 mm）。将0-0号丝线（长度10–15 cm）对折，用胶带将线的两端固定在倾斜平台顶部，形成一个悬吊环。
  3. 按照步骤3.2所述方法对小鼠进行麻醉。
    注意：每次给予三溴乙醇之间必须间隔1周。
  4. 用酒精棉片对平台进行消毒。
  5. 将小鼠仰卧位放置于插管平台上，并将其上门齿钩挂在步骤4.2中所述的悬吊环上。用胶带固定尾巴、四肢和胡须。
  6. 术前使用脱毛膏去除左侧胸部及部分相邻右侧胸部的毛发。
  7. 按照步骤3.4–3.8所述方法对小鼠进行经口气管插管。
  8. 将宠物留置针与动物呼吸机连接（见材料表）。呼吸机设置：呼吸频率—120次/分钟；吸气/呼气比—1:1.1；潮气量—1.7 mL。
  9. 用碘伏和酒精擦拭皮肤以进行消毒。
  10. 暴露心脏。使用眼科剪在皮肤上做0.5–1 cm切口，并牵开肌肉（胸浅肌和前锯肌）以暴露肋骨。用带钩的眼科镊夹住肋骨，然后在第三肋间做一小切口（见材料表）。使用自制开胸工具建立手术操作窗。
    注意：皮肤切口位置约在剑突与腋中线连线的三分之一处。
  11. 撕开心包膜。随后可按照步骤4.11–4.14结扎LAD。
    注意：若肺叶遮挡视野，可用无菌小棉签将其推至心脏后方。
  12. 首先定位左前降支（LAD）。
  13. 使用显微血管止血钳夹持带针的无菌6-0丝线（见材料表）。将丝线穿过冠状动脉所在区域约2 mm宽的心肌组织。
    注意：不要仅尝试结扎LAD，这可能导致严重的术中出血。
  14. 在结扎线与心肌组织之间放置一段短的无菌5-0丝线，以防止组织撕裂。
  15. 紧密结扎LAD及其周围的一小束心肌组织。当左心室（LV）前壁变苍白时，视为结扎成功；若连接心电图仪，可同时观察到ST段抬高。
  16. 轻柔地排出胸腔内的空气。依次用无菌5-0丝线缝合肋间肌和皮肤。
    注意：为排出胸腔空气，应在肺扩张时关闭胸腔，并用食指和中指轻轻挤压胸廓中部，使气体从最后一针缝合处逸出。也可使用注射器抽出胸腔气体。
    注意：建议采用单纯间断缝合法，因为小鼠苏醒后可能会啃咬缝线。

5. 恢复

  1. 手术后应彻底清除所有血迹，否则小鼠可能会受到其他小鼠的攻击。
  2. 将小鼠置于侧卧位的加热垫上，持续监测小鼠体征5-20分钟，直至其从麻醉中恢复。监测时间长短取决于小鼠的身体状况。
    注意：小鼠在侧卧位时呼吸更为顺畅。
  3. 一旦翻正反射恢复，即将小鼠转移到带有食物和水瓶的清洁恢复笼中，并继续在加热垫上观察15-30分钟，以确保小鼠存活。在小鼠能够完全自主活动之前，应将其与其他小鼠隔离。
  4. 为预防伤口感染，应根据所需剂量（1,00,000-1,50,000 U/kg）肌肉注射青霉素钠。具体剂量换算请参见药品说明书。
  5. 将小鼠放回原饲养笼中，在采样前继续监测24小时。对于长期实验，需给予镇痛药物。

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结果

冠状动脉结扎后24 h处死小鼠，并在麻醉后采集血液。使用三溴乙醇对小鼠进行麻醉（参见步骤3.2），并通过眶后窦采集血样。取出心脏后，采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法检测缺血程度（图1）。正常组织中的琥珀酸脱氢酶可与TTC反应呈现红色，而缺血组织因脱氢酶活性降低而呈苍白色18。MI+PM组心脏的梗死面积大于MI组。

图2 显示了通过油红O染色在主动脉中观察到的斑块17,19。油红O可精确染色组织中的中性脂肪，如甘油三酯17。图像中的红色斑点代表斑块。AS+PM组的主动脉斑块数量多于AS组。图3 展示了前述自制的开胸工具及其使用方法。

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讨论

构建复合动物模型与单一心肌梗死模型略有不同。在复合模型的建立过程中，维持较高的存活率具有挑战性。随着高脂饮食时间的延长，ApoE−/−小鼠的动脉粥样硬化程度会逐渐加重7，小鼠体质变弱，导致死亡率升高。因此，有必要在实验过程中持续监测小鼠的健康状况，并根据实验需求调整诱导动脉粥样硬化的时间。

PM暴露可能对小鼠的存活率影响较小。但重复进行气管插管会导致小鼠口腔内出血和水肿20，这将增加后续实验的难度。因此，有必要认真练习插管操作，尽量在尽可能少的尝试次数内找到正确位置。由于本实验所需时间较长，需剪短小鼠的上门齿。在操作过程中（包括气管插管）应避免修剪小鼠的上门齿；否则，锋利的门齿可能会划伤小鼠舌头并引起出血。

LAD结扎手术会影响小鼠的存活率。本研究谨慎选择了经典且保守的胸内LAD冠状动脉结扎方法，而非“高效模型”10（一种将心脏挤出胸腔的方法），以期在术后获得更长...

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披露

作者声明无竞争性财务利益。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：81673640、81841001 和 81803814）以及中国重大新药创制科技专项（2017ZX09301012002 和 2017ZX09101002001-001-3）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,2,2-三溴乙醇Sigma-AldrichT48402
75% 酒精消毒剂
动物呼吸机上海奥尔科特生物科技有限公司ALC-V8S
棉签无菌
婴儿用棉签无菌，直径约 3 mm
培养皿Corning430597150 mm × 25 mm
柴油颗粒物美国国家标准与技术研究院1650b
解剖板尺寸约 25 × 17 cm，可用相同大小的木板替代解剖板
小鼠高脂饮食配方：蛋黄粉 10%、猪油 10%、固醇 1%、维持饲料 79%
碘伏消毒剂
LED 聚光灯5 V，3 W，带软管和夹具
医用丝线球上海医用缝合针厂有限公司-0-0
医用胶带3M1527C-0
微血管止血钳上海医疗器械（集团）有限公司外科器械厂W40350
持针器上海医疗器械（集团）有限公司外科器械厂JC32010
生理盐水
眼科剪刀上海医疗器械（集团）有限公司外科器械厂Y00040
眼科镊子，10 cm，弯曲，带钩上海医疗器械（集团）有限公司外科器械厂JD1080
眼科镊子，10 cm，弯曲，带齿上海医疗器械（集团）有限公司外科器械厂JD1060
移液器吸头AxygenT-200-Y-R-S0–200 μL
移液器eppendorf3121000074100 μL
安全别针长约 4.5 cm，用于制作开胸工具
小型动物静脉套管拜恩（苏州）医疗健康有限公司BAAN-322025静脉导管 22G × 25 mm
带缝线的缝合针上海医用缝合针厂有限公司-6-0，尼龙线
带缝线的缝合针金环医疗F5035-0
注射器1 mL
叔戊醇
体视变焦显微镜MshotMZ62

参考文献

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