动脉粥样硬化动物模型中暴露于颗粒物加重心肌缺血

摘要

本方案描述了一种复合型动物模型，通过暴露于可吸入颗粒物（PM）以加重动脉粥样硬化背景下的心肌缺血。

摘要

空气污染（尤其是颗粒物污染）引发的健康问题正受到越来越多的关注，特别是在心血管疾病患者中，其会加剧复杂病症并导致不良预后。单纯的急性心肌缺血（MI）或颗粒物（PM）暴露模型不适用于多因素疾病的此类研究。本文介绍了一种构建复合模型的方法，该模型结合了PM暴露、动脉粥样硬化和心肌缺血。ApoE^−/−小鼠接受高脂饮食喂养16周以诱导动脉粥样硬化；通过气管滴注PM标准悬液模拟PM的肺部暴露；在末次暴露后一周结扎左前降支冠状动脉。气管滴注PM可模拟急性肺部暴露，同时显著降低实验成本；结合无创气管插管与新型辅助扩张装置的经典左前降支动脉结扎术，可提高动物存活率并降低操作难度。该动物模型能够合理地模拟空气污染加重心肌梗死患者病理变化的过程，为涉及多因素疾病研究的相关动物模型构建提供参考。

引言

空气污染与高全因死亡率相关，其造成的疾病负担远超水污染、土壤污染和职业暴露的总和¹。世界卫生组织的一份报告指出，2016年全球城市和农村地区因室外空气污染导致了420万例过早死亡²。全球91%的人口生活在空气质量超过世界卫生组织指南限值的地区²。此外，细颗粒物（PM）（直径≤2.5 µm，PM_2.5）被公认为对全球公共卫生最具威胁的空气污染物³，尤其对低收入和中等收入国家城市居民的健康影响更为严重。

空气污染对心血管疾病的不良影响值得更多关注。既往研究表明，颗粒物（PM）暴露会增加心血管疾病（CVDs）的风险⁴。暴露于高浓度超细颗粒物数小时可导致心肌梗死死亡率上升。对于有心肌梗死病史的人群，暴露于超细颗粒物会显著增加复发风险⁵。此外，普遍认为颗粒物暴露会加速动脉粥样硬化的进展⁶。

在医学研究中，选择合适的动物模型至关重要。目前已有简单的动脉粥样硬化动物模型⁷、心肌缺血动物模型⁸

方案

本研究所涉及的所有动物实验均经中国中医科学院中药研究所动物伦理委员会批准。实验选用6至8周龄的雄性ApoE^−/− 小鼠（C57BL/6背景）。

1. 实验准备

1. 制备三溴乙醇麻醉剂（15 mg/mL）：将 0.75 g 三溴乙醇溶解于 1 mL 叔戊醇中（见材料表）。完全溶解后，用无菌生理盐水稀释至 50 mL。将溶液置于无菌容器中，4 °C 保存，避免光照。
   注意：本实验方案采用三溴乙醇，因其具有理想的麻醉恢复时间和较高的动物存活率。选择麻醉方案时，请遵循当地动物伦理委员会的建议。
2. 制备颗粒物（PM）悬液：在 10 mL 离心管中称取 5 mg DPM（柴油颗粒物，见材料表），加入 5 mL 生理盐水，反复倒置混匀。用石蜡膜密封管口，置于超声清洗仪中进行超声破碎处理 2–3 小时（40 kHz，80 W）。
   注意：悬液应均匀，无颗粒团聚现象。使用前需充分振荡混匀。

2. 小鼠动脉粥样硬化的诱导

1. 用高脂饮食（蛋黄粉 10%、猪油 10%、固醇 1%、维持饲料 79%，参见材料表）喂养小鼠 12 周。

结果

冠状动脉结扎后24 h处死小鼠，并在麻醉后采集血液。使用三溴乙醇对小鼠进行麻醉（参见步骤3.2），并通过眶后窦采集血样。取出心脏后，采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法检测缺血程度（图1）。正常组织中的琥珀酸脱氢酶可与TTC反应呈现红色，而缺血组织因脱氢酶活性降低而呈苍白色¹⁸。MI+PM组心脏的梗死面积大于MI组。

图2 显示了通过油红O染色在主动脉中观察到的斑块^17,19。油红O可精确染色组织中的中性脂肪，如甘油三酯¹⁷。图像中的红色斑点代表斑块。AS+PM组的主动脉斑块数量多于AS组。图3 展示了前述自制的开胸工具及其使用方法。

讨论

构建复合动物模型与单一心肌梗死模型略有不同。在复合模型的建立过程中，维持较高的存活率具有挑战性。随着高脂饮食时间的延长，ApoE^−/−小鼠的动脉粥样硬化程度会逐渐加重⁷，小鼠体质变弱，导致死亡率升高。因此，有必要在实验过程中持续监测小鼠的健康状况，并根据实验需求调整诱导动脉粥样硬化的时间。

PM暴露可能对小鼠的存活率影响较小。但重复进行气管插管会导致小鼠口腔内出血和水肿²⁰，这将增加后续实验的难度。因此，有必要认真练习插管操作，尽量在尽可能少的尝试次数内找到正确位置。由于本实验所需时间较长，需剪短小鼠的上门齿。在操作过程中（包括气管插管）应避免修剪小鼠的上门齿；否则，锋利的门齿可能会划伤小鼠舌头并引起出血。

LAD结扎手术会影响小鼠的存活率。本研究谨慎选择了经典且保守的胸内LAD冠状动脉结扎方法，而非“高效模型”¹⁰（一种将心脏挤出胸腔的方法），以期在术后获得更长.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,2,2-三溴乙醇	Sigma-Aldrich	T48402
75% 酒精消毒剂
动物呼吸机	上海奥尔科特生物科技有限公司	ALC-V8S
棉签			无菌
婴儿用棉签			无菌，直径约 3 mm
培养皿	Corning	430597	150 mm × 25 mm
柴油颗粒物	美国国家标准与技术研究院	1650b
解剖板			尺寸约 25 × 17 cm，可用相同大小的木板替代解剖板
小鼠高脂饮食			配方：蛋黄粉 10%、猪油 10%、固醇 1%、维持饲料 79%
碘伏消毒剂
LED 聚光灯			5 V，3 W，带软管和夹具
医用丝线球	上海医用缝合针厂有限公司	-	0-0
医用胶带	3M	1527C-0
微血管止血钳	上海医疗器械（集团）有限公司外科器械厂	W40350
持针器	上海医疗器械（集团）有限公司外科器械厂	JC32010
生理盐水
眼科剪刀	上海医疗器械（集团）有限公司外科器械厂	Y00040
眼科镊子，10 cm，弯曲，带钩	上海医疗器械（集团）有限公司外科器械厂	JD1080
眼科镊子，10 cm，弯曲，带齿	上海医疗器械（集团）有限公司外科器械厂	JD1060
移液器吸头	Axygen	T-200-Y-R-S	0–200 μL
移液器	eppendorf	3121000074	100 μL
安全别针			长约 4.5 cm，用于制作开胸工具
小型动物静脉套管	拜恩（苏州）医疗健康有限公司	BAAN-322025	静脉导管 22G × 25 mm
带缝线的缝合针	上海医用缝合针厂有限公司	-	6-0，尼龙线
带缝线的缝合针	金环医疗	F503	5-0
注射器			1 mL
叔戊醇
体视变焦显微镜	Mshot	MZ62