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方法文章

一种用于鉴定黑色素瘤转移新介质的可靠发现平台

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DOI：

10.3791/63186

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2022年3月8日

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1Department of Pathology, NYU Grossman School of Medicine, 2Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group, Perlmutter Cancer Center, 3Department of Radiology, NYU Grossman School of Medicine, 4Preclinical Imaging Core, NYU Grossman School of Medicine, 5Ronald Perelman Department of Dermatology, NYU Grossman School of Medicine

本文内容

摘要

本文描述了一套用于检测黑色素瘤转移新型候选介质及其作用机制的技术流程。

摘要

转移是一个复杂的过程，需要细胞克服一些仅被部分模拟的屏障 体外 检测。采用可靠且可重复的系统化工作流程 体内 模型和标准化方法用于鉴定黑色素瘤转移过程中的新参与者。该方法可在特定实验阶段进行数据推断，从而精确表征基因在转移中的作用。通过将遗传修饰的黑色素瘤细胞经心内、皮内或皮下注射至小鼠体内建立模型，随后通过连续监测 体内 成像。当达到预设的实验终点时，采集原发肿瘤和/或携带转移灶的器官，并进行多种分析。肿瘤细胞可经分选后用于多种组学平台分析，包括单细胞RNA测序。器官组织可进行成像及免疫组织病理学分析，以量化转移负荷并定位转移灶的具体解剖位置。该优化流程包含标准化的移植、监测、组织采集、处理与分析方案，适用于来源于患者的短期培养物，以及多种实体瘤类型的已建立人源和小鼠细胞系。

引言

转移性黑色素瘤的高死亡率，加上全球黑色素瘤发病率不断上升1（预计到2025年将增加7.86%），迫切需要新的治疗方法。靶点发现的进展依赖于可重复的转移模型，而转移是一个高度复杂的过程。在转移级联的各个阶段，黑色素瘤细胞必须克服无数障碍，才能实现免疫逃逸并在远端组织中定植2。黑色素瘤细胞的强韧性和适应性源于多种因素，包括其较高的遗传突变负荷3及其神经嵴起源，这些特性赋予其关键的表型可塑性3,4,5。在每一个步骤中，转录程序使转移中的黑色素瘤细胞能够根据与微环境之间相互作用的信号，从一种状态切换到另一种状态，该微环境包括免疫系统6、细胞外环境7,8以及它们所接触的物理屏障的细胞结构9。例如，黑色素瘤细胞通过下调关键的免疫启动性肿瘤分泌因子的表达，从而逃避免疫监视6。

研究描述了一种"转移前微环境"，其中黑色素瘤细胞分泌趋化因子和细胞因子，以启动远处的"靶器官"，为转移做准备10。这些发现引出了关于转移性黑色素瘤细胞的器官趋向性及其到达远端组织的解剖路径的重要问题。在侵入血管后，黑色素瘤细胞已知可通过淋巴管（淋巴转移）和血管（血行转移）进行转移2,11。尽管大多数患者表现为局限性疾病，但有少数病例表现为远处转移而无淋巴系统扩散（淋巴结未受累）11，提示黑色素瘤存在其他转移途径。

当黑色素瘤细胞定植于转移部位时，会经历表观遗传和代谢适应12,13为进入并侵入新的组织区域，黑色素瘤细胞利用蛋白酶14 细胞骨架修饰11,15，使其能够迁移至新位置并生长。靶向黑色素瘤细胞的难点在于这些适应机制的复杂性和多样性；因此，该领域应致力于在实验中尽可能重现多个步骤和适应过程。尽管已有诸多进展 体外 类器官和三维培养等检测方法16,17，这些模型只能不完全地再现 体内 转移级联

小鼠模型在可重复性、技术可行性以及模拟人类疾病之间取得了良好平衡，因而展现出重要价值。将来源于患者来源的异种移植瘤或短期培养物的黑色素瘤细胞通过血管内、原位或异位途径植入免疫缺陷小鼠或人源化小鼠，构成了转移性黑色素瘤靶点发现的主要研究基础。然而，这些系统通常缺乏对转移过程一个关键的生物学限制因素：免疫系统。具有这一限制条件的同源性黑色素瘤转移模型在该领域中相对稀少。这些在免疫健全小鼠中建立的系统，包括B16-F1018、YUMM 细胞系家族19、SM120、D4M321、RIM322，以及近期开发的RMS23和M1（Mel114433）、M3（HCmel1274）、M4（B2905）24黑色素瘤细胞系，有助于深入研究宿主免疫反应在黑色素瘤进展中的复杂作用。

此处介绍了一种用于黑色素瘤转移靶点鉴定的分析流程。随着从黑色素瘤患者队列中产生越来越多且规模更大的组学数据，我们推测，最具临床前景的研究源于大数据整合，进而推动对潜在靶点进行精细的功能验证与机制解析。25,26,27,28通过使用小鼠模型研究转移过程中的潜在靶点，可以充分考虑 体内-特定事件及组织相互作用，从而提高临床转化的可能性。文中概述了多种量化转移负荷的方法，可为任何特定实验的结果提供互补数据。此外，描述了一种从多种器官的肿瘤中分离单细胞的方案，以促进对转移性细胞基因表达进行无偏倚的表征，该步骤可为后续的单细胞或批量RNA测序提供支持。

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方案

注意：以下方案中涉及的动物实验程序已获得纽约大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。所有操作均在经国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中进行。图1展示了总体实验流程。

1. 患者来源的黑色素瘤短期培养物（STCs）

  1. 将组织置于含1 mL完全RPMI培养基（RPMI 1640，添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、1× MEM非必需氨基酸溶液以及青霉素（100 IU/mL）/链霉素（100 µg/mL））的60 mm培养皿中。
    注意：如有需要，可在显微镜下使用无菌外科器械在培养皿中解剖并去除肿瘤周围的组织，以增加肿瘤细胞的比例。
  2. 使用无菌剃刀将新鲜组织切成1-2 mm的组织块。加入4 mL完全RPMI培养基，用10 mL血清移液管将培养板中的内容物轻轻吹打5-10次。
  3. 将细胞悬液转移至15 mL聚丙烯圆锥形离心管中，离心沉淀细胞（180 × g 在4 °C下离心5分钟。吸去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL新鲜培养基中，然后将悬液转移至25 cm²培养瓶中。2 组织培养瓶
  4. 为帮助组织碎片贴附到底部，将培养瓶倾斜置于37 °C、5% CO₂的组织培养孵育箱中，倾斜角度为20°–30°2 20分钟。
  5. 将培养瓶平放，使培养基覆盖组织，并每日观察培养状态。当细胞融合度达到90-100%时进行传代。短期培养应保持在较低的传代次数。
    注意：STCs 将在细胞分离和培养后约 2 个月建立，但实际时间因样本和肿瘤类型而异。经过 10 至 14 代传代培养后，细胞系达到 100% 纯度，仅含有黑色素瘤细胞29传代次数的阈值是通过观察细胞形态、倍增时间及行为的变化经验性确定的 体内为保持原发肿瘤的异质性及其他特性，细胞传代比例不应超过1:5。
  6. 在建立STC后，以及在将任何细胞系模型注入动物之前（如后续步骤所述），用报告基因转导细胞。
    注意：荧光标签（例如，红色荧光蛋白（RFP）、绿色荧光蛋白（GFP）），例如，可实现 离体 免疫荧光成像及通过荧光激活细胞分选（FACS）对肿瘤细胞进行分选。荧光素酶可实现 体内 生物发光成像，一种用于监测实验进程的有用工具（第4节）。

Integration of patient datasets diagram; LOF/GOF models; in vivo experiments; omics, histo, immuno.
图1：示意图展示了从患者数据整合到生成与分析的所述工作流程 体内 来自小鼠的数据 缩写：LOF = 功能缺失；GOF = 功能获得。 请点击此处以查看此图的放大版本。

2. 异种移植植入

注意：此处描述的实验操作在先天性和适应性免疫系统受损的小鼠 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 中进行；或仅缺乏适应性免疫的小鼠中进行，例如T细胞缺陷型无胸腺裸鼠（athymic/nude, NU/J）。实验动物为雄性，8至10周龄。雌性小鼠在经心内注射肿瘤细胞后常出现较高的性腺转移发生率，从而降低其存活率。

  1. 进行皮下和皮内注射时，将悬浮于1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中的细胞与等体积解冻的细胞外基质底物（EMS）混合，制备成1:1的细胞悬液，并置于冰上4 °C保存。进行血管内注射（心内、颈动脉、眶后、尾静脉或脾脏注射）时，仅将细胞悬浮于DPBS中。
    注意：皮内注射的合适体积应尽可能低（30 µL）。皮下注射的注射体积可高达150 µL，血管内注射则可达250 µL（根据动物体重调整）。根据注射量和所用注射器的死腔体积（包括滑动接头和针头内部的死腔），在最终细胞悬液中额外增加10–30%的注射液体积（例如，使用30 G、25 mm针头的1 mL结核菌素注射器，其死腔体积为100 µL）。
  2. 开展预实验以表征所用细胞系在体内的行为及肿瘤进展的时间线。in vivo。对于皮内注射，起始注射量为每30 µL含1,000至50,000个细胞。对于皮下注射，起始注射量为每150 µL含10,000至2 × 106个细胞。对于血管内注射（心内、颈动脉、眶后及脾脏注射），起始注射量为每150 µL含50,000个细胞。
    注意：血管内注射易导致动物发生栓塞事件，原因可能是将空气引入循环系统，或使用过多细胞堵塞小血管。充分混匀细胞悬液以避免细胞聚集。在装载细胞悬液前需预充注射器。清除注射器内的所有气泡。在装载和注射前，将细胞悬液和注射器保持在冰上。
  3. 通过吸入法实施麻醉。将氧气流量调节器设置在1–2 L/min。将动物放入诱导室，异氟烷蒸发器设置为诱导阶段2.5–5%，维持阶段1.5–3%。
    注意：在麻醉诱导阶段需监测动物的呼吸和心率。切勿让动物无人看管。切勿同时监测多只动物。根据动物体重调整麻醉剂量。
  4. 将动物从诱导室转移至鼻罩。在动物眼睛上涂抹无菌凡士林眼膏，以防止手术过程中角膜干燥。
  5. 使用倾斜30°角的直剃刀片剃除手术区域毛发。用70%异丙醇棉签清洁手术区域皮肤。在进行后续任何步骤前，通过足底反射评估麻醉深度是否足够。
  6. 对于皮内注射，整个操作应在生物安全柜内进行，以维持无菌条件。
    1. 按照步骤2.3–2.5所述对动物实施麻醉并剃毛。
    2. 逆针刺方向向后牵拉皮肤。使用31 G、6 mm长的胰岛素注射器针头，以锐角持针，针尖斜面朝上，轻柔刺入皮肤。
    3. 感受针尖处的压力释放。轻柔推进，确保针头停留在真皮层内，不穿透整个皮肤深度进入皮下组织。关键：若针头滑入皮下空间，应拔出针头，更换注射部位并重新进针。缓慢注入全部体积（30 µL）的细胞悬液，直至观察到穹顶状风团。
      注意：较低的注射体积可减少皮肤层的分离和结构变形。
    4. 保持针头在位，默数至5。
      注意：EMS在体温下变得黏稠，有助于防止液体经针孔反流。
    5. 拔出针头，将动物单独饲养于带有温热垫的笼中恢复。待动物恢复意识、能够保持胸卧位并自主行走后，将其送回动物房笼具。
      注意：在整个本方案所述操作过程中持续监测动物。切勿让动物无人看管，或同时监测多只动物。
    6. 在肿瘤生长初期每日联合兽医人员监测肿瘤生长进展、体重减轻及整体健康状况，若动物开始减重则需加强监测。监测期间：称量动物体重并绘制图表以跟踪体重变化，检查肿瘤溃疡、神经、运动和/或行为异常（嗜睡、缺乏理毛、食物或饮水摄入减少）的迹象。
      注意：一旦观察到晚期疾病迹象（体重减轻超过20%、体况评分<2、活动水平极度下降、瘫痪或癫痫发作），应立即实施安乐死。采用机构IACUC批准的安乐死方法（例如，使用自动台式CO2舱将动物暴露于CO2中15分钟，随后采用二次安乐死方法，如颈椎脱位、断头或双侧切开肋骨引发气胸）。
    7. 使用游标卡尺测量肿瘤的长（L）和宽（W），代入以下公式计算体积（V）：
      体积公式，V=(W²×L)/2，用于计算体积测量值的方程。
  7. 对于皮下注射：
    1. 整个操作应在生物安全柜内进行，以维持无菌条件26,27。
    2. 按照步骤2.3–2.5所述对动物实施麻醉并剃毛。
    3. 使用28 G至31 G、6 mm长的胰岛素注射器针头，以锐角持针，针尖斜面朝上，轻柔刺入皮肤。在穿过表皮、真皮和皮下组织时，感受针尖处两次压力释放。
      注意：第二次感受到针尖压力释放表明已到达皮下腔隙。
    4. 缓慢注入全部体积（30–150 µL）的细胞悬液，直至观察到椭圆形风团。保持针头在位，默数至5；对于较大体积（超过50 µL），默数至10。
      注意：EMS在体温下变得黏稠，有助于防止液体经针孔反流。
    5. 拔出针头，将动物单独饲养于带有温热垫的笼中恢复。待动物恢复意识、能够保持胸卧位并自主行走后，将其送回动物房笼具。
      注意：术后监测期间，观察是否有并发症迹象（呼吸频率低、出血、恢复缓慢），并适当处理。若无改善，按步骤2.6.6注释中描述的人道安乐死程序进行。
    6. 按照步骤2.6.6–2.6.7所述监测动物的肿瘤生长、体重减轻及整体健康状况。
  8. 对于心内注射：
    1. 整个操作应在生物安全柜内进行，以维持无菌条件26,30。
    2. 按照步骤2.3–2.4所述对动物实施麻醉。
    3. 将动物转移至超声机的加热平台，并用低致敏胶带将其固定在鼻罩上。
    4. 使用倾斜30°角的直剃刀片剃除胸部毛发。用10%聚维酮碘溶液擦拭3次，交替使用异丙醇擦拭3次，清洁手术区域皮肤。
    5. 在进行后续任何步骤前，通过足底反射评估麻醉深度是否足够。在手术区域涂抹超声耦合剂。
    6. 使用超声探头获取心脏窗口图像。将探头置于动物左侧胸中部，获得水平切面，以显示左心室的横截面（短轴）。确保探头长轴向上，将探头固定在50°角，加热平台固定在20°角。锁定探头及支撑架位置。
    7. 在生物安全柜内，使用30 G、25 mm针头的1 mL结核菌素注射器抽取细胞悬液。清除注射器内所有气泡。
      注意：在细胞处理和注射过程中，保持单细胞悬液状态至关重要。清除气泡是避免空气栓塞的重要步骤。充分预充的注射器-针头系统可防止实验组动物发生可避免的死亡。抽吸时始终吸入比实际注射量更多的液体，多余液体可用于将部分细胞悬液回注至1.5 mL离心管中以排除空气。
    8. 将注射器固定在立体定位注射仪上。在超声引导下，将针头穿过胸壁进入心脏左心室。缓慢注入全部体积（100–250 µL）的细胞悬液。
    9. 拔出针头，将动物单独饲养于带有温热垫的笼中恢复。待动物恢复意识、能够保持胸卧位并自主行走后，将其送回动物房笼具。按照步骤2.6.6所述监测动物的肿瘤生长、体重减轻及整体健康状况。
  9. 对于颈动脉注射：
    1. 整个操作应在适当消毒的表面上进行，以维持无菌条件30。
    2. 使用胰岛素注射器和28 G针头，通过腹腔注射给予氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合麻醉剂对动物实施麻醉。在动物眼睛上涂抹无菌凡士林眼膏，以防止手术过程中角膜干燥。
    3. 使用倾斜30°角的直剃刀片剃除手术区域毛发。在进行后续任何步骤前，通过足底反射评估麻醉深度是否足够。
    4. 将动物置于加热垫上的体视显微镜下。用10%聚维酮碘溶液擦拭3次，交替使用异丙醇擦拭3次，清洁手术区域皮肤。
    5. 穿戴无菌个人防护装备（PPE）和无菌手套。在动物体表铺无菌巾，建立无菌区域。
      注意：若无菌巾无适合切口大小和位置的孔洞，可将无菌巾对折，使用Metzenbaum剪刀在其中央剪出合适大小的孔。
    6. 使用手术刀或虹膜剪从颈部中线下方至胸骨处切开皮肤。用两把显微外科镊子钝性分离中线平面的两个下颌下唾液腺。必要时使用电凝止血。
    7. 从胸骨柄向分叉处解剖颈总动脉（CCA）周围的筋膜，并继续向内侧分离，以游离出颈外动脉的后壁。注射前暂时夹闭颈外动脉（ECA）。
      注意：在解剖CCA周围时，需小心避免损伤迷走神经（位于动脉外侧）。
    8. 使用33 G、15 mm针头的1 mL注射器装载细胞悬液。
    9. 在CCA下方穿过两根7-0结扎线，分别为两根结扎线打松结。使用5 mm、10 G压力血管夹暂时夹闭ECA。结扎近端结扎线，然后松松结扎远端结扎线（靠近CCA分叉处）。稍后使用远端环控制注射后的出血。
    10. 使用33 G、15 mm针头的注射器，以锐角进针，针尖斜面朝上，轻柔刺入CCA。缓慢注入全部体积（50–150 µL）的细胞悬液。
    11. 用镊子夹住远端环，在拔出针头时提起以闭塞CCA管腔并止血。更换为#7珠宝镊并收紧远端环。
    12. 在远端结扎线上再打一个器械结，移除ECA上的血管夹。控制手术区域出血，关闭前对任何出血血管进行电凝。使用9 mm缝合器关闭动物皮肤，并将动物置于温热垫上恢复。
      注意：术后7–10天拆除缝合钉。
    13. 术后72小时内每12小时皮下注射一次镇痛药——丁丙诺啡（0.3 mg/mL），剂量为0.1 mg/kg。
      注意：也可考虑使用缓释型镇痛药，每72小时给药一次。
    14. 待动物恢复意识、能够保持胸卧位并自主行走后，将其送回动物房笼具。术后每日监测动物手术部位感染或疼痛迹象、整体健康状况及并发症。
      注意：若动物在存活手术后恢复不佳，可追加镇痛药剂量；若术后72小时内未完全恢复，应实施人道安乐死。
    15. 按照步骤2.6.6所述监测动物的肿瘤生长、体重减轻及整体健康状况。
  10. 对于眶后注射：
    注意：当操作者经过培训并熟练掌握该技术，且具有充分科学依据时，可将此技术作为尾静脉注射的替代方法。通过此途径递送的细胞悬液可能在眶后空间诱导肿瘤生长；因此，选择该技术时应仔细权衡风险与收益。例如，当其他注射途径未能成功形成脑肿瘤时，可选择此方法，以利用眶后静脉窦与颅内静脉通过吻合支建立的直接循环连接。
    1. 整个操作应在生物安全柜内进行，以维持无菌条件。穿戴无菌PPE和手套。
    2. 按照步骤2.3–2.4所述对动物实施麻醉。
      注意：本操作中切勿在动物眼睛上涂抹无菌凡士林眼膏，因其会阻碍注射；仅使用局部麻醉滴眼液。
    3. 使用28–31 G、6 mm针头的胰岛素注射器装载细胞悬液。
    4. 将动物置于俯卧位，牵拉眼睑使眼球突出。在手术侧眼球滴入一滴局部麻醉剂。
    5. 以30–45°角将针头插入眼球与内眦之间，针尖斜面朝下。缓慢注入细胞悬液（10–150 µL）。
      注意：缓慢操作可防止损伤眼球及注射液反流。
    6. 执行步骤2.7.5–2.7.6所述操作。
  11. 对于脾脏注射：
    1. 整个操作应在生物安全柜内进行，以维持无菌条件31。穿戴无菌PPE和无菌手套。
    2. 按照步骤2.3–2.5所述对动物实施麻醉并剃毛。
    3. 将动物置于右侧卧位。用10%聚维酮碘溶液擦拭3次，交替使用异丙醇擦拭3次，清洁手术区域皮肤，并按步骤2.9.5所述准备手术区域。
    4. 使用Metzenbaum剪刀或手术刀，在腹壁左侧 flank 处做1 cm切口，随后切开腹膜。
      注意：皮肤切开后，可通过半透明的腹壁看到脾脏。腹膜切口应精确位于该位置。
    5. 通过切口暴露脾脏及脾门。使用28–31 G、6 mm长的胰岛素注射器针头，以锐角进针，针尖斜面朝上，轻柔刺入脾脏。
      注意：若穿刺部位出血，应电凝止血以减少出血和反流。
    6. 缓慢注入全部体积（50–100 µL）的细胞悬液。拔出针头。在脾脏上放置一小块纱布，用镊子施加压力。用精细蚊式钳轻轻夹住纱布中的脾脏，等待15分钟。
    7. 通过用3-0或4-0丝线结扎脾门进行脾切除术，必要时电凝血管。使用5-0聚二氧杂环己酮（PDS）或聚乙醇酸可吸收缝线缝合腹膜。
    8. 执行步骤2.7.5–2.7.6所述操作。
      注意：术后72小时内出现出血并发症或未完全恢复的动物应实施人道安乐死。请始终牢记，小鼠的福祉始终是首要考虑因素。

3. 分期存活手术（SSS）

  1. 根据步骤 2.2 的实验结论，确定进行存活手术的合适时间。根据细胞系和实验假设，选择较早时间点进行肿瘤切除（肿瘤体积 = 150 mm3）或较晚时间点（肿瘤体积 = 500 mm3）26。
    注意：当肿瘤负荷已高到足以损害动物健康并易引发并发症时，肿瘤体积上限为 1,500 mm3。
  2. 按照步骤 2.3–2.5 所述方法对动物进行麻醉和剃毛。
    注意：整个操作在生物安全柜内进行。
  3. 使用 10% 聚维酮碘溶液擦拭手术区域皮肤 3 次，每次交替使用异丙醇擦拭 3 次，按步骤 2.9.5 所述准备手术区域。
  4. 使用虹膜剪或手术刀切开皮肤，切缘距离肿瘤边缘保持 5–7 mm 的切除范围。
    注意：切除范围取决于肿瘤局部扩散的能力。对于侵袭性强的肿瘤，应扩大切除范围，同时确保留有足够的皮肤以完成伤口闭合。
  5. 对于皮内肿瘤，应将肿瘤连同周围环周皮肤一并切除。
  6. 对于皮下肿瘤，应在皮肤下分离并切除肿瘤。
    注意：若肿瘤侵犯腹膜和/或皮肤，应将肿瘤与受累组织整块（en bloc）切除，并使用 5-0/4-0 PDS 或聚乙醇酸可吸收缝线缝合腹膜。
  7. 使用 9 mm 吻合器关闭伤口。
    注意：术后 7–10 天拆除吻合钉。术后给予镇痛药物，并将动物置于加热垫上恢复。术后 72 小时内每 12 小时给予一次镇痛药物，具体操作参照步骤 2.9.13。若动物出现出血并发症或术后未完全恢复意识，应实施人道安乐死。
  8. 将动物单独饲养于笼中，置于加热垫上恢复。待动物恢复意识并能维持胸卧位和自主活动后，将其送回动物房笼具中。
  9. 术后继续监测动物是否出现局部复发、体重减轻、神经学、运动功能和/或行为异常（如嗜睡、缺乏理毛行为、摄食或饮水减少）以及整体健康状况。

4. 体内 成像（图2A)

  1. 使用1 mL胰岛素注射器（28 G针头）通过腹腔注射给予动物D-荧光素底物（150 mg/kg）。
    注意：肿瘤细胞必须通过慢病毒转导稳定表达荧光素酶cDNA。
  2. 在D-荧光素底物注射后6分钟，按照步骤2.3-2.4所述诱导麻醉。
  3. 使用生物发光成像（BLI）扫描仪进行成像体内 成像系统26.
  4. 将动物移入成像室并插入鼻罩中。根据成像系统的容量，可同时对最多5只动物进行成像。
  5. 按下按钮启动仪器 初始化. 将曝光时间设置为 自动 （1-120 秒）。
  6. 如有需要，拍摄一张空白图像以扣除背景。点击 获取 采集序列完成后保存图像。
  7. 将动物放回笼中，笼子底部50%的面积置于加热垫上，以助其从麻醉中恢复。待动物恢复意识，能够保持胸卧位并自主行走后，将其送回动物房笼具中。
  8. 用于相同数据的分析 体内 使用采集图像的成像软件，导航至图像保存的文件夹，并一次性打开与该实验相关的所有小鼠的图像。
    注意：一次仅分析单张图像将无法实现组间归一化。
  9. 设置单位为 辐射度 （不 计数）。确保选中指示的复选框 个体 是 未检查，因为这将导致无法对各组间的信号进行标准化处理。
  10. 使用 感兴趣区域（ROI） 绘图工具，为脑区绘制圆形感兴趣区域（ROI），为身体绘制矩形感兴趣区域。注意排除耳部和鼻部，因其易产生非特异性发光。为减少该过程中的偏差，仅根据小鼠照片绘制感兴趣区域，不叠加发光信号。
  11. 选择 测量感兴趣区域 量化信号并将数据导出至电子表格。通过绘制总发光通量（p/sec/cm）来分析组间差异。2/sr) 在感兴趣的身体区域。
    注意：为特异性评估各组间脑嗜性差异，需计算每只小鼠脑信号与全身信号的比值。此方法可校正小鼠间总体肿瘤负荷的差异，以及实验组间荧光素酶表达水平的不同。

5. 离体 磁共振成像

  1. 执行 离体 安乐死后立即进行磁共振成像。或者，取下目标器官，在福尔马林中固定不超过72小时，于后续时间点进行成像。
  2. 使用配备核磁共振控制台和零挥发水平孔径磁体或类似设备的7特斯拉（7-T）（300兆赫）微型磁共振成像系统采集图像。
    注意：必须使用主动屏蔽的梯度线圈插件，并在性能上实现适当的权衡。该插件需在至少50 mm的动态球形体积（DSV）范围内提供良好的梯度线性度，以覆盖同时检测的样本集合，且不产生几何畸变。梯度强度（范围为440至750 mT/m）与占空比的组合，应支持最大同时直流电流在3 × 30 A至3 × 87 A之间，以实现足够的成像性能。所使用的梯度线圈插件（见 材料表) 可实现以下性能参数：660 mT/m 梯度强度，130 µs 上升时间，3 × 87 A 电流，DSV = 80 mm。
  3. 使用商用发射-接收圆极化全鼠体射频线圈（外径 = 59 mm，内径 = 38 mm，长度 = 40 mm），调谐至 300.16 MHz，进行扫描，该 1氢质子拉莫尔频率
    注意：该射频探头能够以亚毫米各向同性分辨率获取三维数据集（<150 µm）在持续8-12小时的过夜扫描期间。
  4. 使用多种序列检测肿瘤负荷30.
    注意：T加权成像中检测到的高信号2-加权的快速自旋回波成像序列（RARE）可识别肿瘤周围的水肿。
  5. 使用以下采集参数执行3D RARE序列：[120 µm]3 各向同性分辨率；采集时间 5 小时 27 分钟；重复时间（TR）= 500 ms；回波间隔（ES）= 12.7 分钟；Turbo 因子 TFx = 12；有效回波时间（TE）eff）= 76.2 毫秒；带宽（BW）= 75 千赫兹；矩阵大小 = 2843；视野（FOV）= [4.0 mm]3；平均次数（Nav）= 6。
  6. 使用以下参数检测转移灶。
    1. 对于有信号增强的色素性转移灶，使用T1-加权三维梯度回波序列，参数如下：[120 µm]3 各向同性分辨率；采集时间 2 小时 41 分钟；TR = 20 ms；回波时间（TE）= 4.0 ms；翻转角（FA）= 18°；带宽（BW）= 75 kHz；矩阵大小 = 2843；视场（FOV）= [34.0 mm]3；Nav = 6。
    2. 对于无色素和/或出血性转移灶，在T加权成像时应采用低信号2*-加权，多梯度回波（MGE）序列（3D MGE，[120 µm]3 各向同性分辨率；采集时间 3 小时 35 分钟；TR = 40 ms；TE = 3.6 ms；ES = 3.2 ms；4 个回波；FA = 20°；BW = 100 kHz；矩阵大小 = 2843；视野 = (34.0 mm)3；Nav = 4。
  7. 使用全部3个序列来量化肿瘤负荷。
  8. 将分析过程中确定的肿瘤区域与组织学切片进行比对，以确保准确性。参见第7和第8节。

6. 单细胞或批量 RNA 测序的组织处理

  1. 采用机构IACUC批准的任何方法对动物实施安乐死。参见步骤2.6.6注释中描述的其中一种操作程序。
  2. 解剖目标器官，并将其分别置于含有冰上预冷的Hank's平衡盐溶液（HBSS）的培养板孔中。操作应迅速，并始终将组织保持在冰上，以最大程度维持细胞活性。
    注：以下步骤专用于脑组织处理。根据具体需求调整胶原酶类型。
  3. 在6孔板中每孔加入3 mL HBSS。
  4. 使用荧光显微镜观察并进一步指导解剖，识别标记区域。
  5. 解剖荧光标记区域，并将组织碎片放入6孔板中（若需单独分析各个转移灶，则每孔放置一个碎片；若需分析同一器官内的多个转移灶，则可将多个碎片放入同一孔中）。使用无菌剃刀片将组织尽可能切碎（每个样本此步骤耗时不超过1-2分钟）。
    注：限制肿瘤处理时间有助于保持细胞活性。
  6. 吸出各孔内容物并转移至15 mL锥形离心管中。
    注：可剪去1,000 µL移液器吸头尖端，以便转移较大组织碎片。
  7. 向每孔中加入1 mL HBSS，确保残留的组织碎片/细胞均转移至15 mL离心管中，最终体积为4 mL。向每管中加入50 µL I型胶原酶（40 mg/mL）和12.5 µL DNase I（2,000单位/mL）。
  8. 将锥形管置于37 °C水浴中孵育45分钟，每隔5分钟短暂涡旋混匀一次。
  9. 用HBSS预湿70 µm细胞筛。使用无菌微量离心管的管帽末端或注射器活塞的塑料部分，将组织匀浆通过70 µm细胞筛过滤至新的50 mL锥形管中。
    注：使用HBSS或FACS缓冲液预湿细胞筛有助于提高过滤效率。
  10. 用1 mL HBSS冲洗细胞筛。用HBSS预湿40 µm细胞筛，将每个样本再次通过40 µm细胞筛过滤至新的50 mL锥形管中。向40 µm细胞筛中加入1 mL FBS进行冲洗。所有锥形管始终置于冰上。
  11. 用预冷的DPBS将锥形管补至50 mL。离心收集细胞（4 °C下180 × g离心10分钟）。弃去上清液，注意避免丢失细胞沉淀。
    注：对于脑组织样本，将细胞重悬于2.5 mL 38%密度分离液中（用HBSS稀释，室温（RT）保存），转移至5 mL FACS管中，800 × g离心20分钟。剪去1,000 µL移液器吸头尖端，小心去除上层脂肪层，确保管壁无残留脂肪。如有脂肪残留，需再次离心并重复该步骤。此为关键步骤。随后去除其余液相（沉淀呈半透明状，不易观察）。
  12. 将细胞重悬于1 mL红细胞（RBC）裂解缓冲液中，室温孵育60秒。加入20 mL DPBS终止裂解反应。
  13. 在4 °C下以180 × g离心10分钟，弃去上清液，将细胞重悬于2 mL FACS缓冲液（含5% FBS的DPBS）中。
  14. 继续进行标记细胞分选，和/或进行整体或单细胞RNA测序文库构建。
    注：用于整体RNA测序时，细胞可离心后立即速冻，并于-80 °C保存，待后续进行RNA提取。

7. 动物组织灌注及免疫组织学分析前处理

  1. 使用胰岛素注射器和28 G针头，通过腹腔注射过量的氯胺酮（300 mg/kg）和赛拉嗪（30 mg/kg）混合物使动物麻醉。
  2. 通过大体解剖暴露心脏，并在右心房做一切口。用长弯镊子轻轻固定心脏，镊尖朝向前方。
    注意：甲醛和多聚甲醛（PFA）为致癌物。请阅读安全数据表（SDS），避免接触其蒸气，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
  3. 使用带有22 G、22 mm针头的10 mL注射器，向左心室注射10 mL DPBS，随后注射10 mL 4% PFA。
  4. 继续采集器官并将其放入预先标记的组织学包埋盒中。将包埋盒置于大小合适的容器内，加入足量固定液（甲醛）以完全覆盖组织。
    注意：理想情况下，固定液体积应为组织体积的5–10倍。
  5. 将组织学包埋盒中的器官在10%甲醛中固定48–72小时。弃去10%甲醛，并用1× DPBS将包埋盒清洗两次。
  6. 开始脱水过程：先将包埋盒浸入70%乙醇中2小时，随后依次浸入浓度递增的乙醇溶液中：80%、95%、100%，每种浓度各1小时。100%乙醇溶液每1.5小时更换一次，共更换两次。再将包埋盒浸入二甲苯中1.5小时，并更换溶液三次。
  7. 在58–60 °C条件下将包埋盒包埋于石蜡中。对石蜡块进行切片。随后进行苏木精-伊红（H&E）染色或免疫组织化学染色。
  8. 为识别黑色素瘤细胞，可使用以下任一标志物或组合：S100、Melan-A、HMB-45、酪氨酸酶、MITF。在条件允许时，建议使用核有丝分裂器蛋白（NuMA）染色，因其是高度特异的人源细胞标志物。
    注意：NuMA染色可清晰区分宿主细胞（小鼠）与移植细胞（人源），有助于图像处理及后续的肿瘤定量分析。

动物成像与组织学结果；荧光与组织分析；肿瘤生长比较。
图 2：BLI、明场、ex vivo 荧光及 H&E 染色图像示例，展示多角度分析候选基因在黑色素瘤转移中作用的方法。（A）BLI，（B）明场，（C）ex vivo 荧光，以及（D）H&E 染色图像。用于说明目的的图像来自一项实验，该实验将转导了非靶向对照 shRNA（shNTC）或靶向 FUT8 的 shRNA 的 131/6-4L 黑色素瘤细胞注射入免疫缺陷（NSG）小鼠体内。FUT8 沉默抑制了黑色素瘤细胞的转移扩散。比例尺和颜色条 = p/sec/cm2/sr × 106（A），100 mm（B、C），100 µm（D）。缩写：BLI = 生物发光成像；H&E = 苏木精和伊红；shRNA = 短发夹 RNA；shNTC = 非靶向对照 shRNA；NSG = 非肥胖糖尿病重度联合免疫缺陷 gamma；FUT8 = 岩藻糖基转移酶 8；BF = 明场。请点击此处查看此图的放大版本。

8. 核有丝分裂器蛋白（NuMA）染色（图3）

  1. 使用抗NuMA抗体作为高度人源特异性的有丝分裂纺锤体标记物，用于组织切片中转移负荷的鉴定与定量。8.1. 实现了对黑色素瘤细胞的高度特异性和高灵敏度鉴定。
  2. 若在自动免疫染色仪器上进行NuMA的显色免疫组织化学染色，请按如下所述步骤操作32:
  3. 将切片置于二甲苯中脱蜡，并依次用浓度递减的乙醇进行水化。将载玻片在二甲苯中浸泡15分钟，随后转移至100%乙醇中继续浸泡15分钟。
    注意：后续的乙醇复水步骤（95%、80%、75%）每次持续3至5分钟。
  4. 用去离子水冲洗载玻片。
  5. 通过将载玻片浸入容器（例如, 在1200瓦微波炉中，使用10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）于Coplin染色缸内加热处理10分钟。
  6. 使用未标记的兔源多克隆抗人 NuMA 抗体进行标记，按 1:7,000 比例稀释于 Tris-牛血清白蛋白（BSA）缓冲液（25 mM Tris，15 mM NaCl，1% BSA，pH 7.2）中。在实验切片染色的同时，平行运行相应的阳性与阴性对照。
  7. 将切片与一抗在4°C孵育12小时。使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔多聚体检测一抗，再以3,3-二氨基联苯胺（DAB）显色，并加入硫酸铜增强信号。
  8. 用蒸馏水清洗载玻片，苏木精复染，脱水，并用永久性封片剂封片。
    注意：脱水步骤与步骤 8.3 中所述的再水化步骤相反。使用现有的扫描仪以 20x 或 40x 放大倍数扫描载玻片，并将图像上传至数据库。
  9. 使用软件绘制感兴趣区域（ROI），以包含器官组织内所有经NuMA染色的细胞，排除其他器官实质和空白区域。
  10. 调整设置以对 NuMA 阳性和 NuMA 阴性细胞进行分类，同时为每种器官使用适当的阳性和阴性对照。采用已建立的软件算法，量化每个样本中 NuMA 阳性细胞的总数/百分比。

9. 组织切片免疫荧光

以确定特定候选基因在转移过程中的哪个阶段发挥作用（例如., 外渗与存活率的比较），可通过在不同时间点检测组织切片的免疫荧光，追踪肿瘤细胞从注射到远处器官侵袭、定植及生长的进展过程。该方法可加入针对邻近细胞的标记物，以捕捉外渗事件及肿瘤微环境的动态变化33.

  1. 按照步骤 7.1 中所述方法对动物进行麻醉。
  2. 在灌注前3分钟，向每只动物的左心室注射100 µg荧光素标记的番茄凝集素（Lycopersicon Esculentum Lectin），以标记血管内皮。
    注意：需留出足够时间，使番茄凝集素在整個系統中重新循環。
  3. 按照步骤7.2–7.3所述灌注动物。取下目标器官并转移至预先标记、盛有4% PFA的容器中。固定组织24至48小时。使用振动切片机将组织切成30–50 µm厚的切片。
    注意：厚度应优化。建议切片厚度在 30 µm 至 50 µm 之间，尤其是在进行 z 轴层扫成像时。
  4. 在室温下用封闭液（含10%正常山羊血清、2% BSA、0.25% Triton X-100的DPBS）孵育切片2小时。
  5. 进行染色优化实验。
    注意：由于抗原修复时间、抗原修复所用缓冲液、温度、不同抗体/不同批次以及组织类型均会影响染色结果，因此需要进行优化实验。
  6. 以优化的稀释比例加入一抗，在优化的温度下孵育经过优化的时间（参见示例于 表1).
    注意：请为一抗/二抗以及未染色的组织样本设置适当的对照。
  7. 用含0.25% Triton X-100的DPBS洗涤组织切片，每次5分钟，共洗涤3次。
  8. 将组织切片置于含二抗的封闭液中，在所需时间内孵育（表1).
  9. 用含0.25% Triton X-100的DPBS洗涤组织切片，每次5分钟，共洗涤3次。
  10. 用 DPBS 或封闭缓冲液按 1:1,000 稀释 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色，孵育 5 分钟。
  11. 向盖玻片上加入2滴抗荧光淬灭封片剂，将组织切片转移至载玻片上，确保切片完全被封片剂覆盖。
    注意：确保切片上无直接气泡，以免影响显微观察。
  12. 使用60倍油镜在共聚焦显微镜上采集图像。
    注意：在采集共聚焦图像时，整个实验中所有图像的设置参数（电压、airy 单位和增益）应保持一致。
  13. 使用显微镜以10x、20x或40x倍率采集非共聚焦图像。
  14. 将图片上传至图像分析软件，并通过比较所选参数（例如., 面积、数量、标记物强度或与相邻细胞的接触情况。

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结果

以下图示展示了所述工作流程在鉴定黑色素瘤转移新驱动因子中的应用。 图2 总结了一项已发表研究的结果，该研究探讨了沉默岩藻糖基转移酶 FUT8 对 体内 黑色素瘤转移被研究26简而言之，对人类患者糖组学数据（通过凝集素芯片获得）和转录组谱的分析显示，从原发性到转移性黑色素瘤的进展过程中，α-1,6-岩藻糖水平升高，这与相应的岩藻糖基转移酶（FUT8）表达增加一致。

携带 FUT8 shRNA 或相应非靶向对照（shNTC）的慢病毒转导的 113/6-4L 黑色素瘤细胞，通过超声引导下心内注射注入免疫缺陷小鼠（NSG）体内，操作步骤如上文所述（第 2.9 节）。通过监测小鼠的转移性播散情况 体内 活体成像。实验结束时，处死小鼠，取器官进行检查 离体 荧光并进行组织学分析。除了H&E，通过NuMA染色特异性识别小鼠组织中的人源细胞。如图所示 图3对NuMA染色切...

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讨论

本技术报告旨在为黑色素瘤转移潜在作用因子的研究提供一套标准化的、从头至尾的完整工作流程。 体内 实验可能耗费高昂且耗时，因此最大限度提高效率并增加所获信息价值的策略至关重要。

在整个研究过程中，必须采用互补的方法，以在同一实验内交叉验证研究结果。例如，NuMA 免疫组织化学染色与生物发光成像（BLI）是量化转移负荷的互补手段，因为二者均无法单独提供全面信息。尽管 BLI 是一种极为宝贵的非侵入性方法，可用于活体（in vivo）追踪肿瘤进展，但其数据本质上分辨率较低。NuMA 染色则允许对固定器官中的转移负荷进行细致分析；然而，对整个组织厚度进行完全切片在实际操作中不可行，因此只能对每个器官的部分样本进行染色。事实上，根据作者的经验，BLI 结果并不总是与组织病理学分析中所见的肿瘤负荷呈直接正比关系。部分原因在于该方法的灵敏度有限，尤其是在脑部，这是由于经颅衰减所致34。此外，这些数据还可能受到荧光素摄取不完全和/或荧光素酶表达水平差异的影响。因此，BLI 结果应结合离体（ex vivo

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢纽约大学朗格尼健康中心（NYU Langone Health）先进研究技术部（Division of Advanced Research Technologies, DART），特别是实验病理学研究实验室、基因组技术中心、细胞计量与细胞分选实验室以及临床前影像核心实验室，这些实验室的部分工作得到了珀尔马特癌症中心支持基金（Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087）的资助。感谢纽约大学黑色素瘤多学科合作组（NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group，负责人：Iman Osman 博士）提供患者来源的黑色素瘤短期培养细胞+（10-230BM 和 12-273BM），这些细胞系是通过经机构审查委员会（IRB）批准的方案获得的（通用知情同意研究 #s16-00122 和黑色素瘤多学科合作组研究 #10362）。感谢多伦多大学 Robert Kerbel 博士提供 113/6-4L 和 131/4-5B1 黑色素瘤细胞系*，以及感谢威斯塔研究所（Wistar Institute）Meenhard Herlyn 博士提供 WM 4265-2、WM 4257s-1 和 WM 4257-2 黑色素瘤短期培养物**。E.H. 的研究得到 NIH/NCI R01CA243446、P01CA206980、美国癌症协会—黑色素瘤研究联盟团队科学奖（American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award）以及 NIH 黑色素瘤 SPORE 基金（NCI P50 CA225450；负责人：I.O.）的支持。图 1 使用 Biorender.com 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#15 手术刀片 WPI500242用于外科手术
#3 手术刀柄WPI500236用于外科手术
1 mL 结核菌素注射器，滑动接头 BD309626注射
10 mL 注射器，滑动接头 BD301029灌注
10% 甲醛钠缓冲液EK Industries4499-20L用于灌注/组织固定
15 mL 锥形管Corning 430052细胞培养
15 mL 聚丙烯锥形离心管Falcon352196细胞培养
200 证明乙醇Deacon Labs04-355-223组织学
22G – 22mm 针头BD305156灌注
4-0 Vicryl 缝合线EthiconJ464G缝合
4% Carson 磷酸盐缓冲多聚甲醛 EMS15733-10用于灌注/组织固定
40µmCorning431750组织处理
5-0 可吸收缝合线 Ethicon6542000闭合
50 mL 锥形管 Corning 430828细胞培养
50 mL 聚丙烯锥形离心管Falcon352070细胞培养
7-0 丝线缝合线 FST18020-70结扎
70µmCorning431751组织处理
抗荧光淬灭封片剂  Vector LabsH-1000-10免疫荧光
近似器施加镊子，10cm WPI14189用于显微外科手术
AvanceBruker3 HDNMR 控制台 
Biospec 7030 Bruker7030微型 MRI
BSABioregA941NuMA 染色
Castroviejo 缝合镊，直头，5.5mm 打结平台，11cm WPIWP5025501用于显微外科手术
Coplin 染色缸Bel-Art F44208-1000组织学
DAPISigma-AldrichD9542-1MG免疫荧光
dCas9-KRABAddgene110820基因操作
DNase INEBM0303L组织处理
DPBSCorning21-030-CM组织处理
超锐单刃无涂层刀片GEM62-0167组织处理
细胞外基质基质 Corning354234可考虑使用生长因子减少型（作为替代 
FBSCytivaSH30910.03细胞培养
Fiji Image JFiji Image J软件免疫荧光
山羊抗兔 HRP 偶联多聚体 Thermo FisherA16104NuMA 染色
山羊血清GibcoPCN5000免疫荧光
HBSSCorning21-020-CV组织处理
苏木精 Richard-Allan Scientific 7231组织学
Illumina III PerkinElmerCLS136334BLI 仪器
胰岛素注射器 28G - 8mm 针头BD329424注射
胰岛素注射器 31G - 6mm 针头 BD326730注射
虹膜镊，10.2cm，全弧形，带齿WPI504478用于灌注和外科手术
异氟烷 USPCovetrus11695067772麻醉
珠宝商 #7 钛镊，11 cm，0.07 x 0.01 mm 尖端WPIWP6570用于显微外科手术
盐酸氯胺酮 100mg/mLMylan Ind.1049007麻醉
lentiCRISPRv2Addgene98290基因操作
番茄凝集素（Lycopersicon Esculentum），DyLight 649 标记InvitrogenL32472血管内皮细胞标志物
MEM 非必需氨基酸 X 100Corning25-025-CI细胞培养
Metzenbaum 剪刀WPI503269用于外科手术
显微注射装置KOPF5000心内注射
NaClFisherS25877 NuMA 染色
30G x 25mm 针头BD305128心内注射
33G x 15mm 针头Hamilton7747-01颈动脉内注射
缝合针持，Castroviejo 型，14cm，带锁，1.2mm 带齿钳口WPI14137-G用于显微外科手术
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ 小鼠杰克逊实验室005557小鼠模型
NU/J 小鼠杰克逊实验室002019小鼠模型
核有丝分裂器蛋白多克隆兔抗人抗体 Abcam97585NuMA 染色
青霉素-链霉素 10000U/mLGibco15140122细胞培养
PercollGE0891-01密度分离溶液 
PI 经典外科手套Cardinal Health2D72PT75X手术
pLKO Tet-OnAddgene21915基因操作
10% 聚维酮碘溶液MedlineMDS093943手术
丙美卡因滴眼液 0.5%Akorn PharmaAX0501眼科局部麻醉剂
Puralube 宠物用凡士林眼膏Dechra83592麻醉
双面剃须刀片 EMS72000剃毛和振动切片机脑切片 
Reflex 9mm EZ 夹 BraintreeEZC- KIT伤口闭合
RPMI 1640 Corning10-040-CM细胞培养
弹簧剪刀，10.5cm 直型，8mm 刀片WPI501235用于显微外科手术
半自动振动刀片切片机LeicaVT1200脑切片免疫荧光
单通道麻醉蒸发器系统Kent ScientificVetFlo-1210S 麻醉
Smartbox 台式舱室系统及排气风机EZ SystemsTT4000CO2 安乐死
无菌带孔一次性手术巾MedlineNON21002手术
无菌非加强型 Aurora 手术服，内置袖口MedlineDYNJP2715手术
T25 培养瓶Corning 430639细胞培养
TrisCorning46-031-CMNuMA 染色
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML免疫荧光
Troutman 打结镊，10cm，弧形 G 型，0.52mm 尖端带打结平台WPIWP505210用于显微外科手术
血管夹，10G 压力，5x 0.8mm 钳口，5个/包WPI15911用于显微外科手术
VisiopharmVisiopharmVisiopharmNuMA 染色定量分析软件
赛拉嗪 100mg/mLAkorn Pharma59399-111-50麻醉
二甲苯FisherX3P-1GAL组织学

参考文献

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