浸泡珠实验涉及在发育的任意时间点将测试试剂靶向递送，以研究细胞分化和形态发生的调控。本文提供了一种详细的实验方案，适用于任何实验动物模型，介绍如何制备三种不同类型的浸泡珠，并将其植入鸡胚的趾间区域。
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本文内容
摘要
摘要
在胚胎发育过程中，会激活多种遗传程序，协调细胞分化，从而产生种类惊人的体细胞、组织和器官。这些遗传程序的精确激活受形态发生素的调控，形态发生素是一类可扩散的分子，能够在不同浓度阈值下引导细胞命运。要理解遗传激活如何协调形态发生，就需要研究发育过程中由形态发生素触发的局部相互作用。将浸有蛋白质或药物的微珠植入胚胎的不同区域，可用于研究特定分子在指（趾）形成及其他发育过程中的作用。这种实验技术可提供有关细胞诱导、细胞命运决定和模式形成的调控信息。因此，这种浸润微珠实验是一种极为强大且有价值的实验工具，可广泛应用于其他胚胎模型研究。
引言
在控制胚胎发育过程中基因表达的分子机制方面取得的突破，使我们能够理解细胞命运是如何被决定的。当细胞开始表达特定的转录因子时，便启动了向不同细胞谱系的定向分化1。这种表达模式在时间和空间上高度协调，从而指导细胞、组织和器官的形态形成、定位与模式建立1,2,3,4,5。胚胎诱导是指通过建立层级关系限制细胞潜能，使其定向分化为特定谱系的过程，该过程甚至包括如斯佩曼组织者（Spemann organizer）所介导的基本体轴模式的形成6,7。原肠胚的背唇（blastopore dorsal lip）可在一个宿主胚胎中诱导形成第二个胚胎轴8,9。如今，借助移植实验及其他经典实验方法，并结合分子生物学手段，人们已明确多种转录因子和生长因子在斯佩曼组织者中协同调控胚胎诱导过程10。因此，实验性操作....
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方案
本研究已通过墨西哥国立自治大学（UNAM，墨西哥墨西哥城）生物医学研究研究所实验动物护理和使用机构审查委员会的审查和批准。
1. 卵的孵化与胚胎分期
注意：受精的母鸡蛋可从当地农场获得。最常用的是受精的白来航鸡鸡蛋。在孵化前，可将新鲜的受精鸡蛋在15 °C下储存最多1周。
- 将受精的鸡卵垂直放置于加湿的孵育箱中，尖端朝下，在38 °C、70%相对湿度条件下孵育，直至达到HH 28期（约孵化5.5天，根据Hamilton和Hamburger，1951）。22孵育期间旋转卵子，以防止胚胎黏附于壳膜。
注意：发育阶段的选择应根据实验目的而定。在此情况下，28 HH 阶段最适合进行指间琼脂珠植入，以诱导异位指的形成或促进细胞死亡。 - 从培养箱中取出卵，用70%乙醇擦拭，并使其自然晾干。用70%乙醇对工作区域、显微镜和仪器进行消毒。
- 用透射光检查鸡蛋以识别血管并定位胚胎。丢弃无胚胎的鸡蛋。
- 使用无齿镊的末端，轻敲约五个鸡蛋的钝端，在蛋壳上开一个窗口，并移除约1厘米的蛋壳2 用镊子夹取壳的一部分。
- 将鸡蛋转移至蛋盒或塑料支架中，并置于体视显微镜下。用精细手术镊刺破并撕去气室膜，移除所有可能接触胚胎的细小蛋壳碎片。
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结果
利用浸泡珠评估鸡胚肢体中的细胞行为
为确保该检测方法的有效性，必须将珠子一致且精确地放置于正确位置；在此情况下，即位于顶外胚层脊（AER）下方第三指间区域最远端的位置（图1A）。这种定位可使目标分子在指间组织中均匀扩散。此外，AER下方区域含有未分化的细胞，对处理具有高度敏感性。为评估对细胞分化的影响，可用阿利新蓝（Alcian blue）和茜素红（Alizarin red）对胚胎进行染色，以显示骨骼结构的形成（图1B）。浸泡珠实验也适用于通过中性红染色检测细胞死亡（图1C），以及通过原位杂交（in situ hybridization）分析基因表达调控（图1D）。比例尺设定为250 µm。
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讨论
本方案中详述的实验工具的主要优势在于能够控制暴露于浸有特定实验分子的微珠的时间和位置。将精确定位与精确的发育时机相结合，为研究细胞分化过程提供了极大的可能性。在未分化组织中进行这些实验，可用来探究细胞谱系中的最初关键事件。例如，在28 HH期胚胎肢体的指间组织中放置一颗浸有TGFß的微珠，会诱导形成一个异位手指结构，并触发分子级联反应，进而诱导主控基因Sox925的基因表达。值得注意的是，所诱导生成的软骨组织还能进一步自组织为具有指节结构的手指样形态。
有趣的是，视黄酸（RA）通过调控骨形态发生蛋白的基因表达，诱导同一指间区域的细胞死亡，而骨形态发生蛋白可引导未分化细胞向细胞死亡的命运分化10。因此，可在胚胎的同一区域同时研究细胞分化、细胞死亡、形态发生和模式形成，并可根据需要针对任何特定区域和感兴趣的遗传通路进行定制研究8,9。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由墨西哥国立自治大学学术人事总署（DGAPA）-墨西哥国立自治大学 [资助号 IN211117 和 IN213314] 以及墨西哥国家科学与技术委员会（CONACyT）[资助号 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] 提供支持，资助对象为 JC-M。JC M-L 获得了墨西哥国家科学与技术委员会（CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887）的博士后奖学金。作者感谢墨西哥国立自治大学生物医学研究所的 Lic. Lucia Brito 在本文参考文献整理过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蓝色琼脂糖凝胶珠 | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 凝胶珠 | Bio-Rad | 1400123 | |
| 鸡蛋孵化箱 | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| 精细外科镊子 | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| 肝素琼脂糖凝胶珠 | Abcam | ab193268 | |
| 培养皿 | Nest | 705001 | |
| 体视显微镜 | Zeiss | Stemi DV4 | |
| 胶带 | NA | NA | |
| 钨针 | GoodFellow | E74-15096/01 |
参考文献
- Stapornwongkul, K. S., Vincent, J. P. Generation of extracellular morphogen gradients: the case for diffusion. Nature Reviews Genetics. 22 (6), 393-411 (2021).
- Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretatio....
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重印与许可
