浸泡珠实验涉及在发育的任意时间点将测试试剂靶向递送，以研究细胞分化和形态发生的调控。本文提供了一种详细的实验方案，适用于任何实验动物模型，介绍如何制备三种不同类型的浸泡珠，并将其植入鸡胚的趾间区域。
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摘要
摘要
在胚胎发育过程中，会激活多种遗传程序，协调细胞分化，从而产生种类惊人的体细胞、组织和器官。这些遗传程序的精确激活受形态发生素的调控，形态发生素是一类可扩散的分子，能够在不同浓度阈值下引导细胞命运。要理解遗传激活如何协调形态发生，就需要研究发育过程中由形态发生素触发的局部相互作用。将浸有蛋白质或药物的微珠植入胚胎的不同区域，可用于研究特定分子在指（趾）形成及其他发育过程中的作用。这种实验技术可提供有关细胞诱导、细胞命运决定和模式形成的调控信息。因此，这种浸润微珠实验是一种极为强大且有价值的实验工具，可广泛应用于其他胚胎模型研究。
引言
在控制胚胎发育过程中基因表达的分子机制方面取得的突破，使我们能够理解细胞命运是如何被决定的。当细胞开始表达特定的转录因子时，便启动了向不同细胞谱系的定向分化1。这种表达模式在时间和空间上高度协调，从而指导细胞、组织和器官的形态形成、定位与模式建立1,2,3,4,5。胚胎诱导是指通过建立层级关系限制细胞潜能，使其定向分化为特定谱系的过程，该过程甚至包括如斯佩曼组织者（Spemann organizer）所介导的基本体轴模式的形成6,7。原肠胚的背唇（blastopore dorsal lip）可在一个宿主胚胎中诱导形成第二个胚胎轴8,9。如今，借助移植实验及其他经典实验方法，并结合分子生物学手段，人们已明确多种转录因子和生长因子在斯佩曼组织者中协同调控胚胎诱导过程10。因此，实验性操作是研究胚胎发生过程中细胞分化、形态发生及模式形成的重要工具。
有趣的是，在组织移植困难的胚胎系统中，或当诱导因子已知时，常使用载体将分子（如蛋白质、化学物质、毒素等）递送至目标区域，以调控细胞分化、形态发生甚至模式形成。其中一种载体系统是在任何实验模式生物的任何发育时间点植入经特定分子浸泡的微珠，以确定该试剂的作用或引导该模型的分化方向。例如，Cheryl Tickle 等人（1985）通过将经视黄酸（RA）浸泡的微珠植入鸡胚翼肢芽中，证明了 RA 可诱导极化活性区（zone of polarizing activity, ZPA）中 sonic hedgehog 的表达11,12。相同的实验策略还被用于发现 RA 在指（趾）发育过程中调控体节的不对称性以及肢芽中细胞死亡的作用，并在其他胚胎肢区也观察到类似效应13,14,15。其他因子，主要是蛋白质（如成纤维细胞生长因子 [FGF]、转化生长因子-β [TGF-ß]），也分别被用于在早期胚胎体壁诱导肢体形成，或在指间区域诱导新指的生成16,17,18,19,20,21。这些实验充分证明了该技术在确定组织或细胞群对分子响应的决定阶段或感受态方面所具有的强大功能与实用价值。
在此方案中，以趾形成阶段的鸡胚肢体作为实验模型，逐步展示如何制备和植入浸润珠。然而，该实验工具不仅限于此应用，还可应用于任何实验动物模型及任何时间点 体外 和 体内 用于研究诱导、分化、细胞死亡和模式形成。
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方案
本研究已通过墨西哥国立自治大学（UNAM，墨西哥墨西哥城）生物医学研究研究所实验动物护理和使用机构审查委员会的审查和批准。
1. 卵的孵化与胚胎分期
注意：受精的母鸡蛋可从当地农场获得。最常用的是受精的白来航鸡鸡蛋。在孵化前，可将新鲜的受精鸡蛋在15 °C下储存最多1周。
- 将受精的鸡卵垂直放置于加湿的孵育箱中，尖端朝下，在38 °C、70%相对湿度条件下孵育，直至达到HH 28期（约孵化5.5天，根据Hamilton和Hamburger，1951）。22孵育期间旋转卵子，以防止胚胎黏附于壳膜。
注意：发育阶段的选择应根据实验目的而定。在此情况下，28 HH 阶段最适合进行指间琼脂珠植入，以诱导异位指的形成或促进细胞死亡。 - 从培养箱中取出卵，用70%乙醇擦拭，并使其自然晾干。用70%乙醇对工作区域、显微镜和仪器进行消毒。
- 用透射光检查鸡蛋以识别血管并定位胚胎。丢弃无胚胎的鸡蛋。
- 使用无齿镊的末端，轻敲约五个鸡蛋的钝端，在蛋壳上开一个窗口，并移除约1厘米的蛋壳2 用镊子夹取壳的一部分。
- 将鸡蛋转移至蛋盒或塑料支架中，并置于体视显微镜下。用精细手术镊刺破并撕去气室膜，移除所有可能接触胚胎的细小蛋壳碎片。
注意：气室膜是开窗鸡蛋后立即观察到的白色不透明膜。 - 在显微镜下观察，轻轻打开羊膜囊，用精细手术镊将其撕开。注意避免损伤绒毛尿囊膜的血管系统。
注意：羊膜是紧密包围胚胎的透明膜，将胚胎包裹在羊水之中。 - 对胚胎进行分期 在卵内 以确定其是否处于理想发育阶段。较早阶段的胚胎可在用胶带封好蛋壳窗口后，放回培养箱继续培养。
2. 磁珠制备
注意：根据实验目的和所涉及的处理方法，其他类型的珠子（例如 Affi-Gel、AG1-X2、肝素）可能更为合适。Affi-Gel 珠子适用于蛋白质（例如 TGF-ß1），肝素珠子适用于生长因子（例如 FGFs、WNT），而 AG1-X2 珠子适用于溶于有机溶剂（例如 DMSO）的化学物质。
- 亲和凝胶与肝素珠的制备
- 裁剪一块大小合适的Parafilm薄膜，使其能够覆盖一个45 mm的培养皿。将薄膜平铺于培养皿底部并覆盖整个表面，使用无齿镊子的末端按压薄膜的每个角，将其固定在培养皿底部。放置一旁备用。
- 使用移液器或刮铲将珠子转移至微量离心管中，用1×PBS洗涤两次，每次通过静置后吸除上清完成洗涤。
- 用微量移液器将约40–50个珠子转移至第1步中已铺好Parafilm的培养皿中央。
- 在显微镜下挑选约30个直径约为100 µm的Affi-Gel或肝素珠用于后续实验。可使用显微镜目镜测微尺测量珠子大小，或以HH 28期胚胎的第三指（趾）间组织作为参考；珠子应小于指（趾）间组织。
- 尽可能小心地移除珠子周围多余的PBS，并将珠子浸泡于2–5 µL处理溶液中，确保溶液完全覆盖珠子。
- 同时，将对照组珠子浸泡于仅含与实验组处理溶液相同量溶剂的溶液中。
注意：每种处理的浓度需根据具体实验设计进行计算。操作可能有害的试剂时，请佩戴适当的个人防护装备。 - 将珠子在室温下孵育30分钟。为防止孵育过程中珠子干燥，可在珠子周围滴加数滴1×PBS或水以增加局部湿度，并用Parafilm密封培养皿以减缓蒸发。
- 将培养皿置于冰上，并在同一天内完成珠子的植入。
- AG 1-X2珠的制备
- 裁剪一块大小合适的Parafilm薄膜，使其能够覆盖一个45 mm的培养皿。将薄膜覆盖在培养皿底部，并使用无齿镊子的末端按压薄膜的每个角，将其固定。放置一旁备用。
- 使用刮铲将AG 1-X2珠转移至微量离心管中，加入30–50 µL所需终浓度的处理溶液。
- 同时，将对照组珠子在仅含溶剂（不含目标实验化学物或蛋白）的溶液中孵育。
- 在室温下缓慢振荡孵育珠子20分钟。所有孵育步骤均需用铝箔包裹微量离心管以避光，因为这些分子中的许多对光敏感。
- 尽可能吸除溶液，然后加入室温下溶解于水中的2%酚红溶液，轻微振荡染色2分钟。
注意：对透明的AG 1-X2珠进行染色有助于在胚胎中定位并完成植入。 - 移除2%酚红溶液，并用1×PBS洗涤珠子两次，以去除残留染料。
- 使用微量移液器尖端将约40–50个AG 1-X2珠转移至第1步中准备好的铺有Parafilm的培养皿中央，并将其浸泡于5 µL的1×PBS中。在显微镜下挑选约30个直径约为100 µm的珠子。弃去未使用的珠子。
- 珠子现已准备好用于植入。在整个植入过程中，应通过在珠子周围滴加数滴1×PBS或水以维持局部湿度，和/或用Parafilm覆盖培养皿以减缓蒸发，确保珠子始终浸没在PBS中。
3. 胚胎操作与指间移植
- 在操作胚胎之前，将两台体视显微镜并排放置在实验台上。一台用于胚胎操作和微珠植入，另一台用于准备待植入胚胎的处理过的微珠。
- 使用无齿镊子，按照卵孵化与胚胎分期部分所述方法，在剩余的鸡蛋上开一个窗口。
- 在显微镜下，仅用精细手术镊子在右侧后肢附近的羊膜上撕开羊膜囊，撕开范围以完成操作所需为限（即尽可能小）。
- 使用精细镊子夹住羊膜以暴露右侧后肢。使用精细的钨针，在后肢最远端的第三指间区域中央打一个小孔。
- 在不松开胚胎和暴露的后肢的情况下，用镊子的一个尖端从另一台显微镜处取一颗已处理的微珠。镊子必须保持张开状态，以便微珠能够附着在镊子尖端上。
- 将微珠转移至鸡胚靠近后肢的位置，并将其置于指间小孔上方。
- 闭合镊子，对微珠施加压力，直至其进入小孔。
- 松开胚胎，并用胶带密封蛋壳上的窗口。
- 将鸡蛋放回孵育箱，直至达到所需发育阶段。重复该操作，直到获得所需数量的操作胚胎。必须确保微珠在任何步骤中均不干燥。
注意：若要观察完整的异位手指形成，需在微珠植入后继续孵育约 72 小时。相比之下，早期分化基因（例如 Sox9）在植入经 TGF-ß1 浸泡的微珠后约 30 分钟即开始表达。
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结果
利用浸泡珠评估鸡胚肢体中的细胞行为
为确保该检测方法的有效性，必须将珠子一致且精确地放置于正确位置；在此情况下，即位于顶外胚层脊（AER）下方第三指间区域最远端的位置（图1A）。这种定位可使目标分子在指间组织中均匀扩散。此外，AER下方区域含有未分化的细胞，对处理具有高度敏感性。为评估对细胞分化的影响，可用阿利新蓝（Alcian blue）和茜素红（Alizarin red）对胚胎进行染色，以显示骨骼结构的形成（图1B）。浸泡珠实验也适用于通过中性红染色检测细胞死亡（图1C），以及通过原位杂交（in situ hybridization）分析基因表达调控（图1D）。比例尺设定为250 µm。
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讨论
本方案中详述的实验工具的主要优势在于能够控制暴露于浸有特定实验分子的微珠的时间和位置。将精确定位与精确的发育时机相结合，为研究细胞分化过程提供了极大的可能性。在未分化组织中进行这些实验，可用来探究细胞谱系中的最初关键事件。例如，在28 HH期胚胎肢体的指间组织中放置一颗浸有TGFß的微珠，会诱导形成一个异位手指结构，并触发分子级联反应，进而诱导主控基因Sox925的基因表达。值得注意的是，所诱导生成的软骨组织还能进一步自组织为具有指节结构的手指样形态。
有趣的是，视黄酸（RA）通过调控骨形态发生蛋白的基因表达，诱导同一指间区域的细胞死亡，而骨形态发生蛋白可引导未分化细胞向细胞死亡的命运分化10。因此，可在胚胎的同一区域同时研究细胞分化、细胞死亡、形态发生和模式形成，并可根据需要针对任何特定区域和感兴趣的遗传通路进行定制研究8,9。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由墨西哥国立自治大学学术人事总署（DGAPA）-墨西哥国立自治大学 [资助号 IN211117 和 IN213314] 以及墨西哥国家科学与技术委员会（CONACyT）[资助号 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] 提供支持，资助对象为 JC-M。JC M-L 获得了墨西哥国家科学与技术委员会（CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887）的博士后奖学金。作者感谢墨西哥国立自治大学生物医学研究所的 Lic. Lucia Brito 在本文参考文献整理过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蓝色琼脂糖凝胶珠 | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 凝胶珠 | Bio-Rad | 1400123 | |
| 鸡蛋孵化箱 | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| 精细外科镊子 | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| 肝素琼脂糖凝胶珠 | Abcam | ab193268 | |
| 培养皿 | Nest | 705001 | |
| 体视显微镜 | Zeiss | Stemi DV4 | |
| 胶带 | NA | NA | |
| 钨针 | GoodFellow | E74-15096/01 |
参考文献
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