使用浸泡珠测定分析鸡胚胎发生过程中的细胞分化，形态发生和图案化

Summary

浸泡的磁珠测定涉及在任何发育时间点靶向递送测试试剂，以研究细胞分化和形态发生的调节。提出了适用于任何实验动物模型的详细方案，用于制备三种不同类型的浸泡珠子并将其植入鸡胚的间位中。

Abstract

在胚胎发育过程中，许多遗传程序被激活，这些程序协调细胞分化，以产生惊人的体细胞，组织和器官的多样性。这些遗传程序的精确激活是由形态原调节的，形态原是可扩散分子，在不同的阈值指导细胞命运。要了解基因激活如何协调形态发生，需要研究发育过程中由形态发生触发的局部相互作用。使用浸泡在蛋白质中的珠子或植入胚胎不同区域的药物可以研究特定分子在建立手指和其他发育过程中的作用。该实验技术提供有关细胞诱导，细胞命运和模式形成的控制的信息。因此，这种浸泡的珠子测定是一种非常强大和有价值的实验工具，适用于其他胚胎模型。

Introduction

在胚胎发育过程中控制基因表达的分子机制的突破使我们能够了解细胞命运是如何决定的。一旦细胞开始转录因子1的分子表达，就会对不同的细胞谱系^做出承诺。这种表达模式在空间和时间上高度协调，从而指导细胞，组织和器官的塑造，定位和图案化^1，2，^3，4，5。胚胎诱导是通过建立限制细胞潜力的层次结构来使细胞致力于特定谱系的过程，其中甚至包括像Spemann组织者^6，7那样产生基本的身体计划。胚孔背唇在宿主胚胎^8，9中诱导第二胚胎轴。今天，借助嫁接和其他经典实验结合分子方法，已知不同的转录因子和生长因子在Spemann组织器¹⁰中具有指导胚胎诱导的功能。因此，实验操作是了解胚胎发生过程中细胞分化，形态发生和图案化过程的重要工具。

有趣的是，在组织....

Protocol

这项研究由墨西哥国立自治大学（墨西哥国立自治大学）生物医学研究所实验室动物护理和使用机构审查委员会（墨西哥国立自治大学）审查和批准。

1. 卵子孵化和胚胎分期

注意:受精鸡蛋可以从当地农场获得。受精白里窝那鸡蛋是最常用的。在孵化前将新鲜受精的鸡蛋在15°C下储存长达1周。

1. 在38°C和70%相对湿度的加湿培养箱中，将受精的鸡蛋垂直孵育，尖头面朝下，直到它们达到28 HH阶段（根据Hamilton和Hamburger，1951年，约5.5天）²²。在孵化过程中旋转卵子，以防止胚胎粘附在壳膜上。
   注意:发育阶段的选择取决于实验目的。在这种情况下，28 HH期是诱导异位手指或促进细胞死亡的指间珠植入的最佳选择。
2. 从孵化器中取出种蛋，用70%乙醇擦拭，然后让它们风干。用70%乙醇对工作区域，显微镜和仪器进行消毒。
3. 蜡烛卵识别血管并定位胚胎。丢弃没有胚胎的卵子。
4. 使用非齿镊子的末端，通过敲击卵的钝端在大约五个卵中打开一个窗口，并用镊子取出1厘米² 的壳。
5. 将鸡蛋转移到纸箱或塑料支架中，并将其放在立体显微镜下。通过穿刺并用精细的手术镊子将其拉出来去除空气膜。取出任何可能接触胚胎的小块蛋壳。
   注意:空气膜是在打开鸡蛋后立即....

Results

使用浸泡的珠子评估胚胎雏鸡肢体中的细胞行为
为了确保该测定的功效，必须将磁珠一致且精确地放置在正确的位置;在这种情况下，在顶端外胚层脊AER下方的第三指间的远端大部分（图1A）。这种定位允许所讨论的分子在整个指间组织中均匀分布。此外，AER下方的区域包含未分化的细胞，这些细胞很容易对治疗有反应。为了评估对细胞分化的影响，可以用Alcian蓝和茜素红染色胚胎，以证明骨骼元素的形成（图1B）。浸泡珠测定也非常适合用中性红（图1C）评估细胞死亡和通过 原位 杂交进行基因调控（图1D）。比例尺设置为 250 μm。

Discussion

该协议中详述的实验工具的主要优点是能够控制暴露于浸泡在给定实验分子中的磁珠的时间和位置。将正确的定位与精确的发育时间相结合，为研究细胞分化过程提供了巨大的可能性。在未分化的组织中进行这些实验可以研究细胞谱系中的第一个关键事件。例如，将TGFß浸泡的珠子放在胚胎肢体28 HH的指间组织中会导致异位手指的形成，其中触发分子级联，诱导主 Sox9²⁵的遗传表达。值得注意的是，诱导的软骨组织也组织成指骨形成的手指。

有趣的是，RA通过调节骨形态发生蛋白的基因表达来触发同一指间区域的细胞死亡，这些蛋白质将未分化细胞的细胞命运引向细胞死亡¹⁰。因此，可以在胚胎的同一区域同时研究细胞分化，细胞死亡，形态发生和模式形成，并针对感兴趣的任何区域和遗传途径进行定制^8，9。

该协议成功的关键因素包括永不让浸泡的珠子变干.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affi-Gel 蓝色凝胶珠子	Bio-Rad	153-7302
AG1-X2 珠子	Bio-Rad	1400123
鸡蛋孵化器	Incumatic	de Mexico Incumatic 1000
精细手术钳	精细科学工具	9115-10
肝素琼脂糖珠	Abcam	ab193268
培养皿	巢
体视显微镜	蔡司	Stemi DV4
胶带	NA	NA
钨针	GoodFellow	E74-15096/01