培养条件下神经干细胞的再激活 果蝇 脑组织外植体

摘要

已建立一种在培养的黑腹果蝇（Drosophila）脑外植体中重新激活静息态神经干细胞的方法。利用该方法，可在调控神经干细胞静息、进入及退出过程中，将系统性信号与组织内在信号分离开来。

摘要

神经干细胞（NSCs）具有增殖、分化、凋亡以及进入和退出静息状态的能力。这些过程中的许多均由神经干细胞内在的遗传程序与局部及全身性的外在因素之间复杂的相互作用所调控。在遗传模式生物中， 黑腹果蝇，神经干细胞（NSCs），即神经母细胞（NBs），在胚胎向幼虫转变期间由静息状态转为增殖状态。在此期间，幼虫从卵壳中孵化并开始爬行，寻找食物营养。响应动物摄食，脂肪体——一种具有脂质储存能力的内分泌器官——产生信号并将其系统性释放到循环的血淋巴中。在脂肪体来源信号（FBDS）的刺激下， 果蝇 胰岛素样肽（Dilps）由脑部神经分泌性神经元和胶质细胞产生并释放，从而在神经母细胞（NBs）及其胶质和气管微环境中激活下游的PI3-激酶生长信号通路。尽管这是目前关于NBs从静息状态转换为增殖状态的主流模型，但前脑背侧结构（FBDS）来源的外在信号因子的本质仍不明确。为了更深入地理解外在系统性信号如何调控NBs退出静息状态，研究人员建立了一种在动物进食前体外培养早期幼虫脑组织的方法。利用该方法，可向培养基中添加外源性因子，并检测NBs退出静息状态的情况。我们发现，外源性胰岛素足以在全脑外植体中重新激活处于静息状态的NBs。由于该方法适用于大规模筛选，我们的目标是鉴定更多调控NBs静息与增殖决策的外在信号因子。鉴于调控神经干细胞（NSC）增殖决策的基因和通路在进化上高度保守，本实验的结果可能为临床再生治疗策略的优化提供重要启示。

引言

干细胞因其在再生医学中的潜在应用而备受关注^1,2。许多动物，尤其是长寿物种，会在成体组织中维持干细胞的存在。这些定居的干细胞具有维持组织稳态的功能，并在机体受到物理损伤或疾病侵袭后参与组织修复^3,4。成年动物体内的大多数干细胞处于静息状态，这是一种相对静止的状态，其特征是细胞周期停滞以及生长信号通路的失活⁵。当接收到外界信号刺激时，干细胞会退出静息状态，进入细胞周期，并开始产生具有特定组织谱系的子代细胞。例如，为了启动有效的免疫应答，抗原呈递细胞可诱导静息的初始T细胞进入细胞周期并发生克隆扩增⁶。当骨骼肌受到损伤时，肌肉卫星干细胞会进入细胞周期，生成子代成肌细胞以替代受损的肌原纤维^5,7。尽管已明确静息干细胞能够响应外界信号，但在许多情况下，这些外界刺激因子的具体性质及其诱导干细胞活化的机制仍不清楚。深入理解静息干细胞如何响应外界信号并进入细胞周期，将有助于推动临床干细胞治疗的发展，并增进相关科学认知。

几十年来，模式生物一直被用于揭....

方案

1. 果蝇 幼虫采集

注意：开始前请准备好酵母平板、葡萄糊以及果蝇饲养盒：

1. 酵母糊：取一个小型容器，将 5 g 活性干酵母与 10 mL 水混合，搅拌成类似花生酱质地的糊状物。用塑料薄膜覆盖容器口，并用橡皮筋将其牢固固定。
   注意：新鲜酵母糊在容器中会膨胀，若未牢固固定，可能将盖子顶开。酵母糊在室温（RT）下可保存数天。
2. 葡萄培养基平板：按照配方制备葡萄培养基平板（表 1）。若使用储存在 4°C 的平板，请在使用前将其置于室温下预热 1 小时。
   1. 在 4 L 锥形瓶中加入水（750 mL）和琼脂（18.75 g），旋摇混匀，于液体循环条件下高压灭菌 20 分钟。
   2. 在 1 L 锥形瓶中加入葡萄汁（250 mL）和蔗糖（25 g），放入大号搅拌子并在加热板上低温加热搅拌。待蔗糖完全溶解后，关闭热源，待瓶体冷却至可触摸时，加入 Tegosept（10%，4 mL）和丙酸（5 mL），并保持搅拌。
   3. 高压灭菌完成后，让溶液冷却至瓶体可触摸（约 60 °C），然后加入葡萄汁混合液。
   4. 将所有溶液合并至同一锥形瓶中，继续在加热板上搅拌。
   5. 用移液器将溶液滴加至小型培养皿（35 mm）的盖子中，每盖约加 9 mL，或直至形成凸面穹顶状。
   ....

结果

将新孵化的OregonR野生型果蝇大脑解剖后，在含胰岛素的补充型Schneider培养基（SSM）中培养24小时。按照实验方案对组织进行固定和染色，使用抗Deadpan（Dpn）的一抗标记神经母细胞（NBs），抗Scribble的一抗标记细胞膜。加入胸腺嘧啶类似物5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷（Edu）以检测S期进入及神经母细胞的再激活。培养24小时后，我们观察到大量Edu阳性且Dpn阳性的大尺寸神经母细胞（图6A-C）。随后，将新孵化的OregonR野生型果蝇大脑在不含胰岛素的补充型Schneider培养基中培养24小时。培养24小时后，除4个蘑菇体神经母细胞和1个腹外侧神经母细胞外，未观察到其他大尺寸的Edu阳性且Dpn阳性的神经母细胞（图6D-F）。蘑菇体和腹外侧神经母细胞是中枢脑神经母细胞的一个亚群，在胚胎至幼虫转变期间持续分裂。我们得出结论：在Schneider培养基中培养.......

讨论

本文所述的脑组织外植体培养方法可在大多数实验室环境中进行。所需工具、操作步骤及数据收集过程均简单直接。利用该方法，可检验多种假设，包括与调控神经前体细胞（NB）重新激活和增殖相关的细胞信号级联反应及外源性因素有关的假设。在此，我们使用野生型OregonR动物发现，外源性胰岛素足以独立于其他个体特异性系统信号，重新激活处于静息状态的神经前体细胞。通过GAL4/UAS系统，还可实现细胞类型特异性的胰岛素通路组分的敲低或过表达，以更深入地理解PI3-激酶信号在神经前体细胞重新激活中的作用。除了遗传学手段外，还可通过调整培养基成分，进一步检验促进神经前体细胞重新激活和增殖的外源性信号或因子。例如，可验证添加类固醇激素蜕皮酮是否能够提高培养中神经前体细胞重新激活和增殖的比例。

尽管该方法较为直接，但我们早期遇到了一些技术难题。第一个技术难题是在更换培养基过程中对已解剖但未固定的脑组织造成的损伤。我们发现，与直接在孔内更换培养基相比，将脑组织转移至培养板的新孔中可减少组织损伤，因为当从孔中移除培养基时，脑组织会贴附在孔底，导致脑组织出现孔洞。为解决此问题，我们采用移液器将脑组织在液体中进行转移.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 µL 吸头	德文特科学公司	P2102
1000 µL 吸头	德内维尔科学	P2103-N
1000 µL加样器	Gilson	P1000
16% 多聚甲醛（10 × 10 mL）	电子显微镜科学公司	2912.60.0000	用于幼虫脑组织的固定
20 µL 移液管	Gilson	P20
200 µL 吸头	丹维尔科学	1158U56
24孔多孔培养板	Fisher Scientific	50-197-4477
35 mm 培养皿	Fisher Scientific	08-757-100A	葡萄培养皿成分
4 °C型冰箱	Fisher Scientific		为……提供理想的温度 >抗体溶液中孵育 24 小时
63倍物镜	Lecia
活性干酵母	大多数超市
琼脂糖	Fisher Scientific	214010	葡萄培养皿成分
Click-iT EdU细胞增殖成像试剂盒，Alexa Fluor 647染料	赛默飞世尔科技	C10340	标记增殖细胞
共聚焦显微镜	Leica	SP8
22 mm × 22 mm × 1 mm 盖玻片，每包10片，4盎司包装	Fisher Scientific	12-544-10	在显微镜载玻片的两端用瞬间胶粘上两张盖玻片。这可形成一个空间，使脑组织在成像时能够悬浮于抗荧光淬灭剂中。
盖玻片，22 mm × 50 mm × 1 mm	Fisher Scientific	12-545E	将盖玻片置于载玻片上的两个方形盖玻片之间，确保成像过程中抗荧光淬灭剂中的脑组织不会移动。
解剖显微镜	蔡司	Stemi 2000
乙醇 200 proof（100%），Decon Labs，1 加仑瓶装	Fisher Scientific	2701	用于在将幼虫转入培养基中培养24小时之前清洗幼虫
胎牛血清（10%）	Sigma	F4135-100ML	细胞培养基添加剂
用于解剖的精细镊子	Fine Science Tools	11295-20	用于解剖的镊子。锋利时使用效果最佳。
用于杂交的果蝇培养瓶	Genessee Scientific	32-130	该瓶子用作容器，使果蝇可在葡萄培养基平板上产卵。
玻璃解剖皿（3孔）	这些已不再提供
谷胱甘肽	Sigma	G6013	在细胞培养过程中提供氧化保护。
山羊血清	Sigma	G9023-10ML	封闭剂
葡萄培养皿	自制	自制	用于收集新孵化卵的葡萄汁/琼脂糖平板
Image J	Imagej.net/fiji/downloads	免费下载：  https://fiji.sc	用于细胞计数和EdU再激活成像的平台
培养箱	赛默飞世尔科技		确保实验过程中温度、湿度和光照条件完全一致。
胰岛素	Sigma	I0516	实验的自变量
层流罩			用于分装培养基
L-谷氨酰胺	Sigma	G7513	在细胞培养过程中提供支撑
Nunc 72孔微型培养板	Fisher Scientific	12-565-154	在此托盘中进行免疫染色步骤
Parafilm	Fisher Scientific	S37440	用于密封培养板以防止蒸发的封板膜
青霉素-链霉素	Sigma	P4458-100ml	用于防止细胞培养过程中细菌污染的抗生素。
磷酸盐缓冲液，pH 7.4	自制	自制	固定和染色步骤后用于清洗脑组织的溶剂
挑选	Fine Science Tools	10140-01	用于从葡萄培养基上挑取幼虫
丙酸	Fisher Scientific	A-258	葡萄培养皿成分
兔子 405	Abcam	ab175653	用于免疫染色的抗体
大鼠 555	Abcam	ab150166	用于免疫染色的抗体
Rb Scribble	来自 Chris Doe 的礼物		用于免疫染色的抗体
Rt Deadpan	Abcam	ab195173	用于免疫染色的抗体
施耐德氏培养基	Life Tech	21720024	含有促进细胞生长和增殖的营养成分
SlowFade Diamond 抗荧光淬灭封片剂（5 × 2 mL）	Life Tech	S36963	防止荧光淬灭的试剂
无菌水	高压灭菌自制 Milli-Q 水		溶液配制所需材料
蔗糖	Fisher	S2-12	葡萄培养皿成分
Superfrost 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-544-7
超级胶水	大多数超市
Tegosept	Genesee Scientific	20-259	葡萄培养皿成分
Triton-X 100	Sigma	T9284-100ML	PBT
Welch's 100% 葡萄汁	大多数超市		葡萄培养皿成分