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斑马鱼胚胎单体节外植体的制备

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DOI：

10.3791/63196

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2022年6月17日

 , 
1Institute of Bioengineering, École polytechnique fédérale de Lausanne (EPFL)

本文内容

摘要

我们提出了一种从斑马鱼胚胎中分离单个体节的实验方案，该体节在培养条件下可通过荧光延时显微镜连续观察数小时，从而提供一种在单细胞分辨率下定量分析组织尺度形态变化的方法。

摘要

脊椎动物胚胎的体轴会周期性地分割成称为体节的三维多细胞单元。尽管基因振荡和分子预模式决定了体节的初始长度尺度，但机械过程被认为参与了体节最终大小和形状的形成。为了更好地理解体节的内在材料特性，研究人员建立了一种从斑马鱼胚胎中培养单个体节外植体的方法。首先去除胚胎的皮肤，接着去除卵黄，并依次切除邻近组织，从而分离出单个体节。利用转基因胚胎，可通过荧光延时显微镜观察各种亚细胞结构的分布。外植体体节的动态变化可连续追踪数小时，从而为在单细胞分辨率下研究组织尺度的形态变化提供了实验框架。该方法可实现对体节的直接力学操控，有助于解析该组织的材料特性。最后，本文所述技术可轻松扩展应用于其他组织的外植，例如脊索、神经板以及侧板中胚层。

引言

脊椎动物成体的肌肉骨骼系统的大部分结构源自胚胎体节，这些体节沿胚胎体轴以周期性和节律性的方式形成1，2。体节是三维（3D）多细胞结构，通常由内部的间充质细胞核心和外围的上皮层组成，外周包绕着富含纤连蛋白的细胞外基质3。体节的形态，即其大小和形状，部分由分节时钟及下游分子预模式决定。然而，近十年来的研究表明，机械信号和力学作用不仅参与调控分节时钟4，还在促进体节形成5，6，7以及在初始体节形成后提高体节长度的精确性方面发挥重要作用8。

随着新工具的出现，组织力学可以直接在活体（in vivo）条件下进行研究9，然而，要全面理解其背后的物理过程，还需同时研究组织的内在材料特性。本文所述的实验方案提供了一种简单的方法，用于制备单个体节，从而可在脱离胚胎的环境中独立研究其从细胞到组织尺度的物理特性。尽管已有多种方案可用于制备处于相似发育阶段的组织外植体10,11,12,13,14，但据我们所知，这是首个描述分离单个体节的实验方案。该方案易于实施，仅需大多数斑马鱼胚胎实验室常见的基本设备即可完成。

为了帮助解析力学在形态发生过程中体节形成的作用，本研究建立了一种从斑马鱼胚胎中培养单个体节外植体的方法，可用于探究体节的内在材料特性。

方案

本方案涉及使用受精后1天以内的活体脊椎动物胚胎。所有实验均采用自由交配的成年动物所获得的胚胎进行，因此属于瑞士沃州消费与兽医事务局（Service de la Consommation et des Affaires Vétérinaires du canton de Vaud）向洛桑联邦理工学院（EPFL）颁发的通用动物实验许可证的覆盖范围（许可编号：VD-H23）。

1. 解剖前

  1. 从感兴趣的杂合转基因品系杂交中获取胚胎。若需分离2至3个体节，通常仅需少量胚胎。在本方案中，每个胚胎用于分离一个体节。
  2. 使用两种50倍浓缩储备液配制1倍E3缓冲液：储备液1含有0.458 mM Na2HPO4、0.042 mM KH2PO4、4.084 mM NaCl、0.128 mM KCl；储备液2含有0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4。将480 mL蒸馏水与各10 mL的两种50倍储备液混合，配制500 mL的1倍E3缓冲液。
  3. 若在当天进行解剖，将胚胎置于培养皿中的25 mL E3培养基中，在33 °C条件下培养至三体节期。若在次日早晨解剖，则先在28 °C的E3培养基中培养胚胎至盾牌期，随后转移至19 °C过夜孵育。
  4. 为识别盾牌期或不同体节期，使用放大倍数可调范围约为0.67倍至4.5倍的标准实验室体视显微镜。
  5. 准备解剖所需工具与试剂。
    1. 将Leibovitz's L-15培养基分装至50 mL离心管中，置于冰箱保存。建议从冰箱取出的同一批次分装液最多使用两次。
    2. 使用磁力搅拌器，在85 °C条件下制备50 mL含2%琼脂糖的L-15培养基。完全溶解后，将溶液置于室温保存。
    3. 使用磁力搅拌器，在85 °C条件下制备25 mL含2%低熔点琼脂糖的L-15培养基。完全溶解后，分装至1.5 mL离心管中，置于4 °C保存。该溶液将用于制备成像室。
    4. 将熔融的2%琼脂糖倒入20 mm培养皿中，填充至皿深约三分之一处，待其凝固。解剖操作将在这些培养皿中进行。建议提前充分准备涂有琼脂糖的培养皿，并在4 °C保存。
    5. 准备以下工具：用于转移胚胎的巴斯德吸管、用于去除胚胎卵膜的一对镊子、用于去除胚胎皮肤的一对精细镊子、用于在胚胎上做切口的微型刀具、经火焰抛光的玻璃吸管（用于将外植体转移至成像室）。
    6. 将玻璃吸管在100%乙醇中灭菌15分钟，随后用移液器反复吸取并推出5 mL L-15培养基两次进行冲洗。
    7. 通过将一根睫毛或眉毛毛发粘附至玻璃毛细管上，制备睫毛工具。
  6. 使用放大倍数可调范围约为0.63倍至6.3倍的荧光体视显微镜，并配备标准GFP和RFP滤光片，筛选阳性转基因胚胎，并将其转移至另一含有E3培养基的培养皿中。

2. 单体节外植体制备

  1. 将2至3个胚胎转移至已加入10 mL L-15培养基的琼脂糖包被培养皿中（按步骤1.5.4制备）。在转移胚胎前，确保培养皿连同L-15培养基已在28 °C培养箱中预热30分钟。
  2. 用一对镊子小心地去除胚胎的绒毛膜（图1 A,B）。用其中一把镊子夹住绒毛膜，另一把镊子在靠近第一把镊子夹持位置处捏住并拉扯绒毛膜。
  3. 重复此操作一次，以充分打开绒毛膜，随后可轻柔地将胚胎推出。确保在去膜过程中不损伤或挤压胚胎。
  4. 将胚胎侧向摆放，用一把精细镊子夹住胚胎头部与尾部之间的皮肤组织，再用第二把精细镊子在靠近第一把镊子夹持位置处捏住皮肤。
  5. 在夹住皮肤的同时将两把镊子相互拉开，从而形成一个较大的开口。松开其中一把镊子，将其移至另一把镊子附近，重复上述操作，直至体节形成区域的皮肤被完全去除。
    注意：必须彻底去除将被分离体节周围的皮肤，否则在后续实验步骤中难以进行精细解剖。
  6. 使用微型刀刮除卵黄（图1C — 去除皮肤并刮除卵黄后的外植体），并按以下步骤进行一系列切口：
    1. 用第一刀切开胚胎，切口位于胚胎第一个形态学体节的前方，第二刀位于最新形成体节的后方（图1D）。再分别在目标体节的前方和后方各切一次（图1E）。
    2. 使用微型刀刮除外植区域残留的卵黄。应尽可能彻底清除卵黄，以减少外植体粘附在微型刀上的可能性。若发生粘连，可使用睫毛工具将外植体移回溶液中，同时保持微型刀浸没在培养基内。
    3. 将外植体背侧朝上，沿前后轴方向在靠近一侧体节的脊索处进行切开（图1F,G）。
    4. 取不含脊索的外植体，在靠近体节处切开侧板中胚层（LPM）。
      注意：此步骤可与前一步骤互换，即先切开侧板中胚层再切开脊索，效果相同。
  7. 选择目标体节，并在其后方和前方分别进行切开（图1H）。
  8. 最后，使用睫毛工具将体节旋转90°，以便观察仍附着于体节的神经板。在体节与神经板之间进行切开，从而释放出单个体节（图1I）。
    注意：神经板也可在步骤2.6.4之后立即去除，即在去除脊索和侧板中胚层后、从相邻体节中分离目标体节之前进行。

3. 单体节外植体成像

注意：此处描述的是使用单视角光片显微镜对单个体节外植体进行成像的操作步骤。作为替代方案，外植的单个体节也可在共聚焦显微镜中成像，该设备更为常见；若仅需观察外植体的整体形态，则甚至可使用宽场显微镜。

  1. 制备成像室，步骤如下：
    1. 用硅橡胶制剂填充1 mL注射器。将200 µL移液枪头从尖端开口处约1 cm位置剪断，并将注射器插入移液枪头中。
    2. 手动将预裁的氟化乙烯丙烯（FEP）膜条包裹在膜支架上（图2A-C），并将成像室固定在膜支架上，两者应紧密贴合（图2D）。
    3. 沿成像室与膜的交界处涂抹硅橡胶制剂，并过夜干燥，以使膜牢固粘附于成像室。在进行外植体实验前1小时移除膜支架。
    4. 将含有0.5 mL用L-15培养基配制的2%低熔点琼脂糖的等分试样在75 °C加热10分钟。取160 µL加热后的低熔点琼脂糖滴加至成像室中央，并将成像模具置于琼脂糖中（图2E，F），保持直立直至琼脂糖凝固。
    5. 再向模具两端各加入160 µL加热后的低熔点琼脂糖，并将整个装置转移至4 °C环境中冷却30分钟。
    6. 向成像室中加入600 µL L-15培养基，用镊子小心取出模具。静置直至含L-15培养基的成像室恢复至室温。
  2. 使用抛光的玻璃移液管通过吹吸方式将外植的体节转移至成像室，并用睫毛工具将外植体调整至成像室中央位置。
  3. 按照仪器制造商的说明校准成像激光器，并小心将成像室转移至配备孵育腔的显微镜中，以维持外植体 在28 °C条件下。
  4. 利用转基因品系中感兴趣区域进行第二轮激光校准，随后设置所需的z轴层厚、时间间隔和延时成像持续时间。本实验中采集70个z轴切片，层间距为2 µm，帧间隔为2分钟。
  5. 使用561 nm（10%激光功率，100 ms曝光时间）和488 nm激光（10%激光功率，100 ms曝光时间）对样品进行双色光片成像（图1J）。在本方案中，信号通过25x/1.1 NA物镜收集，并分别经561/25 nm和525/50-25带通滤光片投射到sCMOS相机上。

结果

外植体可用于量化三维条件下的大规模形态变化。为说明这一点，我们从斑马鱼早期胚胎中分离了第四体节（N = 3），这些胚胎来自Utr::mCherry（Tg(actb2:mCherry-Hsa.UTRN)；e119Tg）与H2B::GFP（Tg(h2az2a:h2az2a-GFP)；kca6Tg）杂合品系的杂交后代。Utrophin是一种肌动蛋白结合蛋白，Utr::mCherry品系可显示丝状肌动蛋白结构的分布。该转基因在此用作细胞轮廓的标记。H2B::GFP是一种荧光标记组蛋白，因此可标记染色质的分布，有效描述细胞核的位置与形态，以及显示细胞分裂过程的有丝分裂图像。

我们在成像过程中评估了外植体实验方案的成功与否。观察发现，若在解剖过程中损伤了体节，则体节组织的完整性会受到破坏，表现为大量细胞从外植的体节中解离并突出，和/或出现大量细胞死亡，后者可通过核通道中存在碎裂的细胞核来判断。成功的外植体在4-6小时内保持健康状态，之后开始出现体节完整性改变，表现为细胞从外植体中解离并死亡。

在utrophin通道中，我们使用MATLAB（R2018b）对每隔10 µm的z切片进行外植体的手动分割。我们开发了一种基于MATLAB的自定义分割算法，该算法可免费下载（https://github.com/sundar07/SomSeg）。在该算法中，可设置待分割的文件、帧和z切片，随后出现用户提示，允许手动绘制感兴趣区域的轮廓。此过程在多个z切片上重复进行并绘制结果，显示了外植体随时间在三维空间中逐渐变圆的趋势（图3A）。此外，还通过核通道获得了有关组织形态的补充信息。为此，我们使用了Mastodon（版本1.0.0-beta-19，https://github.com/mastodon-sc/mastodon），这是一种FIJI15插件，可通过斑点检测获取细胞核质心位置。我们首先在FIJI中将显微镜获取的tif文件转换为xml/hdf5格式，然后使用Mastodon插件创建新项目。在插件中，我们选择斑点检测选项，定义覆盖外植体的感兴趣区域，并采用高斯差分检测器（直径为5 µm，质量因子为25）进行斑点识别。随后，我们将细胞核质心位置数据导入MATLAB，并利用内置函数（convhull）生成凸包（图3B），以表征外植体的几何形态。该方法同样显示了外植体随时间逐渐变圆的过程（图3B）。细胞核数据还可用于通过三维追踪量化细胞运动以及细胞数量随时间的变化。另一方面，utrophin通道可用于量化外植体变圆过程中细胞形态的变化。综合而言，这些参数对于表征体节的内在材料特性具有重要价值，有助于建立描述组织尺度形态变化的有效物理模型。

外植体还可用于定量表征与邻近组织之间的接触应力。为说明这一点，我们手动分离了两个体节并将其置于彼此靠近的位置，观察其动态变化（N = 2）。在本实验中，体节相对于 体内 身体轴线未被追踪。有趣的是，随着时间推移，分离的体节沿一个表面相互黏附，而游离表面（即远离接触位点的区域）则发生回缩变圆图4这表明，在外植体的接触位点，黏附力克服了由表面张力产生的应力。这一现象可通过上述方法追踪形态变化，并通过随时间定量三维条件下两组织间的接触角进一步表征。因此，外植体为量化导致特定组织形态的竞争性作用力提供了一个理想的系统，其生物学意义亦可由此进一步探究 体内.

胚胎发育阶段，显微镜图像显示细胞结构，带标注的切片。
图1：单个体节外植体的制备。 首先去除斑马鱼胚胎的绒毛膜（A→B），随后去除皮肤和卵黄（C）。接着通过去除其余组织，选择含有体节的胚胎区域（D, E）。然后逐步切除目标体节周围的区域（F-H），最终分离出单个体节（I），并使用光片显微镜进行延时成像（此处显示体节的中间Z层面）（J）。缩写：S = 体节；N = 脊索；LPM = 侧板中胚层；A = 前部；P = 后部。虚线表示切割位置。比例尺 = 50 µm（所有图中）。 请点击此处查看该图的放大版本。

用于光学研究的成像室及FEP膜装置；膜尺寸示意图。
图2：光片成像室的组装。 （A-D）将FEP膜条（尺寸见（B））缠绕在膜支架上，安装到成像室上，并将膜粘接到成像室上。（E-F）次日，取下膜支架，在成像室中央的低熔点琼脂糖中放置一个成像模具（尺寸见（E））。整个装置在4 °C下放置30分钟，随后取出模具，将带有凹槽的成像室用于外植体的成像。 请点击此处查看该图的放大版本。

利用荧光标记进行组织块轮廓和细胞核分布分析，3D图示，空间分析。
图3：组织形态的三维分析。（A）利用荧光标记的utrophin（Utr::mCherry）显示细胞轮廓，利用荧光标记的组蛋白（H2B::GFP）显示细胞核。使用MATLAB在多个深度对手工分割的组织块轮廓进行标记，并在此展示。（B）在同一组织块中，使用FIJI插件Mastodon检测细胞核（红色），并进行凸包分析（青色），以反映组织块的几何形态。注意两种分析均显示出组织块趋于圆形化。请点击此处查看该图的放大版本。

显示44分钟内细胞分裂过程的延时显微图像，突出展示动态的细胞变化。
图4：分离的体节相互黏附。从胚胎中分离出的两个体节经人工置于相邻位置后，随时间推移倾向于相互黏附（N = 2）。使用光片显微镜以每2分钟一帧的时间间隔获取多个z轴层面图像，此处展示的是选定时间点体节的中间切面。细胞轮廓通过荧光标记的乌特罗菲（Utrophin，Utr::mCherry）进行可视化。比例尺 = 25 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

体节发生领域长期以来主要关注分割钟在胚胎发育过程中决定体节长度的作用。然而，同样重要的是要考虑组织力学在决定最终体节形态中的作用。本文所述的方案允许分离单个体节，从而可在脱离胚胎的条件下独立研究其内在的物理特性。然而，由于手工制备的限制，每次成像实验通常只能获得四到六个体节。该方案涉及在不使用任何酶辅助组织去除的情况下，对胚胎中的多种组织进行精细的解剖操作，因此可能需要数周的练习才能熟练掌握解剖过程。在我们实际操作中， 方案中的关键步骤包括仔细去除体节外植体的皮肤和卵黄，以防止在操作的不同阶段外植体粘附于所使用的工具，从而有助于更顺利地依次去除体节周围的组织。

可在中间步骤停止解剖方案，以获得仅附着于周围组织之一的体节，或获得成组体节的外植体。该方法可依次逐步去除组织，从而研究邻近组织在促进体节或邻近组织形态变化中的作用。另一方面，利用本方案可使单个外植组织贴壁并发生机械性自组织，例如将两个外植体节置于相近位置时所展示的结果。

采用该方法制备的外植体在缓冲液中无需添加任何成分或施加约束，即可在数小时内维持存活。然而，可设想将其培养于水凝胶中，并在外部约束条件下观察其动态行为，从而模拟体节所经历的接触应力。 体内此外，外植体可通过原子力显微镜、移液管抽吸或使用微机器人工具直接检测其材料特性。16最后，我们预计该方法可轻松适用于培养和研究处于相似发育阶段的其他组织，如脊索、神经板和侧板中胚层。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

我们感谢Oates实验室成员对本实验方案提出的建议，以及洛桑联邦理工学院（École polytechnique fédérale de Lausanne, EPFL）鱼类设施的支持。特别感谢Laurel Ann Rohde在解剖方案中关于皮肤和卵黄去除方面的宝贵建议；感谢Arianne Bercowsky Rama建立了通过Mastodon处理光片显微成像数据集的高效流程；感谢Jean-Yves Tinevez开发了开源的Mastodon软件；感谢Marko Popović在数据分析方面提供的建议；感谢Chloé Jollivet、Guillaume Valentin和Florian Lang在鱼类设施中提供的大量支持；感谢Petr Strnad和Andrea Boni搭建了光片显微镜，并在光片成像技术方面提供了指导。本研究工作由EPFL资助，S.R.N.获得了人类前沿科学计划（Human Frontier Science Program）的长期博士后奖学金（LT000078/2016）支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖Sigma9012-36-6用于包被培养皿底部
低凝胶温度琼脂糖Sigma39346-81-1用于制备Viventis成像室
相机AndorAndor Zyla 4.2 Plus用于光片显微镜中的图像采集
检测物镜NikonNikon CFI75 Apo LWD 25x/1.1 NA用于成像外植体
FEP膜条Lohmann Technologies UK LtdDupont FEP Fluorocarbon film, 200A用于制备Viventis成像室
精细镊子DumontDumont 5SF 11252-00用于去除胚胎皮肤
镊子DumontDumont 55用于去除胚胎的绒毛膜
Leibovitz L-15培养基Gibco21083-027外植体培养培养基
光片显微镜ViventisLS1 live用于成像外植体
微型刀具Fine Science Tools10318-14用于在胚胎上做切口
硅橡胶配方材料Wacker Chemie AGSilpuran 4200用于制备Viventis成像室

参考文献

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