在本方案中,与重组 SARS-CoV-2 刺突蛋白结合的量子点可用于基于细胞的检测,以监测刺突蛋白在质膜上与 hACE2 的结合,以及随后结合蛋白内吞进入细胞质的过程。
方法文章
在本方案中,与重组 SARS-CoV-2 刺突蛋白结合的量子点可用于基于细胞的检测,以监测刺突蛋白在质膜上与 hACE2 的结合,以及随后结合蛋白内吞进入细胞质的过程。
新型细胞荧光显微技术的发展推动了药物发现领域的高通量筛选方法。量子点是一类具有优异光物理特性的荧光纳米颗粒,表现出明亮且稳定的光致发光以及窄发射带。量子点呈球形结构,通过适当修饰其表面化学性质,可实现与生物分子的偶联,用于细胞相关应用。这些光学特性,结合其与生物分子功能化的能力,使其成为研究受体-配体相互作用和细胞内转运过程的理想工具。本文介绍一种利用量子点追踪SARS-CoV-2刺突蛋白结合与内吞作用的方法。本实验方案可为希望利用量子点研究蛋白质-蛋白质相互作用及其在细胞生理环境下转运过程的实验人员提供参考指南。
荧光显微镜技术使研究人员能够利用特异性染料观察细胞内部的精细结构与动态过程1,基因编码的荧光蛋白2,以及以量子点(QDs)形式存在的荧光纳米颗粒3对于2019年严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-2)的全球大流行,研究人员已采用荧光显微镜技术来研究该病毒在细胞质膜和细胞质中与细胞相互作用的机制。例如,研究人员已能够深入了解病毒颗粒表面的SARS-CoV-2刺突蛋白与人源血管紧张素转换酶2(hACE2)在人细胞表面的结合过程以及随后的内化过程 通过 质膜融合,以及Spike:hACE2蛋白复合物的内吞作用4,5对SARS-CoV-2从细胞中出胞的过程也获得了重要见解 通过 利用细胞荧光成像技术观察冠状病毒特有的一种此前被认为存在的溶酶体特征 通过 传统的高尔基体囊泡出芽方式,与其他许多病毒相同6细胞荧光显微技术作为几乎所有生物学研究领域的核心技术,其应用范围和广度已不断拓展,从全动物的超分辨率成像到用于药物筛选的自动化高内涵多参数成像均有涉及。本文采用自动化高内涵共聚焦显微技术,结合荧光量子点标记的SARS-CoV-2病毒刺突蛋白,研究该病毒的细胞入侵过程。
利用生物成像平台生成的图像进行高内涵分析,能够比使用多模式微孔板读数仪获得的单个参数(如整孔荧光强度)提取出更多有价值的生物学信息7。通过使用自动分割算法对视野中的对象进行分离,可针对每个对象或对象群体,在各可用的荧光通道中分析其强度、面积和纹理等参数8。将多个测量指标整合为多变量数据集,是进行表型分析的有效方法。当目标表型明确时,例如以点状结构形式存在的量子点(QD)内化现象,可利用与点状结构相关的参数(如大小、数量和强度)来评估处理措施的有效性。
基于云的高内涵成像分析软件可兼容多种仪器数据输出,包括高内涵成像平台。通过使用基于云的服务器进行图像存储和在线分析,用户可以从成像仪器或数据存储的网络驱动器上传其数据。该实验方案的分析部分在云软件环境中进行,分析结果可导出为多种文件格式,用于后续的数据可视化。
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)由非结构蛋白和结构蛋白组成,这些蛋白有助于病毒的组装与复制。SARS-CoV-2刺突蛋白包含两个结构域,称为S1和S2,其中S1含有受体结合域,负责与细胞质膜上的hACE2相互作用9。研究还发现,刺突蛋白可与细胞质膜上的其他分子相互作用,这些分子可能作为除hACE2之外的共受体10,11。在整个刺突蛋白序列中,特别是在S1/S2交界区域,存在蛋白酶切割位点,可在跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)作用下实现膜融合12。目前已有多种重组SARS-CoV-2刺突蛋白产品,包括来自不同商业供应商的单独受体结合域、S1、S2、S1+S2以及完整的刺突三聚体蛋白,用于科研活动13。
在本研究中,量子点(QD)表面被修饰以含有组氨酸标签的重组刺突蛋白三聚体(QD-Spike)。美国海军研究实验室光学纳米材料部门制备的量子点具有硒化镉核心和硫化锌外壳14,15。量子点表面的锌可与重组蛋白中的组氨酸残基配位,形成在形态和功能上均模拟SARS-CoV-2病毒颗粒的功能化量子点。此前已有文献描述过利用量子点偶联受体结合域制备此类纳米颗粒及蛋白偶联的方法15。本方法详细说明了细胞培养准备、量子点处理、图像采集以及数据分析的实验流程,可指导研究人员在人源细胞的生理环境中研究SARS-CoV-2刺突蛋白的活性。
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本研究中使用的 HEK293T 细胞系是一种永生化细胞系。本研究未使用人类或动物受试者。
1. 细胞培养与接种
2. 使用 QD-Spike 处理细胞
3. 固定与细胞核染色
4. 采集设置与成像
5. 数据分析
6. 导出数据
7. 在电子表格中分析数据
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经处理后,量子点(QDs)会被细胞内化,因为纳米颗粒会与细胞质膜上的ACE2结合并诱导内吞作用。利用表达ACE2-GFP的细胞系,可通过荧光显微镜观察QDs与ACE2的转位过程。一旦被内化,QD与ACE2信号表现出强烈的共定位。基于这些图像,可进行图像分割及后续分析,以提取相关参数,例如斑点数量(图1,图2B)。图1A为经不同浓度QD-Spike处理或仅用培养基作为对照的细胞拼接图像。实验使用了三个通道:数字相差(DPC)、FITC以及自定义的QD通道(激发波长405 nm,发射波长608 nm)。DPC提供细胞整体形态的图像,可大致反映整个细胞的形态结构。感兴趣区域与DPC信号重叠,足以用于检测内化的QDs。FITC通道显示ACE2-GFP的定位发生变化,并在与QD-Spike共定位的区域发生聚集。随着QD-Spike浓度降低,QDs不再可见,ACE2-GFP信号与对照组相似。合并通道展示了ACE2-GFP与QD-Spike的共定位情况。这些结构包括斑点状和...
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本文所述方法提供了使用高通量共聚焦显微镜对人细胞中功能化量子点(QDs)进行成像的必要步骤。该方法最适合用于以内吞作用为主要病毒入侵途径而非依赖TMPRSS2和膜融合的细胞,因为它能够研究SARS-CoV-2刺突蛋白(Spike)与hACE2的内吞过程。由于量子点模型的特性以及商品化刺突三聚体上存在的C端His标签,任何由TMPRSS2对刺突蛋白S1和S2结构域的切割都将导致量子点仅保留在S2结构域上12。鉴于受体结合域(RBD)位于S1中,这可能会阻止内化过程的发生。因此,如果细胞表面事件的顺序是精确发生的,即hACE2首先结合,随后TMPRSS2切割刺突蛋白,则预期结果为无内化现象的阴性信号。
由于本实验方案涉及细胞过程的成像,培养的细胞必须能够允许病毒感染,并表达hACE2。可通过瞬时转染将hACE2导入细胞,或构建稳定表达hACE2的细胞系17。建议使用抗hACE2抗体进行免疫荧光实验,以验证hACE2的表达与定位,除非hACE2带有荧光蛋白标签(如GFP),可在显微镜下直接观察...
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作者声明无利益冲突。
本研究部分得到了美国国立卫生研究院转化科学促进中心院内研究计划的支持。海军研究实验室提供了资金资助 通过 其内部的纳米科学研究所。试剂制备得到了支持 通过 NRL 新冠肺炎基础基金
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 32% 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15714 | 用于量子点处理后细胞的固定,终浓度为 3.2% 用于在Opti-MEM I中稳定量子点并防止非特异性相互作用,终浓度为 0.1% |
| 7.5% 牛血清白蛋白 | Gibco | 15260-037 | 用作荧光细胞计数的细胞活力染料 |
| 吖啶橙/碘化丙啶染色剂 | Logos Biosystems | F23001 | 用于接种细胞和检测QD-Spike的微孔板 |
| 黑色透明底96孔聚-D-赖氨酸包被板 | Greiner | 655946 | 用于支持细胞培养,DMEM补充剂 |
| 经鉴定的胎牛血清 | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | 基于云的高内涵图像分析软件;V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | 用于细胞固定后细胞核和细胞体的标记,深红色核染料 |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | HEK293T细胞培养的基础培养基 |
| 杜尔贝科改良必需培养基,D-葡萄糖(4.5g/L),L-谷氨酰胺,丙酮酸钠(110 mg/L),酚红 | Gibco | 11995-065 | 用于从Columbus导出数据后的数据整理;V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | 用于继续筛选hACE2-GFP阳性细胞,DMEM补充剂 |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | 稳定表达与GFP标记的人血管紧张素转换酶2的HEK293T人胚胎肾细胞系 |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | 全自动细胞计数仪 |
| Luna全自动细胞计数仪 | Logos Biosystems | NA | 用于荧光细胞计数 |
| Luna细胞计数载片 | Logos Biosystems | L12001 | 高内涵成像平台 |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | 成像培养基,用于细胞与量子点共孵育 |
| Opti-MEM I减血清培养基 | Gibco | 11058-021 | 不含钙和镁的磷酸盐缓冲液,用于传代和检测过程中细胞的洗涤 |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | 用于防止细胞培养中的细菌污染,DMEM补充剂 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | 用于作图、数据可视化和统计分析;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | 用于检测SARS-CoV-2刺突蛋白与hACE2的结合及刺突蛋白内吞的监测 |
| 量子点608 nm-刺突蛋白(QD608-Spike) | 由美国海军研究实验室定制 | 用于抑制SARS-CoV-2刺突蛋白与hACE2的结合 | |
| SARS-CoV-2(2019-nCoV)刺突蛋白中和抗体,小鼠单克隆抗体 | Sino Biological | 40592-MM57 | 用于传代过程中使细胞从培养瓶中解离 |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
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