高通量共聚焦成像技术观察量子点标记的SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体在HEK293T细胞中的结合与内吞过程

摘要

在本方案中，与重组 SARS-CoV-2 刺突蛋白结合的量子点可用于基于细胞的检测，以监测刺突蛋白在质膜上与 hACE2 的结合，以及随后结合蛋白内吞进入细胞质的过程。

摘要

新型细胞荧光显微技术的发展推动了药物发现领域的高通量筛选方法。量子点是一类具有优异光物理特性的荧光纳米颗粒，表现出明亮且稳定的光致发光以及窄发射带。量子点呈球形结构，通过适当修饰其表面化学性质，可实现与生物分子的偶联，用于细胞相关应用。这些光学特性，结合其与生物分子功能化的能力，使其成为研究受体-配体相互作用和细胞内转运过程的理想工具。本文介绍一种利用量子点追踪SARS-CoV-2刺突蛋白结合与内吞作用的方法。本实验方案可为希望利用量子点研究蛋白质-蛋白质相互作用及其在细胞生理环境下转运过程的实验人员提供参考指南。

引言

荧光显微镜技术使研究人员能够利用特异性染料观察细胞内部的精细结构与动态过程¹，基因编码的荧光蛋白²，以及以量子点（QDs）形式存在的荧光纳米颗粒³对于2019年严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV-2）的全球大流行，研究人员已采用荧光显微镜技术来研究该病毒在细胞质膜和细胞质中与细胞相互作用的机制。例如，研究人员已能够深入了解病毒颗粒表面的SARS-CoV-2刺突蛋白与人源血管紧张素转换酶2（hACE2）在人细胞表面的结合过程以及随后的内化过程 通过 质膜融合，以及Spike:hACE2蛋白复合物的内吞作用^4,5对SARS-CoV-2从细胞中出胞的过程也获得了重要见解 通过 利用细胞荧光成像技术观察冠状病毒特有的一种此前被认为存在的溶酶体特征 通过 传统的高尔基体囊泡出芽方式，与其他许多病毒相同⁶细胞荧光显微技术作为几乎所有生物学研究领域的核心技术，其应用范围和广度已不断拓展，从全动物的超分辨率成像到用于药物筛选的自动化高内涵多参数成像均有涉及。本文采用自动化高内涵共聚焦显微技术，结合荧光量子点标记的SARS-CoV-2病毒刺突蛋白，研究该病毒的细胞入侵过程。

利用生物成像平台生成的图像进行高内涵分析，能够比使用多模式微孔板读数仪获得的单个参数（如整孔荧光强度）提取出更多有价值的生物学信息⁷。通过使用自动分割算法对视野中的对象进行分离，可针对每个对象或对象群体，在各可用的荧光通道中分析其强度、面积和纹理等参数⁸。将多个测量指标整合为多变量数据集，是进行表型分析的有效方法。当目标表型明确时，例如以点状结构形式存在的量子点（QD）内化现象，可利用与点状结构相关的参数（如大小、数量和强度）来评估处理措施的有效性。

基于云的高内涵成像分析软件可兼容多种仪器数据输出，包括高内涵成像平台。通过使用基于云的服务器进行图像存储和在线分析，用户可以从成像仪器或数据存储的网络驱动器上传其数据。该实验方案的分析部分在云软件环境中进行，分析结果可导出为多种文件格式，用于后续的数据可视化。

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）由非结构蛋白和结构蛋白组成，这些蛋白有助于病毒的组装与复制。SARS-CoV-2刺突蛋白包含两个结构域，称为S1和S2，其中S1含有受体结合域，负责与细胞质膜上的hACE2相互作用⁹。研究还发现，刺突蛋白可与细胞质膜上的其他分子相互作用，这些分子可能作为除hACE2之外的共受体^10,11。在整个刺突蛋白序列中，特别是在S1/S2交界区域，存在蛋白酶切割位点，可在跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）作用下实现膜融合¹²。目前已有多种重组SARS-CoV-2刺突蛋白产品，包括来自不同商业供应商的单独受体结合域、S1、S2、S1+S2以及完整的刺突三聚体蛋白，用于科研活动¹³。

在本研究中，量子点（QD）表面被修饰以含有组氨酸标签的重组刺突蛋白三聚体（QD-Spike）。美国海军研究实验室光学纳米材料部门制备的量子点具有硒化镉核心和硫化锌外壳^14,15。量子点表面的锌可与重组蛋白中的组氨酸残基配位，形成在形态和功能上均模拟SARS-CoV-2病毒颗粒的功能化量子点。此前已有文献描述过利用量子点偶联受体结合域制备此类纳米颗粒及蛋白偶联的方法¹⁵。本方法详细说明了细胞培养准备、量子点处理、图像采集以及数据分析的实验流程，可指导研究人员在人源细胞的生理环境中研究SARS-CoV-2刺突蛋白的活性。

方案

本研究中使用的 HEK293T 细胞系是一种永生化细胞系。本研究未使用人类或动物受试者。

1. 细胞培养与接种

1. 在无菌生物安全柜内，穿戴个人防护装备（包括实验手套、实验服和护目镜），通过向杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（P/S）和250 µg/mL G418，配制细胞培养基。
   1. 配制500 mL培养基时，加入443.75 mL DMEM、50 mL FBS、5 mL P/S和1.25 mL G418。
   2. 使用0.2 µm滤膜滤瓶过滤，并保持无菌状态，避免细菌污染。
2. 在无菌生物安全柜内，将20,000个细胞悬浮于100 µL细胞培养基中，接种至黑色、透明底、聚-D-赖氨酸包被的96孔板的内部60个孔中；在外部36个孔中每孔加入100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）。
   1. 细胞计数时，向18 µL细胞悬液中加入2 µL吖啶橙和碘化丙啶染色剂。
   2. 取10 µL该溶液加入细胞计数载片的一侧加样区。
   3. 重复步骤1.2.1和1.2.2，使载片两侧均完成加样。
   4. 将载片放入自动细胞计数仪中。
   5. 选择荧光计数程序，点击计数。对载片两侧进行计数，并计算两个活细胞密度的平均值。
   6. 计算所需细胞悬液体积：将所需细胞总数除以平均细胞密度。
3. 接种后在光学显微镜下检查各孔，确保达到适当的细胞密度和均匀分布。
4. 将培养板置于37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中过夜培养。

2. 使用 QD-Spike 处理细胞

1. 通过成像培养基稀释，制备0.1%牛血清白蛋白（BSA）。
   1. 对于10 mL成像培养基，加入130 µL的7.5% BSA并混匀。
2. 在12孔储液槽或检测板中，使用含0.1% BSA的成像培养基将440 nM QD-Spike（SARS-CoV-2，分离株USA-WA1/2020）储备液稀释至20 nM。
   1. 对于1个孔的QD-Spike，将2.27 µL的440 nM QD-Spike加入47.73 µL含0.1% BSA的成像培养基中，终浓度为20 nM。
   2. 进行六点1:3倍比稀释（每点设三个重复），将14.26 µL QD-Spike加入285.74 µL含0.1% BSA的成像培养基中，配制最高浓度20 nM的溶液；取100 µL 20 nM QD-Spike加入200 µL含0.1% BSA的成像培养基中，得到第二浓度点6.67 nM QD-Spike；重复此步骤四次，共获得六个浓度点。
3. 使用多通道移液器吸除各孔中的全部废弃培养基；使用多通道移液器用成像培养基洗涤一次（每孔100 µL）。
4. 吸除每孔100 µL成像培养基，再向每孔回加50 µL QD-Spike溶液。
5. 将板置于37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中孵育3小时。随后进入第4步。

3. 固定与细胞核染色

1. 在无菌生物安全柜内，穿戴个人防护装备（包括实验手套、实验服和护目镜），用含0.1% BSA的成像培养基配制4%多聚甲醛（PFA）溶液。
2. 从每个孔中吸出50 µL QD-Spike溶液，并向每孔加入100 µL的4% PFA。
   1. 切勿让孔板干燥。建议使用自动化多通道移液器以避免孔内液体干燥。
3. 室温孵育15分钟。
4. 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次。
5. 将5 mM的深红色核染料原液用PBS稀释1000倍，配制工作液。
6. 吸去PBS，每孔加入50 µL稀释后的核染料。
7. 室温孵育30分钟。
8. 用PBS洗涤三次。
9. 立即成像或使用板封膜密封后于日后成像。将板置于4 °C保存，荧光信号可稳定数周以上。

4. 采集设置与成像

1. 启动成像平台的软件。打开高内涵成像平台，状态栏上的指示灯应亮起。如果设备未连接，软件将进入离线分析模式。
2. 登录成像平台。
3. 创建新的采集方案。
   1. 选择板类型 为96孔透明底成像板。
      注意：仪器中的板类型选择可能有所不同，可通过加载正确的板定义进行自定义，这些定义包括板的尺寸参数，如高度、宽度及其他用于定义孔间距和焦点位置的距离。
   2. 选择光学模式为共聚焦，放大倍数为40倍水浸物镜。
   3. 选择像素合并（Binning）为1。
   4. 按照步骤4.3.5–4.3.8所述选择通道及荧光激发/发射波长。设置完成后拍摄快照以查看图像，并确保设置合适。
      注意：数字相差成像（DPC）可在无需细胞染色或荧光染料的情况下实现活细胞的可视化。不建议用于固定细胞。
   5. 为DPC选择合适的模式，例如高对比度模式，以获得轮廓清晰的细胞形态。拍摄快照以确认该设置是否合适，可通过图像窗口进行观察。
   6. 选择FITC通道，用于ACE2-GFP细胞系，以便可视化细胞内ACE2的转运过程。
   7. 若需为量子点（QD）通道创建自定义通道，请点击该通道的三角形下拉菜单，选择激发波长在405 nm范围、发射波长在608 nm范围的设置。
   8. 若细胞已固定并使用了深红色核染料，则选择远红通道，其发射波长大于630 nm，可用于进一步界定细胞轮廓并作为细胞掩膜。
   9. 选择一个具有较强胞质QD信号的孔，用于设定曝光时间、激光功率和Z轴高度位置。请参照步骤4.3.10–4.3.13进行操作。
   10. 检查默认高度是否能生成细胞处于理想焦平面的图像。若目标细胞器为内吞的点状结构，则Z轴位置应低于以质膜为目标细胞器时的位置。
   11. 选择一个曝光时间，使图像明亮，且灰度值至少为背景信号的三倍以上。通常该时间在100至300 ms之间。在20 nM浓度下，使用200 ms曝光时间和80%激光功率时，灰度值应约为6000 a.u.。
   12. 通过在各通道使用“快照”功能生成的图像上右键单击，并选择显示强度，来检查灰度值。然后左键单击目标对象或背景区域，查看对应像素的灰度值。
   13. 调节激光功率，以微调目标对象的强度。
4. 保存采集方案。
5. 切换至运行实验，并输入板名称。
6. 运行实验。

5. 数据分析

1. 将数据导入成像软件。
   1. 获取所有图像后，将测量结果导出至成像软件。此过程需要预先建立服务器并创建账户。创建一个屏幕用于将数据导出到成像软件中。
2. 在成像软件中，选择 图像分析 以开始构建分析方案。
3. 通过在屏幕列表中右键单击文件并点击 选择，加载成像实验的测量数据。成像孔及其对应视野的板图应显示在窗口左下角。
4. 选择一个细胞质中具有明亮量子点（QD）信号的孔，以开始图像分割。
5. 在 输入图像模块 中，选择 平场校正。
6. 通过选择 识别细胞核，向方案中添加下一个模块。
   1. 此处使用DPC或远红通道作为细胞核标记。
   2. 首先选择能够准确分割目标的方法，然后通过下拉菜单和滑块调节进一步优化分割效果。
      注意：良好的分割应能准确定义细胞核、细胞和斑点的兴趣区域（ROI）。每个ROI内仅应包含标记物阳性的像素，背景信号应被排除。若ROI中包含了背景信号，可降低方法的灵敏度或提高强度阈值，以增强分割算法的严谨性。此原则适用于所有“识别”模块。
7. 接下来，添加 识别细胞质模块 以确定细胞质区域。
   1. 在此情况下，使用ACE2-GFP通道进行细胞质分割。
   2. 选择最能准确识别每个细胞细胞质的方法。
8. 随后，添加 识别斑点模块 以识别量子点-刺突蛋白（QD-Spike）点状信号。
   1. 选择 细胞核 作为ROI群体。
   2. 选择 细胞 作为ROI区域，以捕获整个细胞内的点状信号。
   3. 选择最能准确识别每个细胞中量子点斑点的方法。
9. 当该孔中所有目标均被准确分割和识别后，选择其他孔进行验证，以确保所用模块和参数设置可普遍适用于其他孔及其他实验条件。
10. 为所有已分割的目标（细胞核、细胞质/细胞和斑点）添加 计算强度属性。
11. 为所有已分割的目标（细胞核、细胞质/细胞和斑点）添加 计算形态学属性。
12. 为所有已分割的目标（细胞核、细胞质/细胞和斑点）添加 计算纹理属性。
13. 通过为各群体（包括细胞核和斑点）选择相应参数来定义结果。目标数量可作为细胞活力的间接衡量指标。

6. 导出数据

1. 单击批量分析。在进入下一步（步骤6.2）之前，请等待分析完成。
   注意：批量分析允许图像分析软件服务器加载分析协议，并使用选定的测量参数对数据进行远程分析。
2. 将数据集导出到本地计算机或网络驱动器。
   1. 通过下载并打开连接文件，将图像分析软件与计算机上的辅助应用程序连接。
   2. 选择结果文件类型（.txt、.csv、.html 或原生 XML）。
   3. 使用下拉菜单选择文件夹设置。

7. 在电子表格中分析数据

1. 打开导出的文件。如果文件为 .csv 格式，请将其另存为 .xls 文件格式，以便使用数据透视表。如果文件路径过长，请将 .xls 文件保存在文件夹层级结构中更上层的位置，以避免保存时出错。
2. 在电子表格中添加列，用于标明每个孔的实验条件。例如，细胞类型、QD-Spike 变体、QD-Spike 浓度、孵育时间等。
3. 选择数据透视表功能，并以添加的条件作为行，以测量参数作为列来构建表格。为每个参数选择相应的计算方式，例如平均值、标准差、中位数、最小值、最大值或计数。
4. 将数据归一化至对照样本，其中未结合的量子点（QDs）设为 0%，最高浓度的 QD-Spike 设为 100%。
   注意：若评估中和抗体等抑制剂的效果，应将数据归一化至仅含培养基处理的细胞（100% 效能）和不含抑制剂的 QD-Spike 处理组（0% 效能）。
5. 使用绘图软件绘制数据图表。

结果

经处理后，量子点（QDs）会被细胞内化，因为纳米颗粒会与细胞质膜上的ACE2结合并诱导内吞作用。利用表达ACE2-GFP的细胞系，可通过荧光显微镜观察QDs与ACE2的转位过程。一旦被内化，QD与ACE2信号表现出强烈的共定位。基于这些图像，可进行图像分割及后续分析，以提取相关参数，例如斑点数量（图1，图2B）。图1A为经不同浓度QD-Spike处理或仅用培养基作为对照的细胞拼接图像。实验使用了三个通道：数字相差（DPC）、FITC以及自定义的QD通道（激发波长405 nm，发射波长608 nm）。DPC提供细胞整体形态的图像，可大致反映整个细胞的形态结构。感兴趣区域与DPC信号重叠，足以用于检测内化的QDs。FITC通道显示ACE2-GFP的定位发生变化，并在与QD-Spike共定位的区域发生聚集。随着QD-Spike浓度降低，QDs不再可见，ACE2-GFP信号与对照组相似。合并通道展示了ACE2-GFP与QD-Spike的共定位情况。这些结构包括斑点状和...

讨论

本文所述方法提供了使用高通量共聚焦显微镜对人细胞中功能化量子点（QDs）进行成像的必要步骤。该方法最适合用于以内吞作用为主要病毒入侵途径而非依赖TMPRSS2和膜融合的细胞，因为它能够研究SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike）与hACE2的内吞过程。由于量子点模型的特性以及商品化刺突三聚体上存在的C端His标签，任何由TMPRSS2对刺突蛋白S1和S2结构域的切割都将导致量子点仅保留在S2结构域上¹²。鉴于受体结合域（RBD）位于S1中，这可能会阻止内化过程的发生。因此，如果细胞表面事件的顺序是精确发生的，即hACE2首先结合，随后TMPRSS2切割刺突蛋白，则预期结果为无内化现象的阴性信号。

由于本实验方案涉及细胞过程的成像，培养的细胞必须能够允许病毒感染，并表达hACE2。可通过瞬时转染将hACE2导入细胞，或构建稳定表达hACE2的细胞系¹⁷。建议使用抗hACE2抗体进行免疫荧光实验，以验证hACE2的表达与定位，除非hACE2带有荧光蛋白标签（如GFP），可在显微镜下直接观察...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
32% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15714	用于量子点处理后细胞的固定，终浓度为 3.2% 用于在Opti-MEM I中稳定量子点并防止非特异性相互作用，终浓度为 0.1%
7.5% 牛血清白蛋白	Gibco	15260-037	用作荧光细胞计数的细胞活力染料
吖啶橙/碘化丙啶染色剂	Logos Biosystems	F23001	用于接种细胞和检测QD-Spike的微孔板
黑色透明底96孔聚-D-赖氨酸包被板	Greiner	655946	用于支持细胞培养，DMEM补充剂
经鉴定的胎牛血清	Cytiva/HyClone	SH30071.03	基于云的高内涵图像分析软件；V2.9.1
Columbus Analyzer	Perkin Elmer	NA	用于细胞固定后细胞核和细胞体的标记，深红色核染料
DRAQ5 (5 mM)	ThermoFisher Scientific	62252	HEK293T细胞培养的基础培养基
杜尔贝科改良必需培养基，D-葡萄糖（4.5g/L），L-谷氨酰胺，丙酮酸钠（110 mg/L），酚红	Gibco	11995-065	用于从Columbus导出数据后的数据整理；V2110 Microsoft 365
Excel	Microsoft	NA	用于继续筛选hACE2-GFP阳性细胞，DMEM补充剂
G418	InvivoGen	ant-gn-5	稳定表达与GFP标记的人血管紧张素转换酶2的HEK293T人胚胎肾细胞系
HEK293T hACE2-GFP	Codex Biosolutions	CB-97100-203	全自动细胞计数仪
Luna全自动细胞计数仪	Logos Biosystems	NA	用于荧光细胞计数
Luna细胞计数载片	Logos Biosystems	L12001	高内涵成像平台
Opera Phenix	Perkin Elmer	NA	成像培养基，用于细胞与量子点共孵育
Opti-MEM I减血清培养基	Gibco	11058-021	不含钙和镁的磷酸盐缓冲液，用于传代和检测过程中细胞的洗涤
PBS -/-	Gibco	10010-023	用于防止细胞培养中的细菌污染，DMEM补充剂
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	用于作图、数据可视化和统计分析；V9.1.0
Prism	GraphPad	NA	用于检测SARS-CoV-2刺突蛋白与hACE2的结合及刺突蛋白内吞的监测
量子点608 nm-刺突蛋白（QD608-Spike）	由美国海军研究实验室定制		用于抑制SARS-CoV-2刺突蛋白与hACE2的结合
SARS-CoV-2（2019-nCoV）刺突蛋白中和抗体，小鼠单克隆抗体	Sino Biological	40592-MM57	用于传代过程中使细胞从培养瓶中解离
TrypLE Express	Gibco	12605-010