高通量共聚焦成像技术观察量子点标记的SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体在HEK293T细胞中的结合与内吞过程

摘要

在本方案中，与重组 SARS-CoV-2 刺突蛋白结合的量子点可用于基于细胞的检测，以监测刺突蛋白在质膜上与 hACE2 的结合，以及随后结合蛋白内吞进入细胞质的过程。

摘要

新型细胞荧光显微技术的发展推动了药物发现领域的高通量筛选方法。量子点是一类具有优异光物理特性的荧光纳米颗粒，表现出明亮且稳定的光致发光以及窄发射带。量子点呈球形结构，通过适当修饰其表面化学性质，可实现与生物分子的偶联，用于细胞相关应用。这些光学特性，结合其与生物分子功能化的能力，使其成为研究受体-配体相互作用和细胞内转运过程的理想工具。本文介绍一种利用量子点追踪SARS-CoV-2刺突蛋白结合与内吞作用的方法。本实验方案可为希望利用量子点研究蛋白质-蛋白质相互作用及其在细胞生理环境下转运过程的实验人员提供参考指南。

引言

荧光显微镜技术使研究人员能够利用特异性染料观察细胞内部的精细结构与动态过程¹，基因编码的荧光蛋白²，以及以量子点（QDs）形式存在的荧光纳米颗粒³对于2019年严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV-2）的全球大流行，研究人员已采用荧光显微镜技术来研究该病毒在细胞质膜和细胞质中与细胞相互作用的机制。例如，研究人员已能够深入了解病毒颗粒表面的SARS-CoV-2刺突蛋白与人源血管紧张素转换酶2（hACE2）在人细胞表面的结合过程以及随后的内化过程 通过 质膜融合，以及Spike:hACE2蛋白复合物的内吞作用^4,5对SARS-CoV-2从细胞中出胞的过程也获得了重要见解 通过 利用细胞荧光成像技术观察冠状病毒特有的一种此前被认为存在的溶酶体特征 通过 传统的高尔基体囊泡出芽方式，与其他许多病毒相同⁶细胞荧光显微技术作为几乎所有生物学研究领域的核心技术，其应用范围和广度已不断拓展，从全动物的超分辨率成像到用于药物筛选的自动化高内涵多参数成像均有涉及。本文采用自动化高内涵共聚焦显微技术，结合荧光量子点标记的SARS-CoV-2病毒刺突蛋白，研究该病毒的细胞入侵过程。

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方案

本研究中使用的 HEK293T 细胞系是一种永生化细胞系。本研究未使用人类或动物受试者。

1. 细胞培养与接种

1. 在无菌生物安全柜内，穿戴个人防护装备（包括实验手套、实验服和护目镜），通过向杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（P/S）和250 µg/mL G418，配制细胞培养基。
   1. 配制500 mL培养基时，加入443.75 mL DMEM、50 mL FBS、5 mL P/S和1.25 mL G418。
   2. 使用0.2 µm滤膜滤瓶过滤，并保持无菌状态，避免细菌污染。
2. 在无菌生物安全柜内，将20,000个细胞悬浮于100 µL细胞培养基中，接种至黑色、透明底、聚-D-赖氨酸包被的96孔板的内部60个孔中；在外部36个孔中每孔加入100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）。
   1. 细胞计数时，向18 µL细胞悬液中加入2 µL吖啶橙和碘化丙啶染色剂。
   2. 取10 µL该溶液加入细胞计数载片的一侧加样区。
   3. 重复步骤1.2.1和1.2.2，使载片两侧均完成加样。
   4. 将载片放入自动细胞计数仪中。
   5. 选择荧光计数程序，点击计数。对载片两侧进行计数，并计算两个活细胞密度的平....

结果

经处理后，量子点（QDs）将被细胞内化，因为纳米颗粒会与细胞质膜上的ACE2结合并诱导内吞作用。利用表达ACE2-GFP的细胞系，可通过荧光显微镜观察量子点与ACE2的转位过程。内化后，量子点与ACE2的信号表现出强烈的共定位。基于这些图像，可进行图像分割及后续分析，以提取相关参数，例如斑点数量（图1，图2B）。图1A展示了用不同浓度的QD-Spike处理的细胞或仅使用培养基作为对照的细胞拼接图像。实验使用了三个通道，包括数字相差（DPC）、异硫氰酸荧光素（FITC）以及定制的量子点通道（激发波长405 nm，发射波长608 nm）。DPC提供细胞整体形态的图像，可大致反映整个细胞的形态结构。感兴趣区域与DPC信号重叠，足以用于检测内化的量子点。FITC通道显示ACE2-GFP的定位发生改变，并在与QD-Spike共定位的区域发生聚集。随着QD-Spike浓度降低，量子点不再可见，ACE2-GFP信号与对照组相似。合并通道展示了ACE2-GFP与QD-Spik.......

讨论

本文所述方法提供了使用高通量共聚焦显微镜对人细胞中功能化量子点（QDs）进行成像的必要步骤。该方法最适合用于以内吞作用为主要病毒入侵途径而非依赖TMPRSS2和膜融合的细胞，因为它能够研究SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike）与hACE2的内吞过程。由于量子点模型的特性以及商品化刺突三聚体上存在的C端His标签，任何由TMPRSS2对刺突蛋白S1和S2结构域的切割都将导致量子点仅保留在S2结构域上¹²。鉴于受体结合域（RBD）位于S1中，这可能会阻止内化过程的发生。因此，如果细胞表面事件的顺序是精确发生的，即hACE2首先结合，随后TMPRSS2切割刺突蛋白，则预期结果为无内化现象的阴性信号。

由于本实验方案涉及细胞过程的成像，培养的细胞必须能够允许病毒感染，并表达hACE2。可通过瞬时转染将hACE2导入细胞，或构建稳定表达hACE2的细胞系¹⁷。建议使用抗hACE2抗体进行免疫荧光实验，以验证hACE2的表达与定位，除非hACE2带有荧光蛋白标签（如GFP），可在显微镜下直接观察.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
32% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15714	用于量子点处理后细胞的固定，终浓度为 3.2% 用于在Opti-MEM I中稳定量子点并防止非特异性相互作用，终浓度为 0.1%
7.5% 牛血清白蛋白	Gibco	15260-037	用作荧光细胞计数的细胞活力染料
吖啶橙/碘化丙啶染色剂	Logos Biosystems	F23001	用于接种细胞和检测QD-Spike的微孔板
黑色透明底96孔聚-D-赖氨酸包被板	Greiner	655946	用于支持细胞培养，DMEM补充剂
经鉴定的胎牛血清	Cytiva/HyClone	SH30071.03	基于云的高内涵图像分析软件；V2.9.1
Columbus Analyzer	Perkin Elmer	NA	用于细胞固定后细胞核和细胞体的标记，深红色核染料
DRAQ5 (5 mM)	ThermoFisher Scientific	62252	HEK293T细胞培养的基础培养基
杜尔贝科改良必需培养基，D-葡萄糖（4.5g/L），L-谷氨酰胺，丙酮酸钠（110 mg/L），酚红	Gibco	11995-065	用于从Columbus导出数据后的数据整理；V2110 Microsoft 365
Excel	Microsoft	NA	用于继续筛选hACE2-GFP阳性细胞，DMEM补充剂
G418	InvivoGen	ant-gn-5	稳定表达与GFP标记的人血管紧张素转换酶2的HEK293T人胚胎肾细胞系
HEK293T hACE2-GFP	Codex Biosolutions	CB-97100-203	全自动细胞计数仪
Luna全自动细胞计数仪	Logos Biosystems	NA	用于荧光细胞计数
Luna细胞计数载片	Logos Biosystems	L12001	高内涵成像平台
Opera Phenix	Perkin Elmer	NA	成像培养基，用于细胞与量子点共孵育
Opti-MEM I减血清培养基	Gibco	11058-021	不含钙和镁的磷酸盐缓冲液，用于传代和检测过程中细胞的洗涤
PBS -/-	Gibco	10010-023	用于防止细胞培养中的细菌污染，DMEM补充剂
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	用于作图、数据可视化和统计分析；V9.1.0
Prism	GraphPad	NA	用于检测SARS-CoV-2刺突蛋白与hACE2的结合及刺突蛋白内吞的监测
量子点608 nm-刺突蛋白（QD608-Spike）	由美国海军研究实验室定制		用于抑制SARS-CoV-2刺突蛋白与hACE2的结合
SARS-CoV-2（2019-nCoV）刺突蛋白中和抗体，小鼠单克隆抗体	Sino Biological	40592-MM57	用于传代过程中使细胞从培养瓶中解离
TrypLE Express	Gibco	12605-010