我们开发了一个单一平台，用于在两项依赖攀爬纤维的联想学习任务期间追踪动物行为。该低成本设计可与针对攀爬纤维相关小脑活动的光遗传学或成像实验相结合。
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本文内容
摘要
摘要
攀爬纤维对浦肯野细胞的输入提供了对小脑依赖性联想学习至关重要的指令性信号。在头部固定的实验小鼠中研究这些信号，有助于结合使用成像、电生理和光遗传学方法。本文开发了一种低成本的行为实验平台（约1000美元），可实现对在跑轮上自由运动的头部固定小鼠进行联想学习过程的追踪。该平台整合了两种常见的联想学习范式：眨眼条件反射和延迟触觉惊跳条件反射。行为通过摄像头进行记录，跑轮运动则由探测器监测。我们详细描述了该平台的组件与搭建方法，并提供了训练及数据分析的详细操作流程。该平台支持结合光遗传刺激和荧光成像技术。其设计允许单台主机计算机同时控制多个平台，从而实现多只动物的同步训练。
引言
利用经典条件反射建立刺激间亚秒级关联以诱发条件反应，长期以来被用于研究依赖小脑的学习过程。例如，在经典的延迟式眨眼条件反射（delay eyeblink conditioning, DEC）中，当一个中性的条件刺激（CS；例如闪光或听觉音调）与一个无条件刺激（US；例如作用于角膜的气流）反复配对呈现时，动物学会在恰当的时间产生保护性眨眼反应，其中无条件刺激总是在条件刺激结束时或接近结束时出现，并引发反射性眨眼。这种习得的反应被称为条件反应（CR），而反射性反应则被称为无条件反应（UR）。在兔模型中，特异性损伤小脑会破坏此类学习能力1,2,3,4此外，由攀爬纤维输入所驱动的浦肯野细胞复合峰电位5，提供必要的6,7 且充足8,9 获得适时条件反应的信号。
最近，已开发出适用于头部固定小鼠的攀爬纤维依赖性联想学习范式。眼睑条件反射（DEC）是首个被应....
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方案
本文所述动物实验方案已获得普林斯顿大学动物护理与使用委员会的批准。
1. 设置单板计算机
- 将摄像头串行接口（CSI）线缆连接到 Raspberry NoIR V2 摄像头和单板计算机（SBC）的摄像头端口。
- 将适用于单板计算机（SBC）的操作系统下载到主机计算机上，并将操作系统镜像写入微型安全数字（microSD）卡。
注意：有关 Raspberry Pi 单板计算机（SBC）的这些操作的详细说明可参见其他文献23。本系统已使用以下操作系统进行测试：Stretch、Buster、Bullseye。 - 为启用安全外壳（SSH）通信，请在 microSD 卡的启动分区中创建一个无扩展名的文件，命名为 "ssh"。完成后，从主机计算机弹出 microSD 卡，并将其插入单板计算机（SBC）的 microSD 卡插槽中。通过连接电源适配器为单板计算机（SBC）供电。
- 配置单板计算机（SBC）以接受与主机的有线连接。
- 使用合适的线缆将显示器连接至单板计算机（SBC）。打开终端，输入命令 ifconfig 并记录单板计算机（SBC）的以太网 IP 地址。
注意：Raspberry Pi 3B+ 型号配备 HDMI 显示端口，....
- 使用合适的线缆将显示器连接至单板计算机（SBC）。打开终端，输入命令 ifconfig 并记录单板计算机（SBC）的以太网 IP 地址。
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结果
延迟性眼睑条件反射实验与分析的工作流程
正确的实验参数选择对于成功实施延迟性眼睑条件反射（DEC）训练至关重要。本研究中展示的数据，使用图形用户界面（GUI）设定条件刺激（CS）持续时间为 350 ms，非条件刺激（US）持续时间为 50 ms。该配对方式产生 300 ms 的刺激间间隔：这一时长足以防止低幅度条件反应（CR）的产生10，又足够短以避免进入学习效果较差或属于痕迹条件反射的范围，后者会涉及额外的脑区活动11。实验中，通过设置 ITI 低值和高值字段，使每次试验之间的间隔时间在 5–15 s 范围内随机均匀选择。试验间间隔的随机化使得动物受试者无法利用除 CS 和 US 本身之外的其他时间线索来完成任务。
包含省略条件刺激（CS）或非条件刺激（US）的试验，可对训练后的动物进行条件反应（CR）和非条件反应（UR）运动学评估。用户可自定义CS与US配对出现或单独呈现的试验比例。在本研究展示的数据中，所有实验均设置10%的仅CS试验，其余.......
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讨论
本文所述平台及配套方案可用于在两种感觉关联学习任务中可靠地追踪动物行为。每种任务均依赖于攀爬纤维通路的完整通信功能。在本文描述的设计中，我们整合了若干要素，以促进学习过程以及小脑反应的记录或干预。这些要素包括一个可让动物自由运动的转轮11,18，以及头部固定装置。该转轮允许小鼠受试动物自由运动，而已有研究发现这种自由运动对DEC习得至关重要18。对小鼠进行头部固定，使研究人员能够更便利地应用遗传学、电生理学、成像和光遗传学技术，而这些技术在其他模式生物中或在自由活动条件下较难实现12。我们已将本设计应用于上述各项技术中。运行在微控制器上的软件可轻松调整，以实现对多光子成像采集或与光遗传刺激同步的时序信号进行控制，两者均可达到亚毫秒级精度。当将光遗传学设备或成像设备与行为实验结合使用时，必须注意尽量减少动物对这些设备的感知。例如，许多多光子系统在其检流计扫描镜或快门启动成像采集时会发出可听见的声音。如果采集过程由试验开始触发，则.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国国家心理健康研究所资助项目NRSA F32 MH120887-03（授予G.J.B.）以及R01 NS045193和R01 MH115750（授予S.S-H.W.）的支持。我们感谢Bas Koekkoek博士和Henk-Jan Boele博士在优化DEC装置设置方面的有益讨论，以及Yue Wang博士和Xiaoying Chen博士在优化DTSC装置设置方面的有益讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| "B" C的快速基础&B METABOND - 10 mL 瓶装 | Parkell | S398 | 牙科水泥溶剂 |
| "C" 通用TBB催化剂 - 0.7 mL | Parkell | S371 | 催化剂 |
| #8 垫圈 | Thorlabs | W8S038 | 垫圈 |
| 0.250" (1/4") × 8.00" 不锈钢精密轴材 | Servocity | 634172 | 1/4" 轴 |
| 0.250” (0.770"夹紧轮毂 | Servocity | 545588 | 夹紧轮毂 |
| 1/4" 6毫米内六角螺钉轴联轴器 - 5个装 | Actobotics | 625106 | 轴联接套管 |
| 1/4"-20 顶盖螺钉，3/4" 长 | Thorlabs | SH25S075 | 1/4" 螺栓 |
| 100 个 5 毫米 395–400 nm 紫外 LED 发光二极管 透明圆形透镜 29 mm 长引线（直流 3V）LED 灯 + 100 个电阻 | EDGELEC | ED_YT05_U_100Pcs | CS LED |
| 2 米 Micro HDMI 转 DVI-D 线缆 - 公对公 - 2 米 Micro HDMI 转 DVI 线缆 - 19 针 HDMI (D) 公头转 DVI-D 公头 - 支持 1920 x 1200 视频分辨率 | Star-tech | HDDDVIMM2M | 树莓派4B监控线缆 |
| 256 GB Ultra Fit USB 3.1 闪存盘 | SanDisk | SDCZ430-256G-G46 | USB 闪存盘 |
| 3.3 V–5 V 4通道逻辑电平转换双向移位模块 | 亚马逊 | B00ZC6B8VM | 逻辑电平转换器 |
| 32 GB 95 MB/s（U1）microSDHC EVO Select 存储卡 | 三星 | MB-ME32GA/AM | microSD 卡 |
| 4.50" 铝制通道 | Servocity | 585444 | 4.5" 铝制导轨 |
| 48-LED 闭路电视红外夜视照明器 | Towallmark | SODIAL | 红外光阵列 |
| 4块面包板套件，包含2块830孔和2块400孔无焊面包板，用于原型扩展板、电源分配及连接模块 | REXQualis | B07DL13RZH | 面包板 |
| 5端口千兆以太网非网管型网络交换机 | TP-Link | TL-SG105 | 以太网交换机 |
| 5 V 2.5 A 树莓派 3 B+ 电源适配器 | Canakit | DCAR-RSP-2A5 | 树莓派 3B+ 电源供应 |
| 5-0 ETHILON BLACK 1 x 18" C-3 | Ethicon | 668G | 缝合线 |
| 6 mm 轴编码器 2000 PPR 推挽式线路驱动器 通用输出 线路驱动器输出 5–26 V dc 供电 | Calt | B01EWER68I | 旋转编码器 |
| Ø1/2" 光学支架，不锈钢，8-32紧定螺钉，1/4英寸"-20 拍击，L = 1"，5 件装 | Thorlabs | TR1-P5 | 光学柱 |
| Ø1/2" 光学支架，不锈钢，8-32紧固螺钉，1/4英寸"-20 打，L = 2"，5 件装 | Thorlabs | TR2-P5 | 光学柱 |
| Ø1/2" 光学支架，不锈钢，8-32紧固螺钉，1/4"-20 拍，L = 4"，5 件装 | Thorlabs | TR4-P5 | 光学柱 |
| Ø1/2" 光学支架，不锈钢，8-32紧定螺钉，1/4英寸"-20 拍打，L = 6"，5 件装 | Thorlabs | TR6-P5 | 光学柱 |
| Ø1/2" 支架，弹簧加载六角锁紧旋钮，L = 2" | Thorlabs | PH2 | 光学后置支架 |
| Adapter-062-M X LUER LOCK-F | The Lee Co. | TMRA3201950Z | 电磁阀鲁尔接头 |
| Aeromat 泡沫轴尺寸：36" 长度 | Aeromat | B002H3CMUE | 泡沫轴 |
| 铝制光学平台 10" ×12" x 1/2", 1/4"-20 次轻敲 | Thorlabs | MB1012 | 铝制光学平台 |
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| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | Arduino Uno（微控制器板） |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Arduino Due（微控制器板） |
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| CNC 步进电机驱动器 1.0–4.2 A 20–Nema 17 和 23 型步进电机的 50 V 直流 1/128 微步分辨率 | Stepper Online | B06Y5VPSFN | 步进电机驱动器 |
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| 棉签 | Puritan | 806-WC | 棉签 |
| Dell 1908FP 19" 平板显示器 - 1908FPC | 戴尔 | 1908FPC | 计算机显示器 |
| 树莓派相机用柔性电缆 | Adafruit | 2144 | 相机串行接口电缆 |
| 高扭矩 Nema 17 双极性步进电机 92 盎司·在/65 N·2.1 A 挤出机电机 | Stepper Online | 17HS24-2104S | 步进电机 |
| 异氟烷 | Henry Schein | 66794001725 | 异氟烷 |
| Krazy 最强粘力永久胶水，0.18 盎司 | Krazy Glue | KG483 | 氰基丙烯酸酯胶水 |
| 盐酸利多卡因 | VetOne | 510212 | 利多卡因 |
| 低强度钢制六角螺母，2级，镀锌，1/4"-20 号螺纹尺寸 | McMaster Carr | 90473A029 | 坚果 |
| M3 × 50 mm 部分螺纹内六角圆柱头螺钉 10 件 | Uxcell | A16040100ux1380 | M3 螺栓 |
| NEMA 17 步进电机安装座 | ACTOBOTICS | 555152 | 步进电机支架 |
| 官方树莓派电源适配器 5.1 V 3 A，USB C 接口，1.5 米长 | Adafruit | 4298 | 树莓派 4B 电源供应 |
| Optixcare 犬用产品 & Cat Eye Lube 润滑凝胶，0.70 盎司管装 | Optixcare | 142422 | 眼膏 |
| 精密不锈钢球轴承，带防尘盖，型号 R188-2Z，最高转速 13000 rpm | McMaster-Carr | 3759T57 | 轴承 |
| 优质母对母跳线 - 40 根，6 英寸" | Adafruit | 266 | 导线 |
| 优质雌/雄“延长”跳线 - 40 根 × 6 包" (150 mm) | Adafruit | 826 | 导线 |
| 优质公对公跳线 - 40 根，6 英寸" | Adafruit | 758 | 导线 |
| 用于C的放射性显影L型粉末&B METABOND - 5 g | Parkell | S396 | 牙科水泥粉 |
| 树莓派（3B+ 或 4B） | Adafruit | 3775 或 4295 | 树莓派 |
| 树莓派 NoIR 摄像头模块 V2 - 800 万像素 1080P30 | Raspberry Pi 基金会 | RPI3-NOIR-V2 | 树莓派 NoIR V2 摄像头 |
| 直角支架，1/4" （M6）沉头孔槽，8-32 螺纹孔 | Thorlabs | AB90E | 直角支架 |
| 直角夹具用于 Ø1/2" 3/16 柱" 六边形 | Thorlabs | RA90 | 直角光学柱夹 |
| 直角端部夹具 Ø1/2" 帖子，1/4"-20 螺柱和 3/16" 六边形 | Thorlabs | RA180 | 直角端部夹具 |
| RJ45 Cat-6 以太网跳线互联网电缆 | 亚马逊 | CAT6-7FT-5P-BLUE | 以太网电缆 |
| 旋转夹具 Ø1/2" 帖子，360° 可连续调节，3/16" 六边形 | Thorlabs | SWC | 旋转光学柱夹 |
| 刺突蛋白 & Hold Driver-0.1 至 5 毫秒 | The Lee Co. | IECX0501350A | 电磁阀驱动器 |
| 旋转底座适配器 | Thorlabs | UPHA | 后固定座适配器 |
| USB 2.0 A型公头转Micro-B电缆，6英尺 | 亚马逊 | 7T9MV4 | USB2型A接口转USB2微型接口数据线 |
| USB 2.0 打印机线缆 - A型公头转B型公头，6英尺（1.8 m） | 亚马逊 | B072L34SZS | USB2 Type B 转 USB2 Type A 数据线 |
| VHS-M/SP-12 V | The Lee Co. | INKX0514900A | 电磁阀 |
| 镀锌钢 1/4" 外径为1.000的垫圈" | McMaster Carr | 91090A108 | 垫圈 |
参考文献
- McCormick, D. A., Lavond, D. G., Clark, G. A., Kettner, R. E., Rising, C. E., Thompson, R. F. The engram found? Role of the cerebellum in classical conditioning of nictitating membrane and eyelid responses. Bulletin of the Psychonomic Society. 18 (3), 103-105 (1981).
- McCormick, D. A., Clark, G. A., Lavond, D. G., Thompson, R. F.
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