利用生物表面活性剂组合进行提高采油率

摘要

我们阐述了筛选和鉴定产生物表面活性剂微生物的方法，以及对生物表面活性剂进行色谱表征和化学鉴定的方法，并评估该生物表面活性剂的工业应用潜力。 在提高剩余油采收率方面的应用也一并介绍。

摘要

生物表面活性剂是一类具有表面活性的化合物，能够降低两种不同极性相之间的表面张力。由于生物表面活性剂具有毒性低、生物降解性高、环境相容性好以及对极端环境条件耐受性强等优点，已逐渐成为化学表面活性剂的有前景替代品。本文阐述了用于筛选可产生生物表面活性剂的微生物的方法。通过液滴崩塌法、油膜扩散法和乳化指数实验来鉴定能够产生物表面活性剂的微生物。通过测定微生物生长导致培养基表面张力的降低，验证了生物表面活性剂的产生。我们还描述了对生物表面活性剂进行表征和鉴定的相关方法。对提取的生物表面活性剂进行薄层色谱分析，并对色谱板进行差异染色，以确定其性质。采用液相色谱-质谱联用（LCMS）、¹H 核磁共振（NMR）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对生物表面活性剂进行化学结构鉴定。此外，我们进一步说明了评估所产生物表面活性剂组合在模拟砂柱体系中提高残余油采收率应用效果的方法。

引言

生物表面活性剂是由微生物产生的两亲性表面活性分子，能够降低两相之间的表面张力和界面张力¹一种典型的生物表面活性剂包含一个亲水部分和一个疏水部分，其中亲水部分通常由糖基团、肽链或亲水性氨基酸组成，疏水部分则由饱和或不饱和脂肪酸链构成。²由于其两亲性，生物表面活性剂会在两相界面处聚集，并降低界面处的界面张力，从而促进一相在另一相中的分散^1,3目前已报道的多种生物表面活性剂包括糖脂类，其中碳水化合物连接至长链脂肪酸或羟基脂肪酸。 通过 酯键类（如鼠李糖脂、海藻糖脂和槐糖脂）、脂肽类（其中脂质连接至多肽链，例如表面活性素和地衣素）以及聚合型生物表面活性剂（通常由多糖-蛋白质复合物构成，例如乳化素、脂桑素、阿拉桑和脂甘露聚糖）⁴微生物产生的其他类型生物表面活性剂包括脂肪酸、磷脂、中性脂质和颗粒型生物表面活性剂⁵研究最为广泛的生物表面活性剂类别是糖脂类，其中大多数研究集中于鼠李糖脂。⁶. 鼠李糖脂包含一个或两个鼠李糖分子（构成亲水部分）与一个或两个长链脂肪酸分子（通常为羟基癸酸）相连。鼠李糖脂是最早报道的糖脂类化合物，首次发现于 铜绿假单胞菌

方案

1. 微生物菌株的培养

1. 称取2 g LB培养基粉末，加入250 mL锥形瓶中的50 mL蒸馏水中。搅拌至粉末完全溶解，并用蒸馏水定容至100 mL。
2. 同样方法配制另外两瓶100 mL的LB培养基，并在瓶口塞上棉塞。
3. 用铝箔包裹棉塞，将锥形瓶在121 °C、15 psi条件下高压灭菌15分钟，以灭菌培养基。
4. 灭菌后，让培养基冷却至室温。
5. 制备菌株的初级培养物时，用接种环从LA平板上挑取单个菌落，接种至含有5 mL无菌LB液体培养基的试管中。
6. 将试管置于30 °C、180 rpm条件下振荡培养过夜。
7. 在超净工作台内，将1 mL过夜培养的种子液接种至含有100 mL已灭菌LB培养基的锥形瓶中。
8. 将锥形瓶置于旋转摇床中，在30 °C、180 rpm条件下培养7天。
9. 培养结束后，收集锥形瓶中的培养物，将菌液转移至离心管中，在4 °C条件下，以4,500 × g 离心20分钟。
10. 小心地将无细胞上清液倒入干净的烧杯中，用于生物表面活性剂产生的筛选实验。

2. 生物表面活性剂生产的筛选实验

注意：在以下各节中，以商用表面活性剂（皂素）作为阳性....

结果

通过多种检测方法对三株细菌（Rhodococcus sp. IITD102、Lysinibacillus sp. IITD104 和 Paenibacillus sp. IITD108）进行了生物表面活性剂产生的筛选，包括液滴崩塌试验、油膜扩散试验、乳化指数试验以及表面张力降低试验。三株细菌的无细胞上清液以及化学表面活性剂溶液均出现液滴崩塌现象，因此被判定为生物表面活性剂阳性（图4a）。相比之下，水滴未发生崩塌，因此被判定为生物表面活性剂阴性。在油膜扩散试验中，商用表面活性剂及三株细菌培养物的无细胞上清液均能有效扩散并置换油层，因此也被判定为生物表面活性剂阳性（图4b）。而水则无法置换任何油层，因此被判定为阴性。在乳化指数试验中，含有商用表面活性剂及三株微生物菌株上清液的试管中均观察到稳定的乳化层。然而，在未接种的培养基试管中未观察到乳化现象（图4c）。这再次表明，Rhodococcus .......

讨论

生物表面活性剂是一类最具多样性的生物活性成分，正逐渐成为化学表面活性剂的有吸引力替代品。由于其具有更好的润湿性、更低的临界胶束浓度（CMC）、结构多样化以及环境友好性，生物表面活性剂在洗涤剂、涂料、化妆品、食品、制药、农业、石油和水处理等多个工业领域具有广泛的应用前景¹⁸。这促使人们越来越关注发现更多能够产生物表面活性剂的微生物菌株。本文介绍了由红球菌属（Rhodococcus）sp. IITD 102、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）sp. IITD 104 和类芽孢杆菌属（Paenibacillus）sp. IITD 108 产生的生物表面活性剂混合物的筛选、鉴定及其在提高原油采收率中的应用方法。通过液滴崩塌试验、油膜扩散试验和乳化指数测定对生物表面活性剂的产生进行初步筛选，并通过测定微生物生长导致的培养基表面张力降低来确认其产生。文献中已有大量关于红球菌属（Rhodococcus）产生糖脂类生物表面活性剂（如鼠李糖脂和海藻糖脂）的报道^19,.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 ml 移液管	德国艾本多夫	G54412G
1H NMR	布鲁克 Avance AV-III 型波谱仪，美国
20 μl 移液器	Thermo Scientific，美国	H69820
高压灭菌	印度贾伊斯博	编号 5923	Jain Scientific
蓝色火焰燃烧器	Rocker scientific，中国台湾	龙 200
丁醇	GLR inovations，印度	GLR09.022930
C18 色谱柱	美国安捷伦科技公司	770995-902
离心	德国艾本多夫	5810R
氯仿	默克，印度	1.94506.2521
氯仿-d	印度 SRL	57034
Falcon 管	塔森斯，印度	546041	辐射灭菌聚丙烯
傅里叶变换红外光谱（FT-IR）	Thermo Fisher Scientific，美国	Nicolet iS50
通风橱	印度，凯拉	47408	定制的
冰醋酸	默克，印度	1.93002
玻璃珠	默克，印度	104014
载玻片	Polar工业公司，美国	蓝星	75 mm * 25 mm
玻璃棉	印度默克	104086
盐酸	默克，印度	1003170510
培养箱	赛默飞世尔科技，美国	MaxQ600	摇床培养箱
培养箱	印度，凯拉	Sunbim
碘，再升华	默克，印度	231-442-4	重升华颗粒
K12 –克鲁斯表面张力仪	Kruss Scientific，德国	K100
层流空气净化台	赛默飞世尔科技，中国	1300 系列 A2
LCMS	安捷伦科技公司，美国	1260 Infinity II
LB肉汤	印度 HIMEDIA	M575-500G	粉末
甲醇	默克，印度	107018
茚三酮	印度 Titan Biotech 有限公司	1608
对-茴香醛	Sigma，美国	204-602-6
培养皿	塔尔逊斯，印度	460090-90 MM	辐射灭菌聚丙烯
皂苷	默克，印度	232-462-6
氯化钠	默克，印度	231-598-3
试管	印度博罗斯	9800U06	玻璃管
薄层色谱板	默克，印度	1055540007
涡旋	GeNei，印度	2006114318
水浴锅	印度	SW21C