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方法文章

利用生物表面活性剂组合进行提高采油率

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DOI：

10.3791/63207

⸱

2022年6月3日

 ,  ,  , 
1Department of Biochemical Engineering and Biotechnology, Indian Institute of Technology Delhi, 2Indian Oil Corporation, Research and Development Faridabad

本文内容

摘要

我们阐述了筛选和鉴定产生物表面活性剂微生物的方法，以及对生物表面活性剂进行色谱表征和化学鉴定的方法，并评估该生物表面活性剂的工业应用潜力。 在提高剩余油采收率方面的应用也一并介绍。

摘要

生物表面活性剂是一类具有表面活性的化合物，能够降低两种不同极性相之间的表面张力。由于生物表面活性剂具有毒性低、生物降解性高、环境相容性好以及对极端环境条件耐受性强等优点，已逐渐成为化学表面活性剂的有前景替代品。本文阐述了用于筛选可产生生物表面活性剂的微生物的方法。通过液滴崩塌法、油膜扩散法和乳化指数实验来鉴定能够产生物表面活性剂的微生物。通过测定微生物生长导致培养基表面张力的降低，验证了生物表面活性剂的产生。我们还描述了对生物表面活性剂进行表征和鉴定的相关方法。对提取的生物表面活性剂进行薄层色谱分析，并对色谱板进行差异染色，以确定其性质。采用液相色谱-质谱联用（LCMS）、1H 核磁共振（NMR）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对生物表面活性剂进行化学结构鉴定。此外，我们进一步说明了评估所产生物表面活性剂组合在模拟砂柱体系中提高残余油采收率应用效果的方法。

引言

生物表面活性剂是由微生物产生的两亲性表面活性分子，能够降低两相之间的表面张力和界面张力1一种典型的生物表面活性剂包含一个亲水部分和一个疏水部分，其中亲水部分通常由糖基团、肽链或亲水性氨基酸组成，疏水部分则由饱和或不饱和脂肪酸链构成。2由于其两亲性，生物表面活性剂会在两相界面处聚集，并降低界面处的界面张力，从而促进一相在另一相中的分散1,3目前已报道的多种生物表面活性剂包括糖脂类，其中碳水化合物连接至长链脂肪酸或羟基脂肪酸。 通过 酯键类（如鼠李糖脂、海藻糖脂和槐糖脂）、脂肽类（其中脂质连接至多肽链，例如表面活性素和地衣素）以及聚合型生物表面活性剂（通常由多糖-蛋白质复合物构成，例如乳化素、脂桑素、阿拉桑和脂甘露聚糖）4微生物产生的其他类型生物表面活性剂包括脂肪酸、磷脂、中性脂质和颗粒型生物表面活性剂5研究最为广泛的生物表面活性剂类别是糖脂类，其中大多数研究集中于鼠李糖脂。6. 鼠李糖脂包含一个或两个鼠李糖分子（构成亲水部分）与一个或两个长链脂肪酸分子（通常为羟基癸酸）相连。鼠李糖脂是最早报道的糖脂类化合物，首次发现于 铜绿假单胞菌7.

与化学表面活性剂相比，生物表面活性剂因其具备多种独特而显著的特性而受到越来越多的关注8。这些特性包括更高的特异性、更低的毒性、更丰富的多样性、易于制备、更高的生物降解性、更优的起泡性能、环境相容性以及在极端条件下的活性9。生物表面活性剂的结构多样性（图S1）是其相较于化学表面活性剂的另一优势10。由于其临界胶束浓度（CMC）通常比化学表面活性剂低数倍，因此在较低浓度下通常具有更高的有效性和效率11。据报道，生物表面活性剂具有高度的热稳定性（可达100 °C），并能耐受较高的pH值（高达9）和高盐浓度（高达50 g/L）12，因此在需要暴露于极端条件的工业过程中具有诸多优势13。其可生物降解性和较低毒性使其适用于生物修复等环境治理应用。由于具备上述优势，生物表面活性剂在食品、农业、洗涤剂、化妆品和石油工业等多个行业中正受到日益广泛的关注11。此外，生物表面活性剂在石油污染修复中也受到广泛关注，可用于去除石油污染物和有毒有害物质14。

本文报道了由Rhodococcus sp. IITD102、Lysinibacillus sp. IITD104 和 Paenibacillus sp. IITD108 产生的生物表面活性剂的制备、表征及其在提高原油采收率中的应用。筛选、表征及联合使用生物表面活性剂以提高原油采收率的各个步骤如图1所示。

生物表面活性剂提取与表征流程图；色谱法、液相色谱-质谱联用、核磁共振、傅里叶变换红外光谱方法。
图1：利用生物表面活性剂组合进行提高原油采收率的方法。 图中展示了逐步实验流程。本研究共分为四个步骤。首先，对微生物菌株进行培养，并通过多种检测方法筛选其产生生物表面活性剂的能力，包括液滴崩塌试验、油膜扩散试验、乳化指数试验以及表面张力测定。随后，从无细胞发酵液中提取生物表面活性剂，并采用薄层色谱法鉴定其性质，进一步通过液相色谱-质谱联用（LCMS）、核磁共振（NMR）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）进行确认。下一步，将提取得到的生物表面活性剂混合，利用砂柱填充法评估该混合物在提高原油采收率方面的潜力。请点击此处查看该图的放大版本。

通过液滴崩塌法、油膜扩散法、乳化指数测定以及微生物生长导致的无细胞培养基表面张力降低程度的测定，对这些微生物菌株产生物表面活性剂的能力进行筛选。随后提取生物表面活性剂，并通过液相色谱-质谱联用（LCMS）、1H 核磁共振（NMR）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对其进行表征与化学结构鉴定。最后，将这些微生物产生的生物表面活性剂混合后，用于模拟砂柱体系中残余油的回收。

本研究仅阐述了生物表面活性剂组合在提高残余油采收率方面的筛选、鉴定、结构表征及应用方法。并未对微生物菌株产生的生物表面活性剂进行详细的功能特性表征15,16。对于任何生物表面活性剂的详细功能特性表征，通常需开展临界胶束浓度测定、热重分析、表面润湿性及生物降解性等多种实验。但由于本文属于方法学论文，重点在于生物表面活性剂组合的筛选、鉴定、结构表征及其在提高残余油采收率中的应用，因此未包含上述功能表征实验。

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方案

1. 微生物菌株的培养

  1. 称取2 g LB培养基粉末，加入250 mL锥形瓶中的50 mL蒸馏水中。搅拌至粉末完全溶解，并用蒸馏水定容至100 mL。
  2. 同样方法配制另外两瓶100 mL的LB培养基，并在瓶口塞上棉塞。
  3. 用铝箔包裹棉塞，将锥形瓶在121 °C、15 psi条件下高压灭菌15分钟，以灭菌培养基。
  4. 灭菌后，让培养基冷却至室温。
  5. 制备菌株的初级培养物时，用接种环从LA平板上挑取单个菌落，接种至含有5 mL无菌LB液体培养基的试管中。
  6. 将试管置于30 °C、180 rpm条件下振荡培养过夜。
  7. 在超净工作台内，将1 mL过夜培养的种子液接种至含有100 mL已灭菌LB培养基的锥形瓶中。
  8. 将锥形瓶置于旋转摇床中，在30 °C、180 rpm条件下培养7天。
  9. 培养结束后，收集锥形瓶中的培养物，将菌液转移至离心管中，在4 °C条件下，以4,500 × g 离心20分钟。
  10. 小心地将无细胞上清液倒入干净的烧杯中，用于生物表面活性剂产生的筛选实验。

2. 生物表面活性剂生产的筛选实验

注意：在以下各节中，以商用表面活性剂（皂素）作为阳性对照，以水和未接种的培养基作为阴性对照。

  1. 液滴崩塌试验
    1. 取一块洁净的载玻片，将200 µL油均匀涂布在载玻片表面。
    2. 在油层中心加入20 µL无细胞上清液，静置2–3分钟。
      注：若液滴发生崩塌，则判定该上清液含有生物表面活性剂，结果为阳性。
  2. 油扩散试验
    1. 在培养皿（直径75 mm）中加入20 mL双蒸水，并在水面上加入200 µL原油。
    2. 在油层中心加入20 µL无细胞上清液，静置1分钟。
      注：若因油被推开而形成透明圈，则判定该上清液含有生物表面活性剂，结果为阳性。
  3. 乳化指数测定（E24 测定）
    1. 在洁净的玻璃试管中分别加入4 mL汽油和4 mL无细胞上清液。
    2. 剧烈涡旋混合3分钟，随后静置24小时。
    3. 24小时后，以乳化层高度（cm）占整个液柱高度（cm）的百分比计算E24指数。
      测定乳化稳定性的乳化指数公式；公式：(乳化层高度/总高度)×100。
      注：若24小时后观察到乳化现象（油包水或水包油），则表明该上清液可能含有生物表面活性剂。
  4. 表面张力测定
    注：采用杜努伊环法测定表面张力17。本实验所用仪器（见材料表）极为灵敏，因此务必确保玻璃容器和探针的彻底清洁。
    1. 开启系统，双击相关软件以启动程序。
    2. 用待测表面张力的液体清洗玻璃容器。
    3. 向容器中加入40 mL液体，并将其安装在容器支架上。
    4. 松开探针支架，将探针安装其上，然后按下手动控制器上的锁定按钮固定探针支架。
    5. 使用手动控制器调节平台高度，使探针距离液面约2–3 mm。
    6. 现在使用软件测定表面张力。点击屏幕左上角面板中的文件，再点击打开工作区，弹出窗口将出现。
    7. 向下滚动，双击K100：表面与界面张力图标。
    8. 再次点击屏幕左上角的文件图标，选择新建数据库，输入数据保存名称后点击确定。
    9. 接着点击文件 > 新建测量 > SFT > 环，输入测量名称，并确保配置模板显示为SFT环。
    10. 在测量配置窗口中，选择当前使用的探针和容器，并填写液体相和气体相的相关信息。
      注：液体相为水，气体相为空气。液体相密度为无细胞上清液的密度，可通过称量50 mL液体并以Kg/m3为单位计算密度获得。
    11. 点击程序选项卡，并填写以下参数：检测速度：6 mm/min，检测灵敏度：0.005 g，搜索速度：6 mm/min，搜索灵敏度：0.005 g，测量速度：3 mm/min，测量灵敏度：0.001 g，浸入深度：3 mm，返回距离：10%，校正方法：Harkins & Jordan，最大值：5，然后点击确定。
    12. 在弹出窗口中选择用于存储数据的数据库，点击确定。
      注：可在此创建新数据库，或将新测量数据添加至现有数据库中。
    13. 点击屏幕顶部中央的播放按钮，系统将开始执行测量程序。系统稳定后会自动检测液面，探针浸入液体，前后移动并检测所形成液膜的张力。
    14. 获取结果时，点击屏幕左侧中部的测量图标，再点击数据，记录所测定的表面张力数值。
    15. 测量完成后，降低平台高度，松开并取下探针和容器。
      注：为确定生物表面活性剂产生所导致的表面张力降低，应以未接种的LB培养基作为空白对照。

3. 生物表面活性剂的提取

  1. 使用 2 N HCl 将无细胞上清液的 pH 值调节至 2。将混合物在 4 °C 下静置过夜。
  2. 向上清液中加入等体积的氯仿-甲醇混合液（2:1），并剧烈混合 20 分钟。
  3. 静置混合物，使其发生相分离。
  4. 移除含有水和甲醇的上层相，将含有生物表面活性剂的下层相置于通风橱中蒸发。
  5. 有机相蒸发后，将呈蜂蜜色的粗提生物表面活性剂重新溶解于 3 mL 氯仿中，并将此混合液用于后续对生物表面活性剂的鉴定与表征。

4. 乳液稳定性研究

  1. 不同温度下的乳化稳定性
    1. 取5 mL无细胞上清液分别加入不同的试管中。
    2. 向每支试管中加入5 mL汽油，并通过涡旋振荡3 min进行剧烈混合。
    3. 将试管分别置于不同温度（30 °C、40 °C、50 °C、60 °C 和 70 °C）的水浴中过夜孵育。
    4. 24 h后，按前述方法测定乳化指数。
  2. 不同pH值下的乳化稳定性
    1. 取5 mL无细胞上清液加入洁净的试管中。
    2. 使用1 N HCl和1 N NaOH调节无细胞上清液的pH值至（2、4、6、8和10）。
    3. 向试管中加入等体积的汽油，并通过涡旋振荡3 min进行剧烈混合。
    4. 将试管在室温下静置24 h，避免扰动。
    5. 按前述方法测定乳化指数。
  3. 不同盐浓度下的乳化稳定性
    1. 取5 mL无细胞上清液加入洁净的试管中。
    2. 向上清液中加入不同量的盐（NaCl）（0 g/L、5 g/L、10 g/L、20 g/L、60 g/L 和 80 g/L）。
    3. 通过涡旋振荡3 min使盐完全溶解于无细胞上清液中。
    4. 向试管中加入等体积的汽油，并通过涡旋振荡3 min进行剧烈混合。
    5. 将试管在室温下静置24 h，避免扰动。
    6. 24 h后测定乳化指数。

5. 确定生物表面活性剂的性质

  1. 提取生物表面活性剂的薄层色谱分析
    1. 在薄层色谱板上点样20 µL生物表面活性剂，每次点样2 µL。
    2. 将生物表面活性剂分别点在三块不同的薄层色谱板上。
    3. 配制100 mL洗脱剂混合液（氯仿:甲醇 = 2:1），加入薄层色谱展开室中。盖上盖子，密闭饱和20分钟。
    4. 待色谱板干燥后，将其放入已用氯仿-甲醇混合液饱和的展开室中，进行薄层色谱展开。
    5. 当洗脱剂前沿上升至薄层色谱板顶端下方约1 cm处时，取出板子，使其自然风干。
  2. 脂质组分检测染色
    1. 取一个洁净的薄层色谱展开室，向其中加入5–10粒碘颗粒，在新配制的展开室中饱和5至10分钟。
    2. 将薄层色谱板放入展开室内，观察黄色斑点的出现。若出现黄色斑点，则判定该生物表面活性剂含有脂质组分。
  3. 肽或氨基酸组分检测染色
    1. 将0.4 g 茚三酮溶解于20 mL 正丁醇中，配制成茚三酮溶液，再向其中加入0.6 mL 100% 冰醋酸。
    2. 将茚三酮溶液均匀喷洒在薄层色谱板上，静置风干2分钟。将板子在110 °C下加热，并观察显色情况。
      注：若出现蓝色斑点，则判定该生物表面活性剂含有肽链或氨基酸组分。
  4. 碳水化合物组分检测染色
    1. 将2 mL 对茴香醛（p-anisaldehyde）加入含1 mL H2SO4 的48 mL 冰醋酸中，配制成对茴香醛溶液，再向其中加入0.6 mL 冰醋酸。
    2. 将该混合液均匀喷洒在薄层色谱板上，风干2分钟。
    3. 将板子在110 °C下孵育，并观察斑点的显色情况。
      注：若出现绿色或棕色斑点，则判定该生物表面活性剂含有碳水化合物组分。

6. 生物表面活性剂的化学鉴定

  1. 生物表面活性剂的液相色谱-质谱分析
    1. 将25 mg提取的生物表面活性剂溶解于1 mL氯仿中。
    2. 使用C18色谱柱进行液相色谱-质谱联用分析（LCMS），采用锁喷雾配置，参考扫描频率为10 s。
    3. 使用氯仿:甲醇（1:1）作为流动相并进样 2 µL 以0.1 mL/min的流速将样品注入色谱柱。
    4. 设置实验参数如下：极性：ESI 正离子模式，毛细管电压：3 kV，源温度： 80 °C，去溶剂化温度： 300 °C，去溶剂气流速：7,000 L/h，捕集气流速：0.40 mL/min。
    5. 在20分钟的检测时间内，以正离子电喷雾模式扫描100至1,200 Da范围内的离子。
    6. 使用任何定量质谱分析软件对 m/z 值进行分析。
    7. 进行分析时，登录软件。
    8. 点击 批量搜索 输入所获得的质量列表。以正电荷模式检测结果，并以 M + H 和 M + Na 作为加合物。保持精度在 10 PPM 以内，并勾选 展示结构.
    9. 点击 搜索 从化合物列表中，选择 PPM 水平最低的一种。
  2. 1生物表面活性剂的氢核磁共振谱
    注意： 1使用400 MHz核磁共振波谱仪对生物表面活性剂进行氢核磁共振（1H NMR）分析（参见 材料清单).
    1. 将5 mg生物表面活性剂溶解于1 mL氘代氯仿（CDCl₃）中3).
    2. 将混合物转移至核磁共振管中。盖紧管盖，并将管子插入扳手中。使用调节管调整管子的高度。
    3. 将试管连同扳手一起放入核磁共振（NMR）仪中，并按照以下步骤获取NMR谱图。
    4. 选择样本管类型：sx N，其中 N 为试管放置的位置编号（例如，sx 13，表示试管置于第 13 位）th 在相关软件中的位置）
    5. 输入 edc 并按压 输入 创建一个用于存储数据的新文件夹。
    6. 将出现一个弹出窗口。通过点击 CdCl 选择溶剂 3 在列表中输入样本名称。
    7. 开始实验方案时，输入“getprosol”；要锁定溶剂，输入“lock cdcl3”。
    8. 输入“topshim”对样品进行匀场，最后输入“rga;zgefp”以采集数据。这将启动实验程序。
    9. 光谱获取后，输入“apk;abs n”并按回车键，进行相位和基线校正。
    10. 输入“pp”以选择主峰 输入. 若要仅选择强峰，请输入“mi”并键入峰强度的阈值。默认值为 0.2。
    11. 要对峰进行积分，请单击 整合 将光标置于待积分峰的左侧，按住光标并围绕该峰拖动。
    12. 通过点击保存数据 文件 在左上角，然后单击 保存.
    13. 通过输入“sx ej”可将样品从机器中弹出。
    14. 分析峰形并确定氢原子的化学环境。
  3. 生物表面活性剂的傅里叶变换红外光谱分析
    注意：采用商用光谱仪在ATR模式下对提取的生物表面活性剂进行傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析（参见 材料表).
    1. 打开分光光度计，检查吹扫气、干燥剂和检测器。
    2. 采集光谱时，首先在无样品的情况下采集背景光谱。
    3. 取提取的生物表面活性剂并完全干燥。将干燥的生物表面活性剂直接置于金刚石晶体上，施加压力并压紧ATR接触点。
    4. 在软件中，选择扫描次数（输入30），并从400 cm⁻¹开始扫描光谱-1 至 4,000 cm-1.
    5. 点击 好的 将样本光谱添加到光谱窗口中。
    6. 点击 文件 > 保存 > 另存为 输入文件名，后接扩展名 .spa，然后点击 好的.

7. 生物表面活性剂的应用（提高原油采收率）

注意：本实验中，使用双蒸水作为阴性对照，10% SDS、10% Tween 80 和 10% 商业皂苷作为阳性对照。

  1. 取一根玻璃管，用玻璃棉和玻璃珠密封其底部出口。
  2. 将砂质土壤装填入柱中，使液体可从土壤顶部加入，并在底部收集流出液。将柱子固定在支架上，并在土壤顶部加入一些玻璃珠。
  3. 用 50 mL 盐水溶液对柱子进行饱和，并收集流出液以确定孔隙体积。
    孔隙体积 = 顶部加入的盐水体积 - 收集到的流出液体积。
  4. 通过从柱子顶部加入原油并使其流过柱体，将柱内的盐水驱出。收集柱子出口流出的盐水和油的体积，以确定初始含油饱和度体积。从柱中释放出的盐水体积即为初始含油饱和度体积，或称原始油藏油量。
  5. 将柱子静置 24 小时，期间不进行任何扰动。
  6. 24 小时后，用相当于 10 倍孔隙体积的盐水对柱子进行驱替，并收集柱子流出的油，以评估二次采油率。二次采油后仍残留在柱子中的油量即为残余油。
  7. 通过将等体积的提取所得生物表面活性剂（步骤 3.5 中提取）加入烧杯中，配制生物表面活性剂混合液。将该混合液从柱子顶部加入，并将柱子孵育 24 小时。
  8. 24 小时后，测定流出油和水的量，以评估额外或强化的采油效果。从柱中释放出的油体积即为被回收的残余油量。
  9. 使用以下公式估算强化采油率：
    强化采油公式；附加采油率百分比计算，用于科研。

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结果

通过多种检测方法对三株细菌（Rhodococcus sp. IITD102、Lysinibacillus sp. IITD104 和 Paenibacillus sp. IITD108）进行了生物表面活性剂产生的筛选，包括液滴崩塌试验、油膜扩散试验、乳化指数试验以及表面张力降低试验。三株细菌的无细胞上清液以及化学表面活性剂溶液均出现液滴崩塌现象，因此被判定为生物表面活性剂阳性（图4a）。相比之下，水滴未发生崩塌，因此被判定为生物表面活性剂阴性。在油膜扩散试验中，商用表面活性剂及三株细菌培养物的无细胞上清液均能有效扩散并置换油层，因此也被判定为生物表面活性剂阳性（图4b）。而水则无法置换任何油层，因此被判定为阴性。在乳化指数试验中，含有商用表面活性剂及三株微生物菌株上清液的试管中均观察到稳定的乳化层。然而，在未接种的培养基试管中未观察到乳化现象（图4c）。这再次表明，Rhodococcus ...

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讨论

生物表面活性剂是一类最具多样性的生物活性成分，正逐渐成为化学表面活性剂的有吸引力替代品。由于其具有更好的润湿性、更低的临界胶束浓度（CMC）、结构多样化以及环境友好性，生物表面活性剂在洗涤剂、涂料、化妆品、食品、制药、农业、石油和水处理等多个工业领域具有广泛的应用前景18。这促使人们越来越关注发现更多能够产生物表面活性剂的微生物菌株。本文介绍了由红球菌属（Rhodococcus）sp. IITD 102、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）sp. IITD 104 和类芽孢杆菌属（Paenibacillus）sp. IITD 108 产生的生物表面活性剂混合物的筛选、鉴定及其在提高原油采收率中的应用方法。通过液滴崩塌试验、油膜扩散试验和乳化指数测定对生物表面活性剂的产生进行初步筛选，并通过测定微生物生长导致的培养基表面张力降低来确认其产生。文献中已有大量关于红球菌属（Rhodococcus）产生糖脂类生物表面活性剂（如鼠李糖脂和海藻糖脂）的报道19,...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢印度政府生物技术部提供的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 ml 移液管德国艾本多夫G54412G
1H NMR布鲁克 Avance AV-III 型波谱仪，美国
20 μl 移液器Thermo Scientific，美国H69820
高压灭菌印度贾伊斯博编号 5923Jain Scientific
蓝色火焰燃烧器Rocker scientific，中国台湾龙 200
丁醇GLR inovations，印度GLR09.022930
C18 色谱柱美国安捷伦科技公司770995-902
离心德国艾本多夫5810R
氯仿默克，印度1.94506.2521
氯仿-d印度 SRL57034
Falcon 管塔森斯，印度546041辐射灭菌聚丙烯
傅里叶变换红外光谱（FT-IR）Thermo Fisher Scientific，美国 Nicolet iS50
通风橱印度，凯拉47408定制的
冰醋酸默克，印度1.93002
玻璃珠默克，印度104014
载玻片Polar工业公司，美国蓝星75 mm * 25 mm
玻璃棉印度默克104086
盐酸默克，印度1003170510
培养箱赛默飞世尔科技，美国MaxQ600摇床培养箱
培养箱印度，凯拉Sunbim
碘，再升华默克，印度231-442-4 重升华颗粒
K12 –克鲁斯表面张力仪Kruss Scientific，德国K100
层流空气净化台赛默飞世尔科技，中国1300 系列 A2
LCMS安捷伦科技公司，美国1260 Infinity II
LB肉汤印度 HIMEDIAM575-500G粉末
甲醇默克，印度107018
茚三酮印度 Titan Biotech 有限公司1608
对-茴香醛Sigma，美国204-602-6
培养皿塔尔逊斯，印度460090-90 MM辐射灭菌聚丙烯
皂苷默克，印度232-462-6
氯化钠默克，印度231-598-3
试管印度博罗斯9800U06玻璃管
薄层色谱板默克，印度1055540007
涡旋GeNei，印度2006114318
水浴锅印度SW21C

参考文献

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