完整小鼠和斑马鱼脑组织中的深层组织三光子荧光显微镜成像

摘要

三光子显微镜能够以高时空分辨率对活体生物组织（如小鼠和斑马鱼大脑）深处进行高对比度荧光成像。

摘要

多光子显微技术，例如双光子显微术（2PM）和三光子显微术（3PM），是用于深层组织成像的强大工具 体内 具有亚细胞分辨率的成像。与生物学实验室广泛使用的双光子显微镜（2PM）相比，三光子显微镜（3PM）在深层组织成像方面具有两大主要优势：（i）采用约1,300 nm或约1,700 nm的激发激光，可在散射组织中实现更长的衰减长度；（ii）由于更高阶的非线性激发，背景荧光产生更少。因此，3PM能够在散射组织内部实现高对比度的结构与功能成像，例如从小鼠大脑皮层至海马体的完整脑组织，以及成年斑马鱼的整个前脑。

目前，适用于三光子显微成像（3PM）的激光光源已有商业化产品，使得现有的双光子（2P）成像系统可以改装为三光子（3P）系统。此外，多种商用三光子显微镜也已上市，使该技术能够被生物学研究实验室便捷地采用。本文展示了典型三光子显微成像系统的优化方法，特别面向已具备双光子系统的生物学研究团队，并演示了在完整小鼠和成年斑马鱼脑组织中进行的活体三维成像。本实验方案涵盖了三光子成像的完整实验流程，包括显微镜光路校准、约1300 nm和约1700 nm激光脉冲的预啁啾调节、动物准备，以及在成年斑马鱼和小鼠脑组织深层进行的活体三光子荧光成像。

引言

在生命科学领域，多光子显微技术（MPM），例如双光子显微术（2PM）和三光子显微术（3PM），已成为实现深层组织成像的有力工具 体内 在散射组织中实现高时空分辨率和高对比度成像。此外，与单光子共聚焦显微镜相比，这些方法引起的光漂白更少。^1,2,3,4与双光子显微镜（2PM）相比，三光子显微镜（3PM）在深层组织成像方面具有优势，主要归因于两个特征：（i）采用更长波长的激发光（约1,300 nm或约1,700 nm），可减少组织对光的散射；（ii）更高阶的激发过程（即3PM中的荧光信号与激发光功率的三次方成正比，而非2PM中的二次方），可有效抑制非特异性背景荧光³因此，三光子显微技术（3PM）能够在活体组织更深层区域实现高对比度成像，例如完整成年小鼠脑中的海马区^{3,5,6,7,8,9,10,11} 成年斑马鱼的整个前脑¹²，包括 Ca²⁺ 活动记录与多色观察。此外，通过小鼠和成年斑马鱼的完整颅骨，已利用三光子显微镜（3PM）获得高对比度图像。^12,13.

目前，适用于约1300 nm和约1700 nm波长进行三光子激发（3PE）的激发激光光源已可商业化获得。由于激光扫描系统在双光子显微镜（2PM）和三光子显微镜（3PM）中基本相同，因此在生物学实验室中，通过加装 commercially available 的三光子激发激光器，即可将现有的双光子系统改装为三光子系统。三光子荧光信号依赖于激光功率、脉冲持续时间、激光重复频率以及物镜的数值孔径（NA）。假设为衍射极限聚焦（即激发光束完全充满物镜后光阑），公式（1）描述了由三光子激发产生的焦体积内时间平均的荧光光子通量。

（1）

何处 f 是激光重复频率， τ 是激光脉冲持续时间（半高全宽）， ϕ 是系统的收集效率， η 是荧光量子效率， σ₃ 是三光子吸收截面， C 是荧光团的浓度， n₀ 是样品介质（如水）的折射率， λ 是真空中的激发波长， NA 物镜的数值孔径， a₃ 是焦体积的空间积分常数， 是物镜下激发光子通量的时间平均值（光子/秒）， z 是成像深度，且 EAL 是有效衰减长度¹⁴. 此处我们假设 EAL（通常 > 100 µm）远大于显微镜的轴向分辨率（通常 < 10 µm）。在近轴近似条件下， a₃ 等于 28.1¹⁴. g_p⁽³⁾ 是第3个^rd激发光源的时间相干性，以及 g_p⁽³⁾ 对于双曲正割平方脉冲和高斯脉冲分别为0.41和0.51。收集效率 ϕ 可通过考虑物镜的荧光收集效率、物镜透射率、二向色镜反射率、滤光片透射率以及探测器的检测效率（例如光电倍增管，或PMT）来估算。由于三光子（3P）荧光强度高度依赖于多种参数，因此需要优化3P系统以最大化3P荧光信号。

本方案阐述了典型三光子（3P）成像系统的优化过程，尤其适用于已配备双光子（2P）成像系统并计划将其功能扩展至三光子成像，或希望维持商用三光子系统处于最佳性能状态的生物学实验室。本视频文章还展示了在活体动物大脑中进行的深层组织三光子成像。第一部分介绍了使用商用激光源和多光子显微镜对典型三光子系统进行优化的方法。第二和第三部分分别描述了斑马鱼和小鼠在神经结构与神经活动三光子显微成像前的制备步骤。小鼠颅骨开窗手术此前已在多个方案文献中报道过^15,16,17。第四部分展示了在斑马鱼和小鼠大脑中进行的活体三光子成像。

方案

所有斑马鱼和小鼠的动物实验及饲养程序均经康奈尔大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并遵循其指导原则进行。实验结束后，斑马鱼通过高浓度三卡因溶液实施安乐死，小鼠则通过二氧化碳窒息法实施安乐死。

1. 三光子显微镜系统的优化

注意：佩戴激光防护眼镜以保护眼睛。在放置或移动光学元件时，使用光束挡板遮挡激光束。为观察激光，可使用红外观察仪或红外探测卡。

1. 打开激光器，并将非共线光学参量放大器（NOPA）的闲频光输出中心波长设置为约1,300 nm或约1,700 nm。
2. 在NOPA信号端口（即约700–900 nm）的光路中放置一片薄盖玻片，以反射一小部分激光束至硅光电二极管，从而获得触发信号（图1）。在盖玻片的透射路径中放置一个光束挡块。
3. 在光路中放置脉冲压缩器，对飞秒激光进行预啁啾，以优化三光子显微成像（3PM）的脉冲持续时间。对于约1,300 nm的光束，使用棱镜对压缩器^18,19（例如N-SF11棱镜对）。对于约1,700 nm的激光，使用厚度约为3 mm的硅片²⁰。将硅片与激光路径之间的角度设置为布儒斯特角（对于1,700 nm约为73.9°），以最大化激光透射率。通过最小化反射来旋转硅片以达到布儒斯特角。
4. 放置翻转镜，以便在约1,300 nm和约1,700 nm的光路之间方便切换。
5. 在旋转台上安装半波片（例如适用于约1,300 nm和约1,700 nm的消色差半波片），并配合偏振分束器（PBS）以控制激光强度。在PBS的反射路径中放置一个光束挡块。
   注意：激光需垂直通过PBS，以实现高消光比。通过旋转半波片来控制3PM所需的激光功率。
6. 在功率控制器之后、光学快门之前的位置将一片薄盖玻片置于光路中，以反射一小部分激光束至功率计。将该功率计作为“参考功率计”，用于计算成像过程中物镜下的激光功率（见步骤1.12）。
7. 通过调节反射镜对激光光路进行准直，使光束进入3PM系统。
8. 使用平移台上的刀口法和功率计测量物镜后孔径位置处的光束尺寸。确保光束尺寸不过小或过大。
   注意：通常情况下，光束应略小于高数值孔径（NA）物镜的后孔径，以在深层组织成像中实现较高的功率透过率。例如，在奥林巴斯物镜的后孔径（后孔径直径约15 mm）处，光束尺寸约为10–13 mm（1/e²）有助于实现约0.7–0.9的有效NA。当光束尺寸过小时，由于有效NA较低，三光子信号变弱且空间分辨率下降；当光束尺寸过大时，由于物镜后孔径处的功率损耗，物镜下可获得的最大激发功率会减弱。对于深层组织成像，边缘光线因在组织中传播路径更长而遭受更高的损耗。
9. 如果物镜后孔径处的光束尺寸不合适，则在激光光路中加入适当的光学元件（如凸透镜）以调整光束尺寸。
   注意：确保激光光束不超过振镜的尺寸，以避免不必要的功率损失。
10. 将物镜安装到3PM系统上。
11. 使用自相关仪测量经过物镜后的脉冲持续时间。如果脉冲持续时间过长（例如>70 fs），则调节脉冲压缩器以获得更短的脉冲。3PM实验中使用约50–70 fs的脉冲，并在激光器与物镜之间放置迈克耳孙干涉仪，为自相关测量提供延迟。
    注意：可在物镜焦点处放置具有适当光谱响应的光电二极管（例如，对于波长大于1,200 nm的情况使用硅光电二极管），作为非线性探测器，利用其双光子光电流获取自相关曲线²⁰。约1,300 nm的棱镜对压缩器可通过两种方式调节：（1）改变两个棱镜之间的距离；（2）通过垂直于棱镜基线方向移动棱镜，改变激光在棱镜玻璃中的光程长度。约1,700 nm的硅片压缩器可通过更换更厚或更薄的硅片进行调节。
12. 在物镜输出端放置功率计。测量物镜下的激光功率，并读取参考功率计（来自步骤1.6）的数值。计算物镜下功率与参考功率计处功率的比值。
    注意：在成像过程中，可通过该功率比值和参考功率计的读数计算物镜下的实际激光功率。
13. 从物镜下方移除功率计。
14. [可选] 验证成像系统的光子散粒噪声极限性能
    注意：执行此任务需要以下元件：1）一个荧光素或德克萨斯红染料池（例如，约10 µM），2）一个光子计数器，以及3）一台示波器。
    1. 将染料池样品置于3PM物镜下方。
    2. 小心地将物镜缓慢下降至染料池上，使距离小于物镜的工作距离。
    3. 在物镜与染料池盖玻片之间加入水。
    4. 将显微镜输出功率设为较小值（例如，<1 mW，脉冲重复频率约1 MHz），以定位染料池表面。
    5. 启动显微镜的实时模式，并将z位置设为零。
    6. 缓慢将物镜远离样品，直至到达染料池顶部（由盖玻片产生的三次谐波生成（THG）信号指示）。
    7. 在盖玻片位置处将z位置设为零。
    8. 轻微降低物镜，直到荧光通道中出现清晰的荧光信号。
    9. 将光电倍增管（PMT）的输出连接至BNC分路器。将分路器的输出分别连接至光子计数器和图像采集系统。
    10. 将激光功率设置为光子计数每秒低于激光重复频率5%的值（例如，使用1 MHz激光时为50,000 光子/秒）。
    11. 使用软件将视场缩小至最小，并确保图像亮度均匀。
    12. 将帧率设为每秒1.0帧。
    13. 将光子计数器的采集周期设为t = 每帧像素数 × 像素驻留时间，并设置合适的判别器电平。
    14. 在相同时间段内同时采集光子计数和像素计数。为获得像素计数，需采集整幅图像的平均像素值，以及均值和标准差。
    15. 重复步骤1.14.14，但阻断激发激光，以获取暗背景下的光子计数和像素计数。
    16. 停止软件的实时采集。
    17. 从步骤1.14.14获得的光子计数和总像素计数中减去步骤1.14.15获得的暗计数。
    18. 将扣除暗计数后的总像素计数除以扣除暗计数后的光子计数（来自步骤1.14.17），所得值作为“转换因子”（即像素值/光子），用于将像素值转换为光子计数。
    19. 将步骤1.14.14获得的像素计数的均值和标准差除以步骤1.14.18获得的“转换因子”，转换为光子计数。比较光子计数的均值与标准差。若成像系统性能接近散粒噪声极限，则标准差应近似等于光子计数均值的平方根。
15. [可选] 验证显微镜的信号探测效率。
    1. 为测试显微镜性能和信号探测效率，请按照步骤1.14.1–1.14.17获取光子计数。在步骤1.14.15中，制备由染料溶剂构成的空白样品，在与染料池相同的激光功率下开启激光并获取空白样品的光子计数。从染料池的光子计数中减去空白计数，得到荧光光子计数。
    2. 利用已知的荧光素或德克萨斯红的三光子截面值^10,22，结合公式（1）（使用有效NA以正确反映后孔径填充情况），计算预期的光子计数，并将计算值与实验测得的光子计数进行比较。将两种光子计数均记录在实验记录本中，作为显微镜性能的测试结果，供日后参考。
       注意：确保计算值与测量值接近（例如，在两倍范围内）。此类系统定量测试对于确保长期成像性能的一致性尤为有用。

2. 3PM 实验用鱼的准备

注意：进行此操作时需佩戴手套和实验服。根据实验要求选择成年斑马鱼。在约15分钟内完成全部准备工作（步骤2.1至2.7）。

1. 准备一个培养皿，加入约 0.5 cm 厚的 2% 高熔点琼脂。在琼脂中切出一个比斑马鱼稍长且略宽的矩形孔。用石蜡将细管（用于向鱼口中灌注液体）固定在培养皿上，使其一端位于矩形孔内。用石蜡将较粗的管道（用于排出液体）固定在培养皿边缘。
2. 选择用于实验的斑马鱼。使用 Hank's 溶液配制的 0.2 mg/mL 三卡因溶液（pH 7.2）对鱼进行麻醉，直至其完全无反应并深度麻醉。
3. 将鱼侧放在湿润的海绵上。使用微量注射器，经眼后途径向鱼体内注射 3 µL 潘库溴铵（0.4 µg/µL，溶于 Hank's 溶液），以使鱼瘫痪。短暂将鱼放入 Hank's 溶液中，确认其已完全瘫痪。
4. 将鱼背侧朝上放置于培养皿中，头部朝向管道方向。用镊子调整管道位置，轻轻打开鱼的口部，并将管道滑入口中。轻柔地将鱼向管道方向移动，使管道位于鱼口腔后部。
5. 迅速但轻柔地擦干鱼周围的琼脂，并去除鱼体表面的水分。将一小块实验室纸巾浸入实验室胶水中，然后将纸巾贴在鱼体两侧的琼脂上，并覆盖在鱼鳃后方的背部。
   注意：切勿对鱼施加压力或按压。注意避免胶水接触鱼鳃。
6. 直接在鱼头部表面滴加少量布比卡因，以在成像过程中对激光接触皮肤的区域进行局部麻醉。
7. 将带有鱼的培养皿移至显微镜下，并加入养殖系统用水。将管道连接至水泵，以 2 mL/min 的流速将系统水持续泵入鱼口中，同时以相同速率从培养皿中排出灌注液。确保通过气泡器对水体进行氧合，并使用水族箱加热器将水温维持在约 30 °C。
   注意：此时鱼已准备好进行成像。在成像过程中，可通过监测第三谐波生成（THG）信号中的血流情况来评估鱼的健康状态（见第 4.1 节）。三光子（3P）成像也可兼容更复杂的鱼体固定方式，例如在双光子（2P）成像中用于固定头部并允许身体活动的虚拟现实实验设置²³。这种完全非侵入式的成像方法避免了在其他脊椎动物研究中常见的开颅操作，是减少侵入性研究及相关疼痛的重要一步。

3. 3PM 小鼠准备

注意：进行以下操作时需佩戴手套、外科口罩和实验服。根据实验需求选择合适的小鼠品系。手术前，小鼠应饲养在12小时光照-12小时黑暗的循环环境中。整个手术过程（步骤3.2–3.11）需保持无菌，所有手术器械使用前均应灭菌。开颅手术约需1小时。

1. 将一个环形（直径 4.5–6.5 mm）盖玻片和一个圆形盖玻片（直径 5 mm）放置在干净的石蜡膜上。使用针头将少量光学胶涂抹于环形盖玻片上，将其粘附至圆形盖玻片。在紫外光下照射 10–20 分钟，使盖玻片-环形组合固化。将整个盖玻片-环形组合从石蜡膜上取下，并用镊子刮除多余的胶，再用 70% 乙醇清除碎屑。
   注：盖玻片厚度约为 0.17 mm。环形盖玻片用于在长期成像过程中对大脑施加适当压力。
2. 在诱导室中使用 3% 异氟烷和 20% O₂ 气体混合物麻醉小鼠。称量小鼠体重。将小鼠俯卧位放置于加热垫上。将加热垫温度设定为约 37 °C。
3. 将小鼠上门齿固定于立体定位仪的口腔孔中，并安装麻醉面罩。将耳杆固定于双耳。手术期间以 2% 异氟烷和 20% O₂ 气体混合物维持麻醉。
   注：通过监测小鼠反应调节异氟烷浓度。术前观察呼吸频率（深睡状态下约为 1 Hz）并轻捏足部检查有无反应，以评估麻醉深度。
4. 为双眼涂抹眼膏以润滑。闭合眼睑。打开所有手术照明灯。根据小鼠体重，在术前皮下注射酮洛芬、地塞米松和格隆溴铵。
   注：酮洛芬、地塞米松和格隆溴铵的药物浓度分别为 2 mg/mL、0.1 mg/mL 和 0.1 mg/mL。注射体积根据体重计算，分别为 2.5 µL/g、2 µL/g 和 2 µL/g。
5. 去除头顶及耳周毛发。
   1. 使用剪刀或电动剃毛器尽可能剪除毛发，并清除手术区域的碎发。
   2. 涂抹适量脱毛膏。等待 1 分钟。
   3. 使用浸有生理盐水的棉签擦除毛发和脱毛膏。
   4. 重复步骤 3.5.2 和 3.5.3，直至毛发完全去除。
   5. 在皮肤上依次涂抹 5% 聚维酮碘溶液和 70% 乙醇进行消毒。重复该过程三次。
6. 在头部皮下注射阿托品（剂量根据体重，0.02–0.05 mg/kg）。等待 1 分钟。
7. 切开头顶皮肤以暴露颅骨。确保前囟点和后囟点均暴露。使用生物相容性胶水将剩余皮肤组织边缘粘附于颅骨上，防止钻孔产生的骨屑进入皮下（可能引发免疫反应）。
8. 使用外科标记笔在目标区域绘制一个直径为 5 mm 的圆。例如，选择位于前囟外侧约 2.5 mm、尾侧约 2 mm 的位置为中心，该区域可覆盖大部分体感皮层和视觉皮层。
9. 沿所画圆线缓慢钻孔，钻至一半时用生理盐水润湿颅骨。最后阶段降低钻速，移除颅骨前用生理盐水覆盖。用镊子轻柔打开颅骨，并立即用一块浸有生理盐水的无菌明胶海绵按压止血。持续使用生理盐水保持脑组织湿润。
10. 在已制备的盖玻片-环形组合中面向脑组织的一侧滴加一滴生理盐水。将盖玻片-环形组合的凸出圆盘部分置入颅窗内。利用立体定位仪固定长杆，轻压盖玻片圆盘部分使其紧贴脑表面，确保环形部分紧密覆盖颅骨。用棉签擦干盖玻片-环形组合周围的区域。
11. 在环形边缘下方涂布一层生物相容性胶。在盖玻片-环形组合的环形部分下方及周围涂布一层牙科水泥混合物。在牙科水泥上方再覆盖一层胶。手术期间可每小时皮下注射 5% 葡萄糖（剂量根据体重，10 µL/g），以提供动物能量。
12. 关闭麻醉系统。将小鼠从立体定位仪中取出。立即将小鼠转移至定制的紧凑型立体定位装置，该装置配备约 37 °C 的加热垫和麻醉设备。
13. 将小鼠俯卧位放置于定制紧凑型立体定位装置的加热垫上。将温度设定为约 37 °C。将小鼠上门齿固定于立体定位仪的口腔孔中，耳杆固定于双耳。连接麻醉管路，以 1.5% 异氟烷和 20% O₂ 气体混合物维持麻醉。
    注：小鼠现已准备就绪，可进行成像。在后续成像过程中保持小鼠处于麻醉状态。通过监测小鼠反应调节异氟烷浓度。

4. 斑马鱼和小鼠大脑的活体成像

1. 斑马鱼大脑的活体成像
   注意：为了在物镜下准确定位鱼脑，使用与激发光同一路的辅助电荷耦合器件（CCD）相机进行宽场成像。
   1. 设置显微镜并校准输出功率（如第1节所述）。
   2. 在显微镜上安装低倍率（通常为4倍）物镜。
   3. 将装有鱼和导管的培养皿置于显微镜下。
   4. 使用发光二极管（LED）光源照亮培养皿。
   5. 打开图像采集软件的相机模式（图2）。
   6. 点击实时。
   7. 在屏幕右侧选择通道A。
   8. 调整直方图设置以清晰显示图像。
      注意：应根据需要随时更新这些设置。
   9. 将电机控制器上的电机设置调整为基座。
   10. 缓慢降低物镜，直到可见鱼体。
       注意：确保物镜不与鱼头发生任何物理接触。
   11. 将鱼头中心置于视野中央。
   12. 将物镜向上移动，远离鱼头。
   13. 用高数值孔径（NA）物镜替换低倍率物镜，用于三光子显微成像（3PM）。
       注意：低倍率物镜与高NA物镜无需完全齐焦，但必须足够接近，以确保鱼位于高NA物镜的视野范围内。
   14. 缓慢降低物镜，确保其不与鱼头接触。在CCD相机软件中，当头部顶部可见时停止移动物镜，并将z位置设为0 μm。
       注意：使用水浸物镜时，确保物镜下方无气泡。
   15. 关闭LED光源，并拉上系统周围的遮光帘。
   16. 将图像采集软件设为多光子GG模式以进行三光子成像，并将物镜下的功率设置为低于1 mW（脉冲重复频率约为1 MHz）。
   17. 在电机控制器上将电机设置按钮从基座切换至物镜。
   18. 调暗室内灯光。
   19. 打开光电倍增管（PMT），并开启三光子激发光源的快门。确保由于组织自发荧光在荧光信号通道中出现骨轮廓，同时由于骨的三次谐波产生（THG）在THG信号通道中也可观察到轮廓（图2C）。
   20. 通过随成像深度增加而提高功率的方式，在不同深度进行成像。
2. 小鼠大脑的活体成像
   注意：成像过程中每小时向麻醉小鼠注射一次5%葡萄糖溶液；剂量依据体重计算（10 µL/g）。
   1. 将图像采集软件设为多光子GG模式以进行三光子成像，并将物镜下的功率设置为低于1 mW（脉冲重复频率约为1 MHz）。
      注意：确保手术窗口与物镜垂直，以减少像差。可通过倾斜立体定位仪进行微调。
   2. 将物镜移近窗口，并在物镜与颅窗之间加入水；将所有电机的轴值设为零。
      注意：水在约1,700 nm处的光吸收较强，导致经过约1–2 mm水层后，1,700 nm激光功率显著衰减。对于1,700 nm激发，建议使用重水（D₂O）作为浸没介质，因其在1,700 nm处的吸收远小于普通水（H₂O），可有效降低水对激光的吸收。
   3. 在图像采集软件中点击实时按钮，并打开PMT通道，例如一个荧光信号通道和一个THG信号通道。根据需要调节PMT增益和背景水平。
   4. 缓慢上移物镜，通过监测大血管和窗口玻璃表面产生的THG信号来定位窗口表面。如有需要，调整窗口方向（参见步骤4.2.12的注释）。将电机归零，以定义脑表面位置。
   5. 进行成像，并根据成像深度调整激光功率。

结果

该方案成功完成后，将获得正确校准的显微镜，具备最佳的光照参数（如脉冲持续时间、数值孔径）以及适用于后续实验的动物样本制备 体内 3PM。商用的3P系统包含适用于约1,300 nm和约1,700 nm的合适反射镜和透镜；因此，在1,300 nm与1,700 nm激发波长之间切换时，无需更换光学元件。若3P系统的透镜不具备适用于1,300 nm和1,700 nm的适当镀膜，则需更换为合适的透镜以减少激光功率损耗。通过优化的3PM系统及适当的动物准备， 体内 可在脑组织深层采集到高对比度的荧光和三次谐波成像图像。

图3展示了完整成年斑马鱼的代表性三光子（3P）图像。利用三光子显微镜（3PM），可对成年斑马鱼大脑中基因标记的神经元实现高分辨率、非侵入性和深层成像。尽管已有研究报道使用双光子显微镜（2PM）对成年斑马鱼大脑的端脑区域进行成像^24,25,26,27，但3PM能够覆盖整个端脑以及使用其他技术难以或无法观察到的更深层区域。图3C中可观察到视顶盖和小脑中的细胞层分布。在成功的成像过程中，三次谐波生成（THG）通道中可见颅骨结构，而荧光通道中可见神经元。对于成年斑马鱼的成像，使用显微镜的相机功能来定位鱼体位置（图3A）。此步骤在小鼠脑成像中并非必需，因为小鼠颅窗较大，大脑易于定位。利用前文所述系统，获得了成年斑马鱼脑的高分辨率结构图像。颅骨在THG通道中可见（图3B），有助于导航脑组织并确定其表面位置。如图3C所示，在成年斑马鱼脑深层，神经元仍能以高信背比（SBR）清晰分辨。由于自发荧光，脑组织上方的结构在荧光通道中亦可见。

图4 显示了成年小鼠脑组织中使用1,340 nm激发光获得的多色三光子（3P）成像结果，包括GCaMP6s标记的神经元（绿色）、Texas Red标记的血管（红色）以及三次谐波产生（THG）信号（蓝色）¹⁰。这些图像引自先前的研究工作¹⁰。在图4中，为了获得足够的荧光和THG信号，焦点处的脉冲能量在整个成像深度范围内保持在约1.5 nJ，激光最大平均功率约为70 mW。脉冲持续时间调整为约60 fs，有效数值孔径（NA）约为0.8。通过对三光子显微镜（3PM）系统的优化，成功获取了来自脑表面下深达1.2 mm的海马CA1区的高对比度图像（图4A、B）。图4C、D 展示了在深度750 µm处GCaMP6s标记神经元在10分钟记录期间的Ca²⁺活性轨迹，显示出高保真的记录效果。

如果激发激光未对准，可能会观察到视场内信号亮度不均匀。此外，如果激光参数（如脉冲持续时间、焦点处的激发脉冲能量和有效数值孔径）未优化，则无法观察到鱼颅骨或小鼠脑部开颅窗口的三次谐波生成（THG）图像，和/或需要较高的激发脉冲能量（例如，焦点处 >2 nJ/脉冲）。因此，在开始深层组织成像之前，脑表面的THG信号可作为3PM系统是否已优化的参考指标。

图1：三光子显微镜（3PM）装置示意图。 激发激光的波长设定在约1,300 nm或约1,700 nm，由非共线光学参量放大器（NOPA）的闲频输出端提供。棱镜对压缩器和硅片压缩器分别用于对1,300 nm和1,700 nm激光进行预啁啾校正。1,300 nm和1,700 nm的激光光束可通过翻转镜进行切换。NOPA的信号输出端用于获取触发信号。半波片和偏振分束器（PBS）用于控制激发光功率。荧光和三次谐波产生（THG）信号由GaAsP光电倍增管（PMT）检测。通过合适的二向色镜和带通滤光片组合，实现荧光与THG信号的分离。缩写：3PM = 三光子显微术；NOPA = 非共线光学参量放大器；PBS = 偏振分束器；THG = 三次谐波产生；DAQ = 数据采集；PMT = 光电倍增管。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：鱼类活体成像的代表性截图（实验方案第 4.1 节）。（A）图像采集软件的相机模式视图，使用4倍物镜。软件的主要功能以数字标出，如下所述：1. 图像采集软件的成像模式，可选模式包括相机、多光子和多光子 GG。使用CCD相机进行白光成像时，选择相机模式。2. 点击实时按钮可开启相机（或多光子模式下的PMT），从而观察显微镜的实时图像。3. 在采集设置选项卡中，设定所需的成像参数（功率、位置、深度）。4. 在采集选项卡中，指定图像保存的文件夹位置，并可在此启动成像。5. Z轴控制设置通过移动Z轴电机来调节成像深度。6. 斑马鱼头部的代表性图像，头部前端位于左侧。（B）使用25倍物镜时相机模式的代表性视图。（C）多光子 GG模式的代表性视图，显示（B）中图像的THG成像。缩写：CCD = 电荷耦合器件；PMT = 光电倍增管；THG = 三次谐波生成。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：使用图像采集软件获取的成年斑马鱼脑的代表性图像。（A）使用4倍物镜获取的成年斑马鱼头部的相机模式图像。图像上方为吻侧方向。视顶盖（OT）叶和小脑（CB）已标出。（B）使用25倍物镜在多光子GG模式下获取的代表性图像，包含（A）的三次谐波生成（THG）图像。（C）成年斑马鱼脑中小脑与视顶盖交界区域的荧光图像，其中绿色荧光蛋白（GFP）在不同深度神经元的细胞质中表达。比例尺 = 100 µm。缩写：OT = 视顶盖；CB = 小脑；THG = 三次谐波生成；GFP = 绿色荧光蛋白。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：小鼠脑组织中GCaMP6s标记的神经元（绿色）、Texas Red标记的血管（红色）以及三次谐波产生信号（蓝色）在1,340 nm激发下的多色三光子显微成像（3PM）。（A）从脑表面开始向下成像至深度1,200 µm的Z轴层扫图像，视场为270 × 270 µm（每帧图像512 × 512像素）。根据成像深度调整激光功率，以保持焦点处脉冲能量约为1.5 nJ。物镜下的最大平均功率为70 mW。（B）不同成像深度处选取的二维图像。（C）硬脑膜下750 µm处的神经活动记录位置，视场为270 × 270 µm（256 × 256像素）。（D）在清醒小鼠中记录到的来自（C）中标记神经元的自发脑活动轨迹。成像帧率为8.3 Hz，像素驻留时间为0.51 µs。激光重复频率为2 MHz，物镜下的平均功率为56 mW。每条轨迹均以其基线进行归一化，并使用时间常数为0.72 s的汉明窗进行低通滤波。比例尺 = 50 µm。本图及图注引自¹⁰。缩写：3PM = three-photon microscopy（三光子显微术）。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：小鼠脑新皮层中的有效衰减长度。 有效衰减长度（EAL，品红色线）由组织散射（红色线）和组织中水的吸收（蓝色线）计算得出，假设水含量为75%。黑色星号表示在小鼠脑新皮层中报道的EAL实验数据^3,21,28,29。请注意，EAL在不同组织中有所变化。缩写：EAL = 有效衰减长度。 请点击此处查看该图的放大版本。

激发波长 (nm)	浸没介质：水	最大激光功率 (mW)	焦点处最大脉冲能量* (nJ)	小鼠皮层中的典型EAL (µm)	小鼠皮层中的成像深度** (mm)	物镜下方的脉冲能量*** (nJ)	最大激光重复频率**** (MHz)
1300	H2O 或 D2O	100	2	~300	0.8	~14	~7
					1.2	~55	~2
					1.6	~210	~0.5
					2.1	~1100	~0.1
1700	D2O	50	3	~400	0.8	~7	~7
					1.2	~20	~2.5
					1.6	~55	~1
					2.1	~190	~0.3

表1：小鼠皮层成像中典型的三光子激发条件。
*使用高数值孔径（约1.0）物镜、脉冲宽度约50 fs，以及典型荧光团（如荧光蛋白GFP和RFP）时的条件。
**假设有效衰减长度（EAL）在整个皮层中均匀分布。
***为在焦点处达到约1 nJ/脉冲的能量，根据EAL和成像深度计算得出。
****根据物镜下的脉冲能量和激光器允许的最大功率计算得出。
缩写：3P = 三光子；NA = 数值孔径；GFP = 绿色荧光蛋白；RFP = 红色荧光蛋白；EAL = 有效衰减长度。

讨论

本方案详细说明了使用商用显微镜和激光光源建立三光子成像（3P成像）的逐步操作流程。与双光子显微成像（2PM）相比，三光子显微成像（3PM）在需要深入组织光学观测的应用中具有优势，例如小鼠脑 hippocampus 区域的成像。尽管3PM主要应用于神经科学领域，但它也有望用于其他组织，如淋巴结、骨骼和肿瘤，以实现深层组织的观察。

必须验证成像系统是否接近散粒噪声极限运行，以确保在光电倍增管（PMT）之后，检测和数据采集电子元件对图像引入的噪声可忽略不计。所检测光子数的不确定性从根本上受限于光子散粒噪声。在典型的多光子显微镜中，使用高增益光电探测器（例如光电倍增管）即可实现接近散粒噪声极限的性能。光子散粒噪声遵循泊松统计分布，其分布的标准差等于该分布均值的平方根。为验证系统是否达到散粒噪声极限性能，请遵循方案部分的步骤1.14。

为避免H引起的光衰减₂O，使用 D₂对于浸入式应用非常有帮助，特别是在约1,700 nm激发时。当D₂若使用 O，则必须更换 D₂约每10分钟一次，或使用大量D₂O 以避免 D₂O/H₂成像过程中防止气体交换。也可将 D₂来自室内环境的O³. 如果使用长工作距离（WD）物镜（例如，工作距离为4 mm或更长）进行成像，则浸没液体的厚度可超过2-3 mm。增加的厚度会使H₂即使在约1,300 nm处，O吸收也不可忽略²¹因此，D₂即使使用长工作距离的物镜，对于1,300 nm的三光子显微成像（3PM）而言，O可能仍是必要的。

由于三光子（3P）荧光强度与焦点处激发脉冲能量的立方成正比（公式（1）），设定合适的激光功率对于在获得足够三光子荧光信号的同时避免活体组织中的热效应和非线性损伤尤为重要。平均激光功率应保持在热损伤阈值以下。例如，在小鼠大脑中，为避免热损伤，当激发波长为~1,300 nm、成像深度为1 mm、视场（FOV）为230 µm × 230 µm时，小鼠脑表面的平均功率应保持在约100 mW或更低²¹。类似地，在~1,700 nm激发、深度约1 mm、视场约230 µm × 230 µm时，平均功率应保持在约50 mW或更低（未发表数据）。此外，为避免激发饱和和潜在的非线性损伤，激发脉冲能量应分别控制在~1,300 nm时低于2 nJ，以及~1,700 nm时低于3 nJ³⁰。

由于组织对光的吸收和散射，脉冲能量在穿透1个有效衰减长度（EAL）的组织后，会衰减至初始值的1/e（约37%）。EAL随不同组织类型及激发波长而变化；例如，在小鼠脑新皮层中，激发波长分别为约1,300 nm和约1,700 nm时，EAL分别约为300 µm和400 µm^3,29（图5）。因此，为了在深度为n个EAL的位置保持相同的聚焦脉冲能量（例如1 nJ/脉冲），入射表面的脉冲能量需乘以1 nJ × eⁿ。为了实现对结构和功能动态的快速成像，宜采用高重复频率（1 MHz或更高）的激发激光器，以获得较高的帧率^5,6,7,10。然而，脉冲能量需求与激光器的平均功率限制制约了可使用的重复频率范围。

例如，当使用1300 nm激发光在小鼠大脑皮层中对约4个衰减长度（EALs，即约1.2 mm深度）的中等深度区域进行成像时，为保持焦点处每脉冲1 nJ的能量，表面每脉冲需要约55 nJ的能量。当平均功率限制为100 mW时，可采用约2 MHz的激光重复频率。然而，当成像深度增加至7个EALs时，为在焦点处维持每脉冲1 nJ的能量，表面每脉冲需要约1100 nJ的能量。假设为避免热损伤，最大平均功率仍为100 mW，则激光重复频率需降低至0.1 MHz，以实现表面每脉冲1100 nJ的能量。表1总结了小鼠大脑皮层成像的典型条件。需要注意的是，表1中的成像深度假设在整个小鼠大脑皮层中EAL是均匀的。

此外，由于深部组织三光子显微成像（3PM）中激光功率的限制，成像帧率与图像像素尺寸之间存在权衡关系，这在钙成像等功能成像中尤为重要。在每个成像深度下，激光的最大可用重复频率由焦点处所需的脉冲能量和可应用的平均激光功率决定，如上所述，例如在相当于约4个等效衰减长度（EAL）的深度处，使用1,300 nm激发时，重复频率为2 MHz。通常情况下，每个像素至少需要一个激光脉冲。因此，最小可用的像素驻留时间由激光重复频率决定，例如在2 MHz激发下，驻留时间为0.5 µs/像素。

为了在三光子（3P）成像中保持高空间分辨率（横向分辨率约1 µm），理想情况下应将1个像素设置为约1 µm²的面积，例如，对于250 × 250 µm²的视场（FOV），采用256 × 256像素。因此，若要在具有较大视场（例如250 × 250 µm²，256 × 256像素）的情况下实现快速成像，脉冲重复频率为0.5 MHz、1 MHz和2 MHz时，理论上的最大帧率分别约为7.6、15和30帧/秒。同样，根据目标成像深度、扫描速度和视场大小，优化激光重复频率至关重要，以便在热损伤阈值以下提供足够的脉冲能量。为了提高成像速度，可采用自适应激发光源，通过按需向神经元递送激光脉冲，将所有激发脉冲集中于神经元（即感兴趣区域）³¹。

与双光子显微成像（2PM）相比，三光子显微成像（3PM）在活体组织深层成像以及透过高散射介质（如颅骨、骨骼和小鼠脑白质层（即外囊））成像方面具有优势。更长的有效衰减长度（EAL）以及三光子激发（3PE）的高阶非线性激发特性有利于深层组织成像。例如，在对小鼠皮层中表达的GCaMP6进行成像时，在深度小于690 µm（即约等于1,300 nm波长下的2.3个EAL）的浅层区域，使用920 nm激发的双光子荧光信号强于使用1,300 nm激发的三光子荧光信号²¹。然而，由于1,300 nm波长下的EAL长于920 nm，当成像深度达到约690 µm及更深时，三光子激发产生的荧光信号强于双光子激发（2PE）²¹。该深度被称为“信号交叉深度”，即在相同重复频率和相同最大允许平均功率条件下，2PE与3PE所产生的荧光信号强度相等的深度²¹。信号交叉深度取决于2PE和3PE所使用的激发波长以及所用荧光分子的特性。

在实际应用中，由于920 nm激发的水吸收较弱，因此允许使用比1,300 nm激发更高的平均激光功率。然而，双光子激发（2PE）的较高平均功率仅能将信号交叉深度推进0.9个衰减长度（EALs）⁴。此外，当样品标记密度较高时，三光子激发（3PE）具有显著更高的信背比（SBR）优势。因此，即使在尚未达到信号交叉深度之前，三光子显微镜（3PM）的成像效果也可能优于双光子显微镜（2PM）。例如，在对小鼠脑血管系统进行成像时，其体积分数（即标记密度）约为2%，在约700 µm深度处，使用100 mW激发功率的1,300 nm三光子显微成像效果优于使用200 mW激发功率的920 nm双光子显微成像，荧光素作为标记物。

在穿透薄而高度散射的组织层进行成像时，三光子显微镜（3PM）也具有优势，因为此类组织层可能扭曲激发光的点扩散函数，并产生离焦背景⁴。例如，在穿透小鼠大脑完整颅骨时，即使成像深度较浅（距脑表面<100 µm），双光子显微镜（2PM）图像仍会受到离焦背景的影响¹³。类似地，在穿透小鼠脑白质时，使用1,280 nm激发光的双光子显微镜也观察到了类似的离焦背景³²。因此，当通过浑浊组织层对生物组织成像时，无论标记密度如何，三光子显微镜在实现高对比度成像方面均优于双光子显微镜。

我们最近报道了一种微珠仿体及理论分析，表明三光子显微成像（3PM）的成像深度极限超过8个有效衰减长度（EALs）³³；在小鼠大脑皮层中，8个EALs相当于使用约1700 nm激发光时的约3 mm深度。然而，目前可用的激光器尚不具备足够的脉冲能量，以在小鼠脑组织中实现8个EALs的成像深度。更强激光器的进一步发展将突破3PM当前的成像深度限制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5% 聚维酮碘	Amazon	NDC 67818-155-32	手术区域的无菌清洁
70% 乙醇	Thermo Fisher Scientific	CAS 64-17-5	手术区域的无菌清洁
琼脂糖	Sigma	A4718-256	制备斑马鱼成像腔
阿托品	Cornell Veterinary Care
Bergamo II	Thorlabs		多光子成像显微镜
布比卡因	Cornell Veterinary Care
地塞米松	Cornell Veterinary Care
环形玻璃（内径4.5，外径6.5）	Potomac Photonics		用于开颅手术的盖玻片
眼膏（或局部眼用软膏）	Puralube Vet Ointment	NDC 17033-211-38	作为润滑剂使用，防止术中和麻醉期间眼部刺激或缓解干眼症状
GaAsP 放大光电倍增管	Thorlabs	PMT2100	光电倍增管探测器
葡萄糖	Cornell Veterinary Care
格隆溴铵	Cornell Veterinary Care
加热器（800 W）	Finnex		斑马鱼养殖用水加热器
异氟烷 USP 250 mL	Piramal	NDC 66794-0013-25	用于小鼠麻醉
酮洛芬	Cornell Veterinary Care
Kimwipes 擦拭纸	Kimtech		用于斑马鱼样品制备的实验室擦拭纸
纳米注射器（10 微米）配 36 G 针头	WPI	NANOFIL + NF36BV	用于注射泮库溴铵的注射器和针头
光学胶	Norland	NOA 68	用于将圆形盖玻片与环形玻璃粘合在一起
泮库溴铵	Cornell Veterinary Care
蠕动泵	Elemental Science	ESI MP2	斑马鱼实验系统的水泵
聚乙烯管（内径 0.58 mm，外径 0.965 mm）	Elemental Science	MP2 泵用管	插入斑马鱼口部的管道
圆形盖玻片，德国玻璃 #1.5，5 mm	Electron Microscopy Sciences	7229605	用于开颅手术的盖玻片
Spirit-NOPA	Spectra Physics		可调谐光学参量放大器
SR400	Stanford Research Systems	SR400	光子计数器
标准光电二极管功率传感器	Thorlabs	S122C	功率探测器
无菌磷酸盐缓冲液（PBS）	Millipore Sigma	SKU 806552-500ml	用于小鼠脑部手术
手术单	Dynarex 一次性毛巾式手术单	4410	用于无菌小鼠手术
细条状封蜡	Corning Rubber Co., Inc.		固定斑马鱼腔室中的管道
ThorImage	Thorlabs		图像采集软件
三卡因（间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）	MP	103106	用于斑马鱼麻醉与安乐死
Tygon 管（内径 1/16 英寸，外径 1/8 英寸）	Tygon		用于斑马鱼样品制备中的水流管道
VaporGuard	VetEquip	931401	用于回收异氟烷
Vetbond 组织粘合剂	3M	1469SB	用于将玻璃窗粘合至小鼠颅骨，以及在制备斑马鱼时粘合实验室擦拭纸
XLPLN25XWMP2	Olympus		多光子激发专用物镜