由B族链球菌诱发的围产期动物模型的剖宫产 链球菌 （GBS）

摘要

本实验方案的目的是描述一种由B族链球菌（Group B Streptococcus，GBS）诱导的绒毛膜羊膜炎的临床前动物模型。该研究旨在探讨其潜在的发病机制、与发育障碍之间的可能因果关系，并最终开发具有转化意义的抗炎性胎盘保护和神经保护治疗方法。

摘要

B族链球菌（Group B Streptococcus，GBS）是妊娠期间人类中最常分离到的细菌之一。它是导致胎盘感染/炎症（称为绒毛膜羊膜炎）的主要原因。绒毛膜羊膜炎使发育中的胎儿面临器官损伤、围产期发病率和死亡率的高风险，以及终身神经行为障碍和其他非神经系统发育问题。从母体和胎儿组织中分离出的GBS最常见的两个亚型为血清型Ia（13%–23%）和III型（25%–53%）。本实验室已建立并表征了一种由GBS诱导的绒毛膜羊膜炎大鼠模型，用于研究其对发育中胎儿中枢神经系统的后续影响，并阐明其潜在的机制。本文介绍了该临床前大鼠模型的设计及其应用，该模型能够高度模拟人类GBS诱导的绒毛膜羊膜炎的典型特征。本文旨在帮助科研人员重现该实验设计，并通过提供故障排除示例给予支持。该模型还有助于揭示目前在由绒毛膜羊膜炎引发的多种发育障碍中尚未明确的病因、机制及潜在治疗途径。此外，该模型的应用还可拓展至研究围产期常见的严重非神经系统疾病，例如影响视网膜、肠道、肺和肾脏的疾病。本研究的主要关注领域是GBS诱导的胎儿神经发育障碍，如脑性瘫痪（cerebral palsy, CP）、注意缺陷多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder, ADHD）和自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）。本文将阐述支持该模型的理论依据，并随后介绍实验步骤与结果。

引言

母体免疫激活（Maternal immune activation, MIA）被认为是早产、胎儿死亡以及子代终身认知和行为障碍的最重要独立风险因素之一^1,2,3,4。目前大量关于妊娠期炎症对胎盘及发育结局影响的临床前研究，通常使用病原体成分来模拟感染，例如来自大肠杆菌（E. coli）的脂多糖（LPS），以及模拟病毒感染的病毒双链RNA合成类似物——聚胞苷酸：聚肌苷酸（Poly[I:C]）。然而，尽管B族链球菌（Group B Streptococcus, GBS）是围产期感染最常见的致病原，但针对其在炎症机制中的作用及相关结局的动物模型研究仍十分有限⁵。

GBS 是一种有荚膜的革兰氏阳性球菌，约 15%–30% 的孕妇下生殖道会定植该菌⁶。它可导致胎盘感染/炎症，称为绒毛膜羊膜炎^7,8。在十种 GBS 血清型中，Ia 型和 III 型是最常见的血清型，是母胎组织损伤的主要感染决定因素^9,10。 研究表明，GBS 感染可引起胎儿血液中更强的炎症反应以及胎盘功能缺陷，这些因素被认为与多种神经发育障碍密切相关，例如脑性瘫痪（CP）、注意力缺陷多动障碍（ADHD）和自闭症谱系障碍（ASD）^5,11。

在过去的十年中，我们建立了一种由B族链球菌（GBS）诱导的绒毛膜羊膜炎大鼠模型，该模型可导致子代出现多种发育障碍¹²。这一临床前模型揭示了GBS诱导的胎盘炎症与子代多种性别特异性的神经发育障碍之间的因果关系^13,14,15。本文旨在帮助读者深入了解妊娠晚期感染的临床前大鼠模型的设计，以及子代由此产生的神经行为功能障碍。本实验方案旨在模拟临床上由GBS引起的绒毛膜羊膜炎的真实情况。

该临床前模型的结果表明，妊娠晚期经腹腔（IP）接种（图1GBS 感染可导致 (i) 胎盘感染和炎症，符合绒毛膜羊膜炎的诊断标准¹⁶；（ii）胎盘内IL-1β及其下游炎症分子在IL-1通路中的显著上调¹²（iii）子代神经发育障碍¹²；（iv）免疫反应及后续神经行为损害中的性别差异，例如雌性子代表现出类似成人注意缺陷多动障碍（ADHD）的特征，而雄性子代则表现出早发且持久的类似自闭症谱系障碍（ASD）的特征；（v）根据诱发绒毛膜羊膜炎的B族链球菌（GBS）血清型不同，子代出现不同的神经行为学结局^14,15与这些发现一致，利用该模型的下一步主要工作将是：首先，验证雄激素在GBS诱导的绒毛膜羊膜炎中的作用；其次，验证靶向特定炎症通路的分子在胎盘和神经保护方面的作用，以期推动其中部分分子进入临床治疗试验的门槛。

方案

所有实验均经麦吉尔大学健康中心研究所（RI-MUHC）批准，并按照加拿大动物护理委员会的规定进行。

1. 妊娠Lewis大鼠

1. 于妊娠第14天（G14）从商业来源获取Lewis大鼠。将它们饲养在适当的动物设施（RI-MUHC动物设施）中，环境温度控制在20–23 °C，光照/黑暗周期为12小时，自由饮水和进食ad libitum¹⁷。
2. 从G14（即到达当天）至G22（即剖宫产当天）每天称量母鼠体重，以监测是否存在疾病相关行为。

2. 细菌生长

1. 在G18日，准备两支无菌试管，每管加入5 mL无菌脑心浸液（BHI）肉汤。从-80 °C取出少量冻存的细菌菌种（含15%甘油的β-溶血性Ia血清型B族链球菌（GBS）BHI菌液¹⁴），接种至5 mL BHI试管中（图2）。
2. 将试管置于摇床中，在37 °C下以240 rpm振荡培养18小时。
3. 在G19日，取1.5 mL培养液加入48.5 mL无菌BHI肉汤中，制备成浓度为3%的GBS无菌BHI溶液。
4. 取1.5 mL 3% GBS与BHI混合溶液加入比色皿中。使用分光光度计测定初始吸光度T₀（光密度（OD）_{600 nm}）。
   注：每次测定前均使用无菌BHI肉汤作为空白对照校准分光光度计。
5. 将3% GBS溶液置于37 °C培养箱中，以240 rpm振荡培养约2小时。2小时后每20分钟检测一次吸光度，直至OD_{600 nm}达到0.6至0.8之间。
6. 达到目标吸光度后，取20 mL 3% GBS与BHI混合溶液转移至50 mL离心管中。
7. 在4 °C条件下以1792 × g离心13分钟，收集沉淀，并用20 mL 0.9%无菌生理盐水洗涤沉淀物两次。
8. 将沉淀的GBS重悬于2 mL 0.9%无菌生理盐水中。将该样品置于冰上保存，直至注射时使用。
9. 对照组小鼠腹腔注射100 µL无菌0.9%生理盐水，GBS组小鼠腹腔注射100 µL悬浮于无菌0.9%生理盐水中的β-溶血性Ia血清型GBS。
   注：注射剂量为10⁸菌落形成单位（CFUs）的GBS或生理盐水（对照组）。接种10⁸ CFU已被广泛确立为模拟人类绒毛膜羊膜炎的动物模型。接种更高剂量的GBS可能导致母鼠死亡；而接种剂量低于该值则无法有效模拟感染与炎症反应。
10. 将菌液进行10^-5至10^-10梯度稀释，取各稀释度样品三份平行接种于BHI琼脂平板。为排除污染，设置两个阴性对照：一个接种于BHI琼脂平板，另一个接种于CHROMID Strepto B琼脂平板。另设两个阳性对照，将制备好的细菌分别接种于BHI琼脂平板和CHROMID Strepto B琼脂平板。所有平板置于37 °C培养箱中过夜培养（图3）。
    注：CHROMID Strepto B琼脂平板为GBS选择性培养基，GBS菌落在该培养基上呈红色。

3. 注射技术

1. 在妊娠第19天（G19），将大鼠轻柔地从笼中取出并放置于平坦的表面上。用毛巾覆盖其头部和上半身以固定大鼠。抬起后肢，以便于接近注射部位。
   注意：确保注射的适当解剖区域位于腹部右下象限，以避免刺破膀胱和盲肠等器官（图1）。
2. 使用带有29 G ½英寸针头的U-100胰岛素注射器。将针头斜面向上朝向头部方向，与水平面呈40–45°角插入，如图1所示。每只母鼠仅进行一次GBS注射。确保每隔1小时进行一次注射，以避免接种母鼠之间产生时间效应。
   注意：若在同一天需进行多次注射，应交替选择左侧和右侧进行注射。

4. 剂量确定

1. 在 G20 时，验证四个对照（步骤 10.2），并计数每个 BHI 琼脂平板上的细菌菌落。
2. 计算每个稀释倍数（10^-5 至 10^-10）下 GBS 菌落的平均值，以确定 GBS 的确切注射剂量。

5. 剖腹产及组织采集

1. 在注射后第22代（G22，72小时）进行剖腹产手术，并根据每只母鼠的接种时间，每隔1小时对母鼠进行后续手术。
2. 在安乐死舱中使用2%异氟烷和1.5% O₂对母鼠进行麻醉_2, 用于全身麻醉。
3. 将母鼠置于覆盖有适当外科敷料的加热垫上，并在眼部涂抹眼用软膏以防止干燥。
4. 使用刀片或手术刀去除下腹部区域的毛发，以准备手术区域。
5. 用浸有消毒剂的无菌纱布清洁手术区域。
6. 使用无菌手术刀和尖头剪刀，在大鼠下腹部做一横向切口。在腹部两侧各做一纵向切口，以暴露下方器官。
7. 将胎盘样本与胎儿分离。记录胎儿、胎盘的重量以及胎儿/胎盘比值。
8. 使用无菌手术刀将胎盘切成两半。
   1. 使用2-甲基丁烷快速冷冻一半的胎盘组织，并于-80 °C保存，直至用于ELISA法检测蛋白水平。
   2. 将胎盘的另一半置于4%缓冲甲醛中固定 原位 通过免疫组织化学（IHC）分析研究收集的胎盘中GBS和多形核细胞（PMNs）的表达。
9. 断头以采集活体胎儿血液，并将血液转移至含锂肝素凝胶分离管中。
10. 离心（18,928 × g） g) 将血液样本于 4 °C 条件下离心以分离血浆，并将血浆样本保存于 -80 °C，直至进一步分析。
    注意：收集的胎儿血液血浆样本将用于ELISA，以检测胎儿血液中不同细胞因子的蛋白水平。
11. 收集胎鼠尾组织，通过扩增SRY基因内的序列来确定胎鼠性别，所用引物如下（上游引物：5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3'；下游引物：5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3'），具体方法如前所述。¹⁸.
12. 使用5 mL 23 G针头通过心脏穿刺从母鼠采集血液 检测并比较母体血液与胎儿血液中不同细胞因子的蛋白水平。采用膈肌穿刺联合断头法处死母鼠。
    注意：在不同动物之间，使用无菌纱布和无菌生理盐水清洁所有使用过的器械。为进行子代的神经病理学和行为学研究，母鼠于妊娠第23天（G23）自然分娩。子代在出生后第80天（PN 80）实施安乐死，取脑组织用于分子生物学和组织学研究。

结果

GBS 的腹腔接种导致胎盘感染
免疫组织化学（IHC）染色（使用靶向 GBS Ia 血清型的多克隆抗体）显示，GBS 感染已到达胎盘的蜕膜区。感染还从蜕膜扩散至迷路层、绒毛膜板，某些情况下甚至波及胎儿，导致胎儿死亡（GBS 暴露组为 5.8 ± 0.8 只活产仔鼠，对照组（CTL）为 9.3 ± 0.6 只）¹⁸。因此，与未暴露胎儿相比，GBS 暴露胎儿出生时的产仔数减少¹⁸。在同窝仔鼠中观察到胎盘感染存在不一致性。所有母鼠及其新生仔鼠的 GBS 感染均为自限性，但部分母鼠出现 GBS 菌血症/败血症¹⁵。出现此类感染播散的母鼠同时表现出更强的促炎性细胞因子反应¹³。在出生后第 1 天（P1）未检测到仔鼠血液培养呈 GBS 阳性¹⁴。妊娠末期感染未影响母体行为。在出生后期间，GBS 暴露的仔鼠未出现死亡。

讨论

实验方案中的关键步骤
该实验方案中有多个步骤至关重要，需要进行一些质量控制。例如，GBS 菌种可能存在被其他病原体污染的风险。可通过适当的 GBS 微生物鉴定技术快速识别这一问题，例如观察 GBS 在 BHI 琼脂上的菌落特征（如大小、形状、颜色），或将 β-溶血性 GBS 接种量平行划线接种于含 5% 绵羊血的哥伦比亚血琼脂和 CHROMID Strepto B 琼脂上，后者是一种用于 GBS 筛查的选择性显色培养基。

另一个问题是，一些母鼠是无症状的GBS携带者。因此，理论上在未接种GBS的对照组母鼠中也可能发生偶然感染。然而，在我们的实验中，对照组动物胎盘的GBS染色从未检测到GBS诱导的绒毛膜羊膜炎。如果这种极不可能的情况发生，也不会显著影响我们所提出的实验设计。基于这一原因，无需使用无病原体动物。

保护感染的母体及其后代免受过度应激至关重要。任何在感染基础上增加的应激都可能对实验动物产生有害影响。因此，必须高度重视适当的饲养管理、温和安抚的动物操作方式、防止背景噪音干扰、...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mL 无菌管	BD 生物科学
50 ml 离心管	赛默飞世尔科技	339652
刀片或手术刀	BD Medical	371716
脑心浸液肉汤	Criterion（Hardy diagnostics）	C5141
CHROMID Strepto B 琼脂平板	生物梅里埃，Saint-Laurent	43461
5% 羊血哥伦比亚血琼脂培养基	赛默飞世尔科技	R01215
上游引物	5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3'	Sigma
胰岛素注射器	Becton, Dickinson and Co（BD）	324702
Lewis大鼠	查尔斯河实验室
甲基丁烷	Sigma Aldrich	M32631
Microtainer 血液采集管	Becton, Dickinson and Co（BD）	365965
反向引物	5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3'	Sigma
1 mL 血清移液管	赛默飞世尔科技	170353N
10 mL 血清移液管	赛默飞世尔科技	170356N
25 mL 血清移液管	赛默飞世尔科技	170357N
5 mL 血清移液管	赛默飞世尔科技	170355N
Superfrost Plus 显微载玻片，优质	VWR	CA48311-703