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基于纸张的趾控开关诊断工具的开发与患者验证：从设计到实施的研究

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DOI：

10.3791/63223

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2022年6月17日

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1Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto, 2Laboratory of Virology and Experimental Therapy (LAVITE), Department of Virology, Aggeu Magalhães Institute (IAM), Oswaldo Cruz Foundation (Fiocruz), 3Department of Biomedical Engineering, Boston University, 4Molecular Biology, Cell Biology & Biochemistry Program, Graduate School of Arts and Sciences, Boston University, 5Department of Mechanical and Industrial Engineering, University of Toronto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

获得可分散部署于社区、用于分布式检测的低成本、高通量诊断工具，对于应对全球健康危机至关重要。本文描述了如何构建基于纸张的病毒RNA序列检测诊断工具，并可通过便携式光学读取设备进行检测。

摘要

获得可部署到社区用于检测的低负担分子诊断技术正变得越来越重要，这对社会福祉和经济稳定具有深远的广泛影响。近年来，为满足快速、低成本分子诊断的需求，已涌现出多种新型等温诊断技术。我们通过开发基于趾头开关（toehold switch）的诊断方法并进行患者验证，为此领域作出了贡献，其中包括针对蚊媒传播的寨卡病毒和基孔肯雅病毒的诊断技术，其性能可与金标准逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测相媲美。这些诊断方法研发和生产成本低廉，有望为资源匮乏的环境提供诊断能力。本文提供的方案详述了开发用于寨卡病毒检测的趾头开关诊断法所需的全部步骤。文章引导读者逐步了解诊断开发过程：首先，以寨卡病毒的基因组序列作为输入，利用开源软件进行候选开关的计算设计；随后展示如何利用合成RNA序列对传感器进行组装、实证筛选以及诊断灵敏度的优化；最后，使用患者样本与RT-qPCR平行开展验证，并结合专用光学读取仪PLUM进行检测。本研究为研究人员提供了一条技术路线图，用于开发低成本的基于趾头开关的传感器，以应用于人类健康、农业及环境监测领域。

引言

由于具有优异的灵敏度和特异性，RT-qPCR 一直是临床诊断的金标准技术。尽管该方法高度稳健，但其依赖昂贵且专用的设备和试剂，且这些试剂需要温控运输和储存，这在全球范围内对高质量诊断技术的可及性构成了重大障碍，尤其是在疾病暴发期间以及实验室资源有限的地区1,2。2015/2016年巴西寨卡病毒暴发期间就出现了这种情况。当时仅有五个集中式实验室可提供 RT-qPCR 检测，导致严重的检测瓶颈，限制了诊断的可及性，对城郊地区人群尤为不利，这些人群受疫情的影响更为严重3,4。为提高诊断可及性，本方案展示了一种已开发的平台，有望在资源匮乏地区实现去中心化、低成本、高通量的诊断。作为该平台的一部分，建立了一条诊断发现流程，将等温扩增技术与基于合成RNA开关的传感器结合，并整合基于纸质的无细胞表达系统5,6。

无细胞蛋白合成（CFPS）系统，特别是基于E. coli的无细胞系统，已成为多种生物传感应用的有吸引力平台，应用范围涵盖环境监测7,8到病原体诊断5,6,9,10,11,12。CFPS系统包含转录和翻译所需的全部组分，相较于全细胞生物传感器具有显著优势。具体而言，其检测过程不受细胞壁限制，且通常具有模块化设计、生物安全性高、成本低廉，并可冻干以实现便携使用。将基于基因回路的反应冻干固定于纸张或纺织品等基底上的能力，使得检测体系可运输、在室温下长期储存5，甚至可集成至可穿戴设备中13。

先前的研究表明，E. coli 无细胞系统可用于检测多种分析物，例如汞等有毒金属、四环素类抗生素7,14、内分泌干扰物15,16、马尿酸等生物标志物17、病原体相关群体感应分子9,18，以及可卡因17和γ-羟基丁酸（GHB）19等非法物质。针对核酸的序列特异性检测，目前的策略主要依赖于基于开关的生物传感器与等温扩增技术相结合的方法。趾控开关（toehold switches）是一类合成型核糖调控元件（在本文后续部分中简称为“开关”），其包含一个发夹结构，可通过封闭核糖体结合位点（RBS）和起始密码子来阻断下游翻译。当其与目标触发RNA结合后，发夹结构被打开，从而启动报告基因开放阅读框的翻译20。

等温扩增也可用于分子诊断21；然而，这些方法容易发生非特异性扩增，从而降低检测的特异性，导致其准确性低于RT-qPCR22。在本研究中，将基于开关的传感器上游结合等温扩增，以实现联合信号放大，从而达到临床相关的核酸检出水平（飞摩尔至阿摩尔）。这两种方法的结合还提供了两个序列特异性的检测关卡，共同作用可实现高特异性。采用该策略，先前的研究已成功检测了包括寨卡病毒6、埃博拉病毒5、诺如病毒10在内的病毒，以及C. difficile23和耐药性伤寒沙门菌12等致病菌。最近，无细胞趾头开关已被用于SARS-CoV-2的检测，以期在COVID-19大流行期间提供可及的诊断手段11,12,13。

以下方案概述了用于寨卡病毒检测的无细胞、基于纸张的合成趾控开关检测方法的开发与验证过程，内容涵盖从in silico生物传感器设计、组装与优化步骤，直至使用患者样本进行实地验证。本方案首先进行基于RNA趾控开关的传感器及针对寨卡病毒RNA的等温扩增引物的in silico设计。尽管存在多种等温扩增方法，本文展示了基于核酸序列的扩增技术（NASBA）的应用，该方法可提高反应中病毒RNA靶标的浓度，从而实现具有临床意义的检测灵敏度。实际上，等温扩增方法具有在恒定温度下运行的优势，无需热循环仪等专用设备，而此类设备通常仅限于集中式实验室使用。

接下来，描述通过重叠延伸 PCR 将合成的趾控开关传感器与报告基因编码序列组装在一起的过程，并利用合成 RNA 在无细胞系统中筛选性能最优的合成趾控开关传感器。针对这组寨卡病毒传感器，我们选择了编码 β-半乳糖苷酶的 lacZ 基因，该酶能够切割比色底物氯酚红-β-D-半乳糖吡喃苷（CPRG），产生由黄色到紫色的颜色变化，可通过肉眼或酶标仪检测。在确定表现最佳的合成开关后，进一步描述利用合成 RNA 筛选针对相应目标序列的基于核酸序列的等温扩增引物的过程，以找出灵敏度最佳的引物组合。

最后，在拉丁美洲对诊断平台的性能进行现场验证（图1）。为了确定临床诊断准确性，使用寨卡病毒患者样本进行基于纸张的无细胞检测；同时并行开展金标准RT-qPCR检测作为对照。为监测比色法无细胞检测结果，我们在缺乏热循环仪的地区实现了现场结果的定量分析。本文还介绍了手工组装的平板读数仪——便携式、低成本、用户友好、多模式读数仪（Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal，简称PLUM；下文称便携式平板读数仪）24。该设备最初作为无细胞合成toehold开关诊断技术的配套装置开发，便携式平板读数仪为高通量孵育和读取结果提供了便捷的解决方案，并为用户提供集成的、基于计算机视觉的软件分析功能。

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图 1：使用基于纸张的无细胞趾头开关反应检测患者样本的工作流程。 请点击此处查看此图的放大版本。

方案

所有涉及人类参与者的操作均须依照伦理标准及相关指南进行，包括世界医学协会《赫尔辛基宣言》所确立的涉及人类受试者的医学研究伦理原则。本研究已获得人类研究伦理委员会批准，许可协议编号为 CAAE: 80247417.4.0000.5190。对于本研究中所包含的所有患者的诊断样本，Fiocruz-PE 机构审查委员会（IRB）已免除知情同意要求。

注意：PLUM 设备在下文中将被称为“便携式酶标仪”。

1. 基于核酸序列的扩增引物的计算机设计

  1. 通过将寨卡病毒基因组序列输入 NCBI/Nucleotide BLAST25,26，扫描寨卡病毒基因组，识别出一组长度约为 200 核苷酸（nt）至 300 nt 的候选扩增区域。将该基因组与参考 RNA 序列（refseq_rna）进行比对，寻找高度保守且与人类基因组无同源性的位点（其他 BLAST 参数保持不变）。至少选择两个位点用于设计合成型趾控开关（toehold switch）。
  2. 采用 Deiman 等人27 提出的筛选标准，为每个候选扩增区域设计成对的基于核酸序列的正向与反向扩增引物。简要而言，引物设计应遵循以下标准：（1）GC 含量介于 40%–60% 之间；（2）长度为 20 至 24 nt，DNA 熔解温度高于 41 °C；（3）不含四个或更多相同核苷酸的连续序列；（4）3' 末端最后一个核苷酸为 A 碱基；（5）引物二级结构和二聚体形成概率较低。建议对每个靶区域筛选 8–10 对引物。
  3. 在正向引物的 5' 端添加包含 T7 启动子序列 AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG 的前缀序列（T7 启动子序列以下划线标出），以便利用 T7 RNA 聚合酶（RNAP）对扩增子进行转录。向 DNA 合成公司订购这些引物作为 DNA 寡核苷酸。

2. 趾控开关的计算设计

  1. 根据网站29上的说明安装 NUPACK28 版本 3.2（核酸设计套件）。使用 UNIX 操作系统和 MATLAB（数值计算平台）作为编程语言（推荐）。
  2. 确定目标序列（例如病毒基因组），用于步骤 1.1 中所述的趾控开关设计。从步骤 1.2 中生成的基于核酸序列的扩增子中选择寨卡病毒的目标序列。
    注意：在实际操作中，用户可根据需要选择先设计和测试基于核酸序列的扩增引物或合成的趾控开关。如果已有特定的目标区域被确立（例如来自已发表文献或诊断方案），可先进行趾控开关的设计与筛选，随后再设计和筛选基于核酸序列的扩增引物。若尚无确立的目标区域，则应首先使用全基因组筛选基于核酸序列的扩增引物，以缩小选择范围，同时筛选引物的扩增效率。若存在多个病原体序列，建议设计针对高度保守区域的基于核酸序列的扩增引物（而非对整个基因组进行筛选）。
  3. 在计算机上下载并安装所需的 MATLAB 软件。
  4. 设置环境变量，以允许在软件中调用核酸设计套件的功能。为此，请打开软件，然后在默认工作文件夹中打开（或创建）一个 startup.m 文件。接着，将以下代码行复制到 startup.m 文件中，最后将包含核酸设计套件可执行文件的文件夹添加到 PATH 中：
    NUPACKINSTALL = '/Users/[user_name]/.../nupack3.2.2';
    setenv('NUPACKINSTALL',NUPACKINSTALL);
    setenv('PATH',[getenv('PATH'),sprintf(':%s/build/bin',NUPACKINSTALL)]);
  5. 打开数值计算平台软件，并导航至设计软件文件夹。运行位于 https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN 的设计算法。
  6. 将目标序列输入至 input 子文件夹中的 design_input_file.csv 文件。输入内容包括名称、外侧序列、内侧序列、温度、输出名称和输出序列，定义见表 1。若尚未确定目标的引物位点，则保持内侧和外侧序列相同。设计过程中仅考虑报告基因的前 29 个核苷酸。完成后，保存并关闭更新后的电子表格。
    注意：输出序列为计划用于该检测的报告蛋白序列（例如 lacZ）。指定内侧和外侧序列可确保算法不会生成与任一引物重叠的合成趾控开关，同时确保该检测识别寨卡病毒基因组中的三个独特位点，从而提高特异性。
  7. 选择用于设计函数的参数：toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, options)。填写参数值如下：
    1. num_designs — 软件为每个目标输出的最佳设计数量。默认值为 6，可根据需要更改（建议每个目标至少设计六个）。
    2. input_file — 该参数指定提供输入序列信息的文件名。默认值为 'design_input_file.csv'，可根据需要更改。
    3. 从以下选项中选择 — （1）SeriesA 和 SeriesB：代码将生成的趾控开关版本。将 SeriesB 设为 1，SeriesA 设为 0，以生成 B 系列趾控开关，这是寨卡病毒诊断中使用的格式6；（2）Parallel：设为 1 以利用多核并行计算设计，否则设为 0；（3）Antisense：设为 1 以生成与目标输入的反义链（即反向互补链）杂交的趾控开关，否则设为 0。
  8. 使用选定参数运行设计函数：toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options)。算法将开始为感兴趣的目标生成趾控开关设计方案。
  9. 设计完成后，在 final_designs 文件夹中以 .csv 格式电子表格的形式查找最佳趾控开关设计序列及其对应的目标序列。算法生成的趾控开关 DNA 序列在 5' 端包含 T7 启动子序列，在 3' 端包含保守的 21 nt 连接序列 AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG。
  10. 通过将所得的最佳趾控开关设计序列提交至 NCBI-BLAST，比对其他常见病毒，进行同源性筛查。接受同源性 ≤40% 的序列。
  11. 订购趾控开关发夹结构的 DNA 寡核苷酸序列，并随后将其与报告基因组装成完全功能的开关。根据所选报告蛋白，订购后续传感器组装所需的 PCR 引物。

参数定义
名称期望输出的趾控开关序列的名称。
外侧序列由扩增反应生成的完整 NASBA 转录本。
内侧序列外侧序列中除去引物结合位点的部分。它与外侧序列一致，但排除了与正向和反向引物结合的转录本区域。
温度算法用于计算 RNA 结构时所使用的温度。
输出名称输出基因的名称（例如 lacZ、gfp）。
输出序列输出基因的序列。

表1：toehold开关设计软件中所用各参数的定义。

3. 通过 PCR 构建趾控开关

注意：这些步骤描述了通过重叠延伸 PCR 构建 LacZ 搭扣开关的方法。此处，DNA 寡核苷酸用作正向引物，T7 终止子用作反向引物。我们使用 pCOLADuet-LacZ 质粒作为 lacZ 基因的模板（addgene: 75006）。任何其他包含相应序列的 DNA 模板也可用作模板，前提是最终构建体中包含 T7 终止子。

  1. 从商业供应商收到合成的DNA寡核苷酸后，用无核酸酶的水将合成DNA和反向扩增引物配制成浓度为10 µM的溶液。按照表2在冰上将反应体系加入PCR管中。
    注意：PCR反应体积可根据需要进行调整。使用极少量（0.1–1 ng）的pCOLADuet-LacZ DNA模板，以避免需要额外的质粒去除步骤或产生背景LacZ信号。若使用较高量的DNA模板，则在PCR后需用DpnI限制性内切酶消化，以去除残留的质粒模板。
  2. 将反应体系放入热循环仪中，按照表3列出的循环条件进行扩增。在琼脂糖凝胶上分析PCR产物（图2；参见补充方案和30）。
  3. 使用基于离心柱的PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，并根据制造商说明书用15–30 µL无核酸酶的水洗脱DNA。使用分光光度计对DNA进行定量。

组分体积浓度
5X Q5 反应缓冲液10 µL1x
10 mM dNTPs1 µL200 µM
10 mM 正向引物（合成开关 DNA 正向）2.5 µL0.5 µM
10 mM 反向引物（T7 终止子反向）2.5 µL0.5 µM
模板 DNA（pCOLADuet-LacZ）可变<1 ng
Q5 高保真 DNA 聚合酶0.5 µL0.02 U/µL
无核酸酶水加至 50 µL-

表2：用于构建趾控开关的PCR组分。

步骤温度时间
初始变性98 °C30 s
35 个循环变性98 °C10 s
退火60 °C20 s
延伸72 °C1.45 min
最终延伸72 °C5 min
保存4 °C-

表3：通过PCR构建趾控开关时使用的循环条件。

4. 合成RNA靶标（触发物）的制备

  1. 使用分子生物学设计软件，修改合成触发RNA模板（在步骤1.1中选定），在其中加入上游T7启动子序列，并确保整个模板长度较短（<200 bp）。设计用于扩增触发序列引物的正向和反向引物（寡核苷酸序列详见补充方案）。
  2. 将序列作为DNA寡核苷酸进行订购。收到后，用无核酸酶水将合成的触发DNA和扩增引物重悬至10 µM。按照表2在冰上使用薄壁管配制相应的PCR反应体系，并以0.5 µL触发DNA超长链（终浓度为0.1 µM）作为模板DNA。
  3. 将反应体系放入热循环仪中，采用表3所列的循环条件，延伸时间为15秒。按照步骤3.3及补充方案中所述方法评估并纯化触发PCR产物。
    ​注意：为加快流程，柱纯化的触发PCR产物也可直接用于初始的toehold开关筛选。

5. 体外 选定触发序列的转录

  1. 将反应组分在冰上混合 表 4.
  2. 孵育 i体外 转录（IVT）反应在37 °C孵育4小时，随后用DNase I处理以去除模板DNA。在DNase I处理步骤中，加入70 µL 无核酸酶水，10 µL of 10x DNase I 缓冲液，以及 2 µL DNase I（无RN酶），37℃孵育 °C，持续15分钟。若不立即进行步骤5.4，则通过加入50 mM EDTA并在65℃加热使DNase I失活。 °10 分钟，C
  3. 可选步骤：对体外转录（IVT）产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（如尿素-PAGE）分析，以评估RNA质量，具体方法如所述 补充方案.
  4. 使用柱式RNA纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化引发物IVT产物，然后通过分光光度法测定RNA浓度和纯度。参见 补充方案 有关如何确定摩尔浓度和拷贝数/µL 的 RNA。
组分体积浓度
10X 反应缓冲液1.5 µL0.75x
25 mM NTP 混合液6 µL7.5 mM
模板触发 DNAX µL1 µg
T7 RNA 聚合酶混合液1.5 µL-
无核酸酶水X µL补至 20 µL

表4： 体外 选定触发序列的体外转录（IVT）。

6. 开关的初步筛选

注意：本节介绍建立无细胞、基于纸张的趾头开关反应的步骤，以及如何筛选高性能的趾头开关。步骤 6.10 中使用的经 BSA 封闭的滤纸应按照补充方案中的说明提前制备。

  1. 将25 mg粉末溶于1 mL无核酸酶水中，配制CPRG储存液。溶液需始终置于冰上，并于-20℃保存。 °C 用于长期使用。
  2. 确定需要设置的反应数量。针对每个待评估的趾控开关（toehold switch），需设置一个无模板对照（不含开关和靶标RNA，即仅含无细胞体系的对照），以排除反应主混合液可能产生的任何背景信号。同时需设置仅含开关的对照，用于评估在无靶标RNA存在时开关的背景泄漏水平或关闭状态下的反应速率（OFF rate）。
  3. 根据所列的标准操作流程，在冰上配制包含溶液A、溶液B、RNase抑制剂和CPRG的无细胞反应主混合液 表5.
    注意：此处所述步骤适用于配制足以进行三组1.8 µL反应需额外加入10%体积以补偿移液误差。主混合液的体积应根据所筛选的toehold开关数量按需调整。
  4. 每个无细胞反应设三个重复，将预混液分装至PCR管中，所有PCR管均需保持在冰上。对于预留作为空白无细胞对照的管子，加入无核酸酶水至终体积为5.84 μL。 µL，用移液器吹打混匀，短暂离心。对于其余的试管，加入经PCR纯化的toehold switch DNA，使其终浓度为33 nM。
  5. 对于留作仅含开关的对照管，加入无核酸酶水至终体积为 5.84 µL. 对于预留用于测试趾控开关与靶标 RNA 组合的离心管，加入 体外 转录的目标RNA至最终浓度为1 µM。然后，加入无核酸酶水至终体积为 5.84 µL. 用移液器反复吹打使所有反应液充分混匀，并短暂离心。
  6. 加入30 µ在384孔黑色透明底板上，向反应孔周围的孔中各加入 L 无核酸酶水。这可减少实验过程中的蒸发，提高重复性。
    注意：如果使用便携式酶标仪设备，请将PCR封膜覆盖在微孔板上，并使用精密刀具切割出用于反应的各孔以及四个角孔。PCR封膜可防止便携式酶标仪的摄像头因空孔而过曝。
  7. 使用 2 mm 的活检打孔器和镊子，切割经 BSA 封闭的滤纸圆片，并通过弹出打孔器或使用镊子将其放入反应孔中（参见 补充方案 用于制备BSA封闭滤纸）。分装1.8 μL三份 µ将每个反应管中的 L 体积液体转移至 384 孔板中的滤纸片上，操作过程中始终保持所有样本及 384 孔板置于冰上。
    注意：如果使用便携式酶标仪设备，请添加1.8 µ向384孔板的四个角各加入CPRG（0.6 mg/mL）L。CPRG产生的黄色为便携式酶标仪提供模式识别，以便在图像分析中对齐数字多孔板模板。用PCR封板膜覆盖板孔，防止蒸发。
  8. 将培养板放入酶标仪中，读取OD值570 在 37 °每分钟一次，持续130分钟。

组分体积每反应终浓度
溶液 A2.38 µL40%
溶液 B1.78 µL30%
RNase 抑制剂0.03 µL0.5% v/v
CPRG (25 mg/mL)0.14 µL0.6 mg/mL
趾控开关（Toehold Switch）X µL33 nM
目标 RNAX µL1 µM
无核酸酶水加至 5.94 µL-
总体积：5.94 µL

表5：PURExpress无细胞转录-翻译反应组分。

7. 鉴定高性能的趾控开关

注意：本节介绍如何分析第6步的数据，以筛选出表现最佳的趾控开关用于后续实验。

  1. 首先通过背景OD570 吸光度归一化数据以开始分析。具体操作为：从其他反应的OD570测量值中减去不含任何开关或靶标RNA的反应（即仅含无细胞体系的孔）的OD570测量值。
  2. 使用三点移动平均法对归一化后的数据进行平滑处理，并将每个孔的最小值调整为零。归一化后的时间进程数据示例见图3，其中展示了toehold开关27B、33B和47B的检测结果。
  3. 基于处理后的数据，通过计算toehold开关与靶标存在时和仅含开关时的颜色变化速率（即OD570随时间的变化率）之差，确定其倍数变化（或ON/OFF比值）（计算该比值的方法详见补充方案；参见图4）。
  4. 选择ON/OFF倍数变化最高的开关进行进一步表征，剔除表现较差、倍数变化最低的toehold开关。

8. 基于核酸序列扩增的引物筛选与灵敏度

注意：在以下步骤中，首先对功能性等温扩增引物进行筛选，然后通过测定每份样本中的目标 RNA 拷贝数来评估其灵敏度 µL 的合成RNA，特定的趾控开关在与等温扩增联用时可可靠检测到该浓度。等温扩增完成后，进行无细胞反应以鉴定基于核酸序列扩增的有效引物组合。然而，对基于核酸 序列扩增的反应先进行聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳，以初步缩小候选引物组合的范围，可能更具成本效益。在此情况下，可在凝胶上产生符合预期扩增子大小条带的基于核酸序列扩增的引物组合，可优先列入后续无细胞筛选的候选名单。

  1. 制备25 µ所有正向和反向引物组的 M 储存液溶于无核酸酶水中（参见 补充方案). 确定需要设置的基于核酸序列扩增反应及后续无细胞反应的数目。该数目取决于足垫开关（toehold switches）的数量及其相应的引物组数目。
    注意：在筛选引物时，必须为每对引物设置无模板对照，以排除因引物非特异性扩增所导致的任何背景干扰。
  2. 设置一个5 µL 反应，具体如下（根据需要调整比例）。将所有试剂在冰上解冻。按照反应缓冲液、核苷酸混合物和RNase抑制剂的比例配制反应主混合液。 表6用移液器反复吹打混匀，直至白色沉淀完全溶解，然后分装到PCR管中。
    1. 如果主混合液用于筛选基于核酸序列扩增的引物，则 initially 不加入引物（分装 2.55 µL 的预混液）。否则，若进行引物敏感性分析，可将引物加入预混液中（此时分装 2.75 µL aliquots）。在变性与平衡阶段后加入酶混合物。
  3. 若筛选基于核酸序列扩增的引物，将正向引物和反向引物分别加入相应的试管中。在热循环仪上，按照所述条件设置孵育程序 表7.
  4. 加入1 µ无核酸酶水或1 µ目标触发RNA的L值为2 pM或约106 拷贝数/µL，相应标记试管。轻轻吹打混匀，并短暂离心。
    注意：在引物组筛选时，使用的目标触发RNA浓度应足够高，以避免影响等温扩增方法的最低检测限，但又不能过高，以免在未发生扩增的情况下激活趾控开关。
  5. 将试管转移至热循环仪中并开始孵育。12分钟后，取出试管并加入1.25 µ向每支试管中加入酶混合液 L。用移液器吹打混匀，并短暂离心试管。
    注意：此时，试管可置于室温保存；但酶混合液在加入试管前应始终置于冰上。
  6. 将试管放回热循环仪，跳过41 °C 持续步骤以启动 1 小时反应孵育。
    注意：孵育结束后，反应体系可置于冰上以供当天处理，或在 -20 ℃ 冻存。 °C 用于后续处理。
  7. 按照步骤 6.2–6.7 进行操作，并 表8 组装基于纸质的无细胞趾扣开关反应以评估引物性能。按照步骤7.1–7.2所述分析数据，并 图3.
    注意：除了前述对照外，还应包含阴性对照，以排除反应中可能产生的任何背景信号。此外，还应设置一个包含开关和2 pM（终浓度）目标RNA的对照，作为无NASBA扩增对照。
  8. 确定用于后续敏感性分析的候选引物对。根据在加入孵育反应后是否发生趾控开关激活来筛选引物对。如有必要，可使用更多引物组合重复引物筛选。
  9. 始终将RNA样本置于冰上，用无核酸酶的水中配制以下目标RNA的系列稀释液：104, 103, 102, 101，和100 RNA拷贝/µL. 使用选定的引物组重复基于核酸序列的扩增和无细胞反应（步骤8.2-8.7），测试系列稀释样本，以确定能够提供最佳灵敏度的引物组。参见 图5 以确定引物组灵敏度的结果为例。
    注意：理想情况下，所选的toehold开关和引物对应能检测每1-100个目标RNA拷贝 µL 的 RNA（储备液浓度）。
  10. 以生物学重复三次的方式重复核酸序列扩增敏感性实验。此步骤旨在进行患者样本实验前验证结果的可重复性。
  11. 可选： 为长期使用和运输提供可靠的开关DNA来源，可使用任何常规克隆方法将选定的开关序列克隆至质粒中。类似地，目标触发RNA序列也可克隆至所选质粒中以进行保存。
组分每反应体积终浓度
NASBA 反应缓冲液1.67 µL1x
NASBA 核苷酸混合物0.833 µL1x
25 µM 正向引物0.1 µL0.5 µM
25 µM 反向引物0.1 µL0.5 µM
RNase 抑制剂 (40 U/µL)0.05 µL0.4 U/µL
靶标 RNA1 µL
NASBA 酶混合物1.25 µL1x
总体积5 µL

表6：NASBA 反应组分。

步骤温度时间
变性65 °C2 min
平衡41 °C10 min
保持41 °C∞
孵育41 °C1 h
保持4 °C-

表7：NASBA反应条件。

组分体积每反应最终浓度
溶液 A2.38 µL40%
溶液 B1.78 µL30%
核糖核酸酶抑制剂0.03 µL0.5% v/v
CPRG (25 mg/mL)0.14 µL0.6 mg/mL
趾控开关（Toehold Switch）X µL33 nM
靶标 RNA（如适用）X µL1 µM
NASBA（如适用）0.85 µL1:7
无核酸酶水加至 5.94 µL-
总体积：5.94 µL

表8：基于纸张的无细胞反应组分。

9. 患者样本采集与病毒RNA提取

注意：本节描述了采集患者样本并使用RNA纯化试剂盒提取RNA的方案。以下方案用于从外周血中获取血清。本研究中使用的样本采集自巴西伯南布哥州出现发热、皮疹、关节痛或其他与虫媒病毒感染相关症状的患者。

  1. 采集疑似虫媒病毒感染患者的外周血样本。采用标准无菌技术进行静脉穿刺（全血采血管）。使用匿名编码和样本采集日期标记样本管。
  2. 离心血液以分离血清，2,300 x g 10 分钟。使用移液器将血清分装成 200 微升的等分试样 µL），用于在 1.5 mL 离心管中进行 RNA 提取。
    注意：如果无法在样本采集后立即进行RNA提取，则血清样本应保存在-80 °下游应用前的 C。
  3. 移液器 560 µ将 140 μL 含有载体 RNA 的已配制 Buffer AVL（病毒裂解缓冲液）加入 1.5 mL 离心管中。 µ将L血清加入管中的AVL缓冲液/载体RNA混合物中，脉冲涡旋振荡15秒以混匀。
  4. 室温孵育10分钟，然后短暂离心样品，使管底聚集液体。加入560 µ加入100 μL乙醇（96%-100%）至样品中，脉冲式涡旋振荡15秒以混匀。混匀后，离心样品以使内容物聚集于离心管底部。
  5. 仔细加入630 µ将步骤 9.4 中的 L 溶液加入离心柱中，注意不要润湿边缘。随后，盖紧盖子，在 6,000 x g 离心1分钟。将离心柱放入干净的2 mL收集管中，弃去含有滤液的已使用收集管。
  6. 小心打开离心柱，重复步骤 9.5。小心打开离心柱，加入 500 µL 缓冲液 AW1（洗涤缓冲液 1）。盖紧管盖，于 6,000 x g 离心1分钟。将离心柱放入一个干净的2 mL收集管中，弃去含有滤液的已使用收集管。
  7. 小心打开离心柱，加入 500 µL 缓冲液 AW2（洗涤缓冲液 2）。盖紧管盖，于 20,000 x g 3 分钟。将离心柱放入干净的 2 mL 收集管中，并弃去含有滤液的已使用收集管。
  8. 为避免残留的 AW2 缓冲液污染下游酶促反应，将离心柱放入干净的 2 mL 收集管中，并丢弃含有滤液的已用收集管。在 20,000 x g 1 分钟。
  9. 将离心柱放入一个洁净的1.5 mL离心管中，并丢弃含有滤液的已使用收集管。小心打开离心柱，加入60 µ室温平衡的 L 型缓冲液 AVE（洗脱缓冲液）。此步骤后，盖上管盖，在室温下孵育 1 分钟。
  10. 6,000 x 离心 g 孵育1分钟。洗脱的RNA可同时用于NASBA和RT-qPCR反应。
  11. 按照步骤 8.3 至 8.11，使用 1 进行基于核酸序列的扩增及基于纸张的无细胞反应 µL 的提取患者RNA，确保包含阴性和阳性对照反应。反应完成后，准备384孔反应板，并在便携式板式读数仪中以37 °C运行检测 °C（详见原文中的细节） 补充方案).
    注意：两种 RNA 浓度分别为 104 和 102 PFU/mL，从培养的寨卡病毒中提取，用作临床验证期间所有实验的阳性对照。除前述对照外，还需包含触发序列（10 ng/µL）作为阳性对照。
  12. 每次实验结束后，可将便携式酶标仪的原始数据（.csv 文件）上传至在线安全数据库。此外，便携式酶标仪会生成一份报告，标明样本对寨卡病毒的检测结果为阳性或阴性图6）；孵化过程中获得的所有图表示例详见代表结果部分（图7).
    注意：用户还可以将文件从便携式酶标仪传输到自己的计算机 通过 USB

10. 便携式酶标仪设备

  1. 便携式酶标仪设备（图8）可作为传统酶标仪的替代方案24。有关该方案及代表性结果，请参见补充方案。

11. 用于寨卡病毒检测的RT-qPCR

注意：本节概述了从患者样本中进行寨卡病毒检测的反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）操作步骤（参见补充方案）。

  1. 为避免污染，应在与扩增过程隔离的区域（例如生物安全柜）中配制 RT-qPCR 组分。将 RT-qPCR 缓冲液、酶以及引物/探针置于冰上或冷块上。随后，根据表9在冰上的 384 孔板中加入反应体系。
    注意：建议所有实验均设置阴性对照（提取对照和无模板对照 [NTC]）和阳性对照（104 PFU/mL）。
  2. 将试剂加入 1.5 mL 微量离心管后，通过上下吹打混匀反应液（切勿涡旋），并将 6.5 µL 反应液分装至各孔中。每孔加入 3.5 µL RNA 模板，每个样本设三个复孔。
  3. 用 PCR 封板膜覆盖板孔，将 384 孔板在 600 × g 条件下离心 2 分钟。
  4. 将板放入 RT-qPCR 仪器中，并按照表10所述的循环条件进行扩增。使用 RT-qPCR 仪器配套的设计与分析软件分析结果，并采用自动设定的阈值和基线（详见补充方案）。
组分体积浓度
2X QuantiNova Probe RT-PCR Master Mix5 µL1 X
100 µM 正向引物0.08 µL0.8 µM
100 µM 反向引物0.08 µL0.8 µM
25 µM 探针0.04 µL0.1 µM
QuantiNova ROX Reference Dye0.05 µL1 X
QuantiNova Probe RT Mix0.1 µL1 X
模板 RNA3.5 µL-
无核酸酶水加至 10 µL-

表9：RT-qPCR组分 基于美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention）扩增寨卡病毒RNA-美国疾病控制与预防中心（CDC）检测患者样本中寨卡病毒的方案31.

步骤温度时间
逆转录45 °C15 min
PCR 初始活化步骤95 °C5 min
45 个循环变性95 °C5 s
退火/延伸合并步骤60 °C45 s

表10：RT-qPCR的循环条件。

结果

按照计算设计流程，通过 PCR 构建了三个趾控开关。使用琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物（图 2）。在约 3,000 bp 处出现清晰条带，大致对应于与趾控开关偶联的 lacZ 基因的大小，通常表明反应成功。相反，若泳道中无条带、出现多条带或条带大小不符，则表明 PCR 失败。若 PCR 失败，应优化反应条件和/或引物序列。

组装的趾控开关经过筛选，以评估每种传感器对其相应目标的响应性能 体外 转录的触发RNA (图3）。尽管这三种传感器均显示出OD值升高570 吸光度，开关 27B图3A) 的结合速率最快。开关 33B 以及程度较轻的 47B 显示出 OD 值升高570 在无目标触发RNA存在时的吸光度，表明这些开关具有一些背景活性或渗漏性（图3B,C)-这一特性在候选传感器中并不理想，因为它会降低特异性。为了更清晰地识别出具有最高开/关信号比的传感器，需计算OD的倍数变化570 吸光度已计算（见补充信息第5部分）并绘图（图4）。由此分析可知，开关27B是具有最佳ON/OFF性能的传感器 约60的比例。

通过测定激活该表现最优的toehold开关（27B）所需的最低RNA浓度，评估其灵敏度 当与 NASBA 反应联用时，该图显示，性能最佳的寨卡病毒传感器可检测低至每 1.24 个分子的 RNA 浓度 µL （相当于约 2 aM； 图5).

在鉴定并验证开关27B后，将传感器材料分发至巴西伯南布哥州累西腓市的团队成员。在巴西，使用寨卡病毒患者样本对寨卡病毒诊断平台的临床诊断准确性进行了评估，并平行采用RT-qPCR进行比较。为验证基于纸张的寨卡病毒诊断平台，使用了便携式酶标仪，该仪器能够孵育并读取基于纸张的传感器的比色信号输出。颜色由黄色变为紫色用于识别阳性样本，而阴性样本则保持黄色（图6）。便携式酶标仪生成结果的另一种可视化方法（图8）是绘制每个基于纸张的反应随时间变化的比色响应曲线。每个样本均设三个重复进行检测，信号超过阈值（红色阈值线设定为1）的样本被判定为阳性，低于阈值的样本则被判定为阴性（图6 和 图7）。

最后，为了评估和比较寨卡病毒趾头开关传感器与当前诊断寨卡病毒感染的金标准方法的临床性能，所有患者样本均平行地采用RT-qPCR进行检测。图9展示了两个代表性患者样本通过RT-qPCR检测寨卡病毒时的三重复扩增曲线。当循环阈值（Ct）≤38时，样本被判定为阳性；图中红线表示寨卡病毒阳性样本，蓝线表示阴性样本。

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图2琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物质量。 PCR产物在1%琼脂糖凝胶（1X TAE缓冲液）中以80 V电泳90分钟进行分析。单一条带通常表明反应成功。第1道：1 kb DNA ladders；第2–4道：分别为27B switch DNA、33B trigger DNA和47B trigger DNA。左侧数字表示条带大小，单位为bp。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图3：用于纸质寨卡病毒传感器的三种趾控开关原型。 在37 °C条件下，对三种基于纸质的RNA趾控开关传感器的性能进行了超过130分钟的测量。每个图表包含两条曲线，一条代表仅含开关的对照组，另一条代表含有开关和触发物的实验组。三个图表分别展示了使用趾控开关传感器27B（A）、33B（B）和47B（C）获得的数据。误差线表示三次重复实验的平均值标准误（SEM）。请点击此处查看此图的放大版本。

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图4：通过计算在570 nm处吸光度的倍数变化来确定性能最优的传感器。 倍数变化（或最大ON/OFF比值）是通过测量130分钟时仅含开关的对照组与含有开关加触发物的CFPS反应体系之间的吸光度（OD570）比值来计算的。误差条表示三次重复实验的标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：高性能开关的灵敏度评估。 体外 转录的Zika病毒RNA被梯度稀释后加入NASBA反应。经过1小时孵育后，按1:7的比例将反应液加入含无细胞PURExpress系统的纸盘中。在130分钟后的倍数变化为 37 °C 绘制完成。该图已复制 从24. 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图6：便携式酶标仪捕获页面加载了捕获的图像数据。 本图展示了一次数据采集过程中便携式酶标仪所捕获的最终图像示例。图像顶部可见原始的日期/时间戳。黄色表示对照或阴性反应，紫色表示阳性反应。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图7：数据分析模式。 在左侧，用户选择要绘制的数据集；图表将在右侧显示，每个样本或对照组以不同颜色区分。红色虚线作为判断阳性与阴性样本的阈值。超过该阈值的三个重复检测样本被视为阳性，而低于该阈值的样本则判定为阴性。误差条表示三次重复实验的标准差（SD）。Ctrl 1 至 Ctrl 5 表示对照组。请点击此处查看该图的放大版本。

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图8. PLUM，一种便携式酶标仪。 该 便携式酶标仪可作为“盒中实验室”，用作温度可控的酶标仪，用于孵育和监测比色反应。该便携式设备可对基于纸张的寨卡病毒传感器在现场进行定量和高通量检测。请点击此处查看该图的放大版本。

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图9：对两个患者样本进行三重检测以鉴定寨卡病毒的RT-qPCR扩增曲线图。 当循环阈值（Ct）≤38时，样本被视为阳性。红色虚线用作判断样本阳性和阴性的阈值。红色曲线表示阳性样本，蓝色曲线表示阴性样本。ΔRn（delta Rn）值表示RT-qPCR仪器检测到的所有样本荧光信号的归一化强度。请点击此处查看该图的放大版本。

补充实验方案文件。 请点击此处下载该文件。

补充图。 请点击此处下载这些 图。

讨论

本文所述的集成化纸质检测系统可将具有临床相关性的分子诊断技术带到现场即时检测场景，其性能在功能上可与RT-qPCR相媲美6。尤为重要的是，在偏远地区，现场诊断技术的可用性可将检测结果的等待时间从数天缩短至数小时。该方法具有良好的可编程性，所描述的检测流程几乎可用于检测任何病原体目标。我们将分子检测工具与专门设计的便携式酶标仪相结合，该设备结构紧凑，支持电池供电（8–9小时），并具备板载数据分析功能，适用于分布式应用场景。在其他研究中，我们已使用268份患者样本对该集成硬件与寨卡病毒诊断平台进行验证，同时与RT-qPCR平行比对，结果显示诊断准确率达到98.5%24。综上所述，我们的目标是推动该平台的技术转移，使研究人员能够重新利用并持续改进该系统，以满足尚未被满足的诊断需求。

这 计算机模拟 toehold开关设计流程已被整合并自动化为一个可分为三个阶段的流程。第一阶段生成一组toehold开关设计池，这些设计以单核苷酸递增的方式与目标序列杂交。第二阶段分析二级结构及toehold开关的可及性，并剔除含有同框提前终止密码子的传感器。随后采用综合考虑多个因素（如toehold开关缺陷水平、toehold开关可及性及目标位点可接近性）的评分函数，根据总体得分筛选出最优的toehold开关设计方案。在最后阶段，生成最优toehold开关设计及其对应目标触发序列的序列列表。最优传感器序列应使用NCBI/Primer-BLAST针对人类转录组及密切相关的病毒基因组进行特异性筛查。25还应最好对寨卡病毒基因组中的传感器靶标位点进行序列保守性筛查，以确保传感器能够实现广泛且稳健的检测。目前已开发出多个版本的趾控开关（toehold switch）设计软件，其设计算法允许用户生成两种版本，即A系列6 或B系列脚趾开关6本文重点介绍B系列趾控开关的设计。

在商业合成DNA之后，可快速组装足垫开关，并通过针对目标基因组短区域（200-300 nt）的合成靶标触发序列进行初步筛选来测试其性能。在筛选基于足垫开关的传感器性能时，理想的方法是以RNA形式加入靶标序列。本文所述步骤用于添加 体外 已概述转录的触发RNA的使用方法。然而，如果有条件，也可使用全长基因组模板，例如定量的病毒RNA提取物、商业化的合成RNA基因组或标准品。在初始的趾头开关筛选中使用全长RNA基因组具有优势，因为它可揭示RNA二级结构等额外因素是否会影响传感器的性能。为了优化候选开关的开启/关闭比率，可将趾头开关DNA逐步滴定加入无细胞反应体系中。该步骤还可用于鉴定性能优异的趾头开关（如具有高倍数扩增或高开启/关闭比率），并排除泄漏性强的趾头开关（即在无目标RNA存在时信号仍较高），从而避免其进入后续的表征步骤。

为了提高性能最优的趾头开关候选物的检测限，采用核酸序列依赖性扩增（NASBA）技术将临床相关浓度的靶标寨卡病毒RNA扩增至趾头开关可检测的水平6。通过筛选不同组合的正向与反向引物，确定最佳的NASBA引物与趾头开关组合，以实现在临床相关浓度下的检测。一旦确定了理想的引物组和趾头开关组合，该检测方法将进入临床验证阶段。需要注意的是，趾头开关与NASBA的筛选阶段可能耗费较多人力和资源，因此测试开发最适合在资源充足的科研场所进行。尽管我们尚未应用流程自动化，但自动化技术有望加速“设计—构建—测试”的迭代循环32。幸运的是，从传感器设计、测试到部署的周转时间可以非常短（少于一周），这使得该策略特别适用于疫情暴发等时间紧迫的情况6。

即使已经开发出具有临床相关灵敏度的生物传感器，仍存在需要解决的技术挑战。由于本实验方案涉及手动操作且为多步骤流程，因此存在样本间交叉污染的风险。我们通过严谨的实验室操作尽可能降低此类风险。在一项包含268例患者样本的近期临床试验中，未发现任何污染问题；然而，这仍是实验过程中需要重点考虑的因素。24因此，该方案仍属于实验室检测，需要由熟练掌握分子生物学技术的专业人员操作。部署时还需考虑其他因素 从患者样本中分离RNA。本文描述了使用基于柱法的核酸提取试剂盒进行RNA提取的方法。然而，在其他研究中，我们已证明了一种有效且简单的煮沸裂解法（95 °C，2分钟），适用于低载量患者样本的处理6该策略几乎消除了成本 与RNA提取相关，且避免使用基于离心柱的核酸提取试剂盒，这类试剂盒在资源有限的环境中可能带来物流挑战，或在危机期间（如COVID-19大流行）出现供应链问题33.

正如我们在新冠疫情期间所见，用于进行RT-qPCR的仪器本身可能成为瓶颈，限制患者获得检测的机会。这一因素在很大程度上也涉及经费问题，导致检测模式趋于集中化 可能会限制诊断的可及性。例如，在2015/2016年寨卡病毒暴发期间，巴西仅有五个国家级参考实验室，导致患者检测延误。如果不考虑规模经济可能带来的成本优势，便携式酶标仪当前的物料成本约为500美元，即使将人工和商业利润计入而使成本增加五倍，该仪器仍具有良好的可负担性。相比之下，实时荧光定量PCR仪的价格范围为15,000至90,000美元34此外，拉丁美洲无细胞检测方法的单次测试成本估计约为5.48美元，而在寨卡病毒暴发期间，巴西RT-qPCR检测的单次测试成本约为10至11美元。36. 除了设备成本之外，便携式酶标仪体积小巧（20 cm3），自动分析，数据上传至云端 通过 互联网连接，并可由电池供电运行。这些特点极大地拓展了检测设备的潜在应用场所，同时扩大了可服务的患者群体。

迄今为止，最常见的商业化大肠杆菌（E. coli）无细胞蛋白表达系统（CFPS）平台是 S30 和 PURE 系统37；然而，在中低收入国家扩大诊断技术可及性的一个关键制约因素是这些试剂在国内的供应极为有限。解决这一挑战的重要一步是实现本地化 CFPS 生产。Federici 实验室近期在开发非商业化平台方面取得了显著进展，该平台可在基于裂解液的无细胞系统中实现足垫开关（toehold switch）传感器的应用，并对寨卡病毒 RNA 达到 2.7 fM 的检测限（LOD）14。这一成果不仅使得试剂可在使用国本地生产，避免进口关税和运输延误，而且人工成本也按当地标准计算，从而显著降低总体成本。根据 Federici 团队所述的研究工作，在智利生产一次 CFPS 表达反应（5 µL）的成本为 6.9 美分（USD）35,38，为推广基于裂解液的系统提供了双重优势（优化物流与降低成本）35,38。

将可与RT-qPCR相媲美的检测技术应用于分布式诊断网络，相较于目前依赖将样本运送至集中式RT-qPCR检测中心的常规做法，具有显著优势。在寨卡病毒病例较为集中的城乡结合地区，患者与诊断机构之间的物理距离会延缓诊断进程，并增加检测结果无法在临床关键时间内送达患者的风险。我们希望，本文所展示的工作能够通过知识的传递，助力科研界开发出用于人类健康、农业和环境监测的去中心化生物技术及便携式硬件设备。

披露

K.P. 和 A.A.G. 是基于纸张的toehold传感器相关技术的共同发明人。Y.G.、S.C. 和 K.P. 是 LSK Technologies, Inc. 的联合创始人，也是 PLUM 相关技术的共同发明人。M.K.、K.P. 和 A.A.G. 是 En Carta Diagnostics Ltd. 的联合创始人。其他作者无利益冲突。专利信息如下：PLUM 设备：Y.G.、S.C. 和 K.P. 的专利申请由多伦多大学提交，并转让给 LSK Technologies Inc.，美国临时专利申请号 62/982,323，提交于 2020 年 2 月 27 日；Toehold 开关专利：A.A.G.、P.Y. 和 J.J.C.，“核糖调控元件组合物及其使用方法”，专利号 WO2014074648A3，提交于 2012 年 11 月 6 日；基于纸张的诊断专利：K.P. 和 J.J.C.，“基于纸张的合成基因网络”，美国专利申请号 US15/963,831，提交于 2013 年 12 月 6 日；寨卡病毒专利 1：K.P.、A.A.G.、M.K.T.、D.B.、G.L.、T.F. 和 J.J.C.，“便携式低成本病毒检测与毒株鉴定平台”，美国临时专利申请号 62/403,778，提交于 2016 年 10 月 4 日；寨卡病毒专利 2：K.P.、A.A.G.、M.K.T.、D.B.、G.L.、T.F. 和 J.J.C.，“便携式低成本病毒检测与毒株鉴定平台”，美国临时专利申请号 62/341,221，提交于 2016 年 5 月 25 日。

致谢

作者感谢 Green、Pardee 和 Pena 实验室的所有成员，以及此前与本论文所述工作相关的所有论文的共同作者。S.J.R.d.S. 获得了巴西伯南布哥科学技术基金会（FACEPE）提供的博士奖学金资助，项目编号为 IBPG-1321-2.12/18，目前由加拿大多伦多大学资助的博士后奖学金支持。P.B. 获得了多伦多大学药学院颁发的 William Knapp Buckley 奖项支持。M.K. 获得了多伦多大学精准医学计划（PRiME）内部奖学金项目 PRMF2019-002 的支持。本研究工作获得了加拿大研究主席计划（文件编号 950-231075 和 950-233107）、多伦多大学重大科研项目管理基金、加拿大卫生研究院（CIHR）基础资助计划（201610FDN-375469）对 K.P. 的资助，以及加拿大卫生研究院/国际发展研究中心（CIHR/IDRC）团队资助项目“加拿大—拉丁美洲—加勒比寨卡病毒计划”（FRN: 149783）对 L.P.、A.A.G. 和 K.P. 的资助。此外，K.P. 还通过加拿大2019新型冠状病毒（COVID-19）快速研究资助计划，获得了加拿大国际发展研究中心（IDRC）的资金支持（资助编号 109434-001）。A.A.G. 的研究也获得了亚利桑那州生物医学研究委员会新研究者奖（ADHS16-162400）、盖茨基金会（OPP1160667）、美国国立卫生研究院（NIH）院长新创新者奖（1DP2GM126892）、NIH R21 项目（1R21AI136571-01A1，授予 K.P./A.A.G.）以及阿尔弗雷德·P·斯隆基金会（Alfred P. Sloan Fellowship，FG-2017-9108）的资助。图1 使用 Biorender.com 在 K.P. 的学术许可下制作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
384 孔板盖 - 铝制Sarstedt95.1995用于在将 384 孔板插入 PLUM 读板仪之前覆盖孔板
384 孔板盖 - 透明Sarstedt95.1994用于在将 384 孔板插入 BioTek 读板仪之前覆盖孔板
384 孔板VWRCA11006-1802 mm 纸基诊断器件被放置于这些孔板的孔中用于定量分析
琼脂糖BioShop CanadaAGA001.500用于凝胶电泳
BSABioShop CanadaALB001.500用于 Whatman 滤纸的封闭剂
无细胞反应体系New England BiolabsE6800LPURExpress
CPRGRoche10884308001氯酚红-β-D-半乳糖吡喃苷
一次性无菌活检打孔器Integra Miltex23233-31用于制备可放入 384 孔板的 2 mm 纸片
DNA酶 IThermo ScientificK2981体外转录反应孵育后消化模板 DNA
DNA酶 I 试剂盒Thermo Scientific74104用于从体外转录 RNA 中去除模板 DNA 的 DNase I 试剂盒
dNTPsNew England BiolabsN0446S用于 PCR
电泳系统Bio-Rad1704487用于运行琼脂糖凝胶
凝胶成像系统Bio-Rad1708265ChemiDoc XRS+ 成像系统
体外转录试剂盒New England BiolabsE2040S用于体外转录开关筛选所需的模板（触发）RNA
Nanodrop OneThermo ScientificND-ONE-W用于测定核酸浓度
NASBA 试剂盒Life Sciences Advanced TechnologiesNWK-1等温扩增反应组分
无核酸酶水 H2Oinvitrogen10977015添加至反应混合物中
PAGE 电泳系统Biorad1658001FC用于制备和运行聚丙烯酰胺凝胶
pCOLADuet-LacZ DNAAddgene75006https://www.addgene.org/75006/
Phusion 聚合酶/反应缓冲液New England BiolabsM0530L用于 PCR
读板仪BioTekBioTek NEO2多功能读板仪，Synergy Neo2
引物Integrated DNA Technologies定制寡核苷酸合成
Q5 聚合酶/反应缓冲液New England BiolabsM0491L用于 PCR
Qiagen PCR 纯化试剂盒QIAGEN27106QIAprep Spin Miniprep Kit
RNA 上样染料New England BiolabsB0363S2X RNA 上样染料
RNA 纯化试剂盒QIAGENEN0521QIAamp 病毒 RNA 提取试剂盒
RNase 抑制剂New England BiolabsM0314S用于防止 RNase A、B 和 C 的污染
RT-qPCR 试剂盒QIAGEN208352QuantiNova 探针 RT-PCR 试剂盒
SYBR GoldInvitrogen S11494S11494用于聚丙烯酰胺凝胶中核酸染色
TAE 缓冲液BioShop CanadaTAE222.4凝胶电泳缓冲液
热循环仪Applied Biosystems4484073用于温度循环和反应孵育
Whatman 42 滤纸GE Healthcare1442-042用于嵌入纸基诊断器件中的分子组分

参考文献

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