纸基脚趾开关诊断开发和患者验证的设计到实施研究

Summary

获得分散、低成本和高容量的诊断方法，这些诊断方法可以部署到社区中进行分散检测，这对于应对全球卫生危机至关重要。本手稿描述了如何为可以使用便携式光学阅读器检测的病毒RNA序列构建基于纸张的诊断方法。

Abstract

获得可部署到社区进行测试的低负担分子诊断越来越重要，并对社会和经济稳定具有有意义的更广泛影响。近年来，出现了几种新的等温诊断模式，以满足对快速、低成本分子诊断的需求。我们通过开发和患者验证基于脚趾开关的诊断方法（包括蚊媒寨卡病毒和基孔肯雅病毒的诊断）为这项工作做出了贡献，这些诊断提供了与基于金标准逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）的测定相当的性能。这些诊断的开发和制造成本低廉，并且有可能为资源匮乏的环境提供诊断能力。在这里，该协议提供了开发基于开关的寨卡病毒检测检测方法所需的所有步骤。本文将引导读者完成逐步诊断开发过程。首先，寨卡病毒的基因组序列作为使用开源软件计算设计候选开关的输入。接下来，显示了用于使用合成RNA序列进行经验筛选和优化诊断灵敏度的传感器的组装。完成后，使用患者样本与RT-qPCR和专用光学读取器PLUM并行进行验证。这项工作为研究人员开发低成本的基于脚趾开关的传感器提供了技术路线图，用于人类健康，农业和环境监测。

Introduction

RT-qPCR由于其出色的灵敏度和特异性，一直是临床诊断的金标准技术。尽管该方法非常稳定，但依赖于昂贵的专用设备和试剂，这些设备和试剂需要温控分布和储存。这给全球高质量诊断的可及性带来了重大障碍，特别是在疾病暴发时期和设备齐全的实验室^{访问受限的地区}1^，2。这是在2015/2016年巴西寨卡病毒暴发期间观察到的。由于只有五个集中实验室可以提供RT-qPCR检测，因此产生了严重的瓶颈，限制了诊断的可及性。这对于^{受疫情影响}更严重的城郊地区个人来说尤其具有挑战性3^，4。为了改善对诊断的访问，该协议展示了一个已经开发的平台，该平台有可能在资源匮乏的环境中提供分散、低成本和高容量的诊断。作为其中的一部分，建立了一个诊断发现管道，将等温扩增和基于合成RNA开关的传感器与基于纸张的无细胞表达系统^5，6耦合。

无细胞蛋白质合成（CFPS）系统，特别是基于大肠杆菌的无细胞系统，是一个有吸引力的平台，适用于从环境监测⁷，⁸到病原体诊断⁵，⁶，⁹，¹⁰，^11，12的广泛生物传感应用.CFPS系统由转录和翻译所需的组件组成，与全细胞生物传感器相比具有显着优势。具体来说，传感不受细胞壁的限制，通常，它们是模块化设计的，生物安全的，价格低廉，并且可以冷冻干燥以供便携式使用。将基于基因回路的反应冷冻干燥到纸或纺织品等基质上的能力，使运输、^室温下长期储存5，甚至可纳入可穿戴技术¹³。

先前的工作表明，无大肠杆菌细胞系统可用于检测多种分析物，例如汞等有毒金属、四环素⁷，14 等抗生素、干扰内分泌的化学物质 15，¹⁶、马尿酸 17 等生物标志物、病原体相关群体感应分子^9，18 和可卡因 ¹⁷ 等非法物质以及羟基丁酸 γ （GHB）¹⁹.对于核酸的序列特异性检测，策略在很大程度上依赖于使用基于开关的生物传感器与等温扩增技术相结合。脚趾开关是合成的核糖调节剂（在文本的其余部分也称为"开关"），它包含一个发夹结构，通过隔离核糖体结合位点（RBS）和起始密码子来阻断下游翻译。在与它们的靶触发RNA相互作用时，发夹结构被解除，随后的报告开放阅读框的翻译被启用²⁰。

等温扩增也可用作分子诊断²¹;然而，这些方法容易发生非特异性扩增，这会降低特异性，从而降低测试的准确性，使其低于RT-qPCR ²²。在这里报告的工作中，基于开关的传感器上游的等温放大用于提供组合信号放大，从而能够对核酸（飞摩尔到阿托摩尔）进行临床相关的检测。这两种方法的配对还提供了两个序列特异性检查点，它们的组合可提供高水平的特异性。使用这种方法，以前的工作已经证明了对寨卡⁶，埃博拉⁵，诺如病毒¹⁰等病毒的检测，以及艰难梭菌²³和抗生素耐药性伤寒¹²等致病菌的检测。最近，已经证明了用于SARS-CoV-2检测的无细胞脚趾开关，旨在为COVID-19大流行提供可访问的诊断¹¹，^12，13。

以下协议概述了用于寨卡病毒检测的无细胞、基于纸张的合成脚趾开关测定的开发和验证，从 计算机 生物传感器设计到组装和优化步骤，再到患者样本的现场验证。该方案从基于寨卡病毒RNA的RNA脚趾开关传感器和等温扩增引物 的计算机设计开始 。尽管存在许多等温扩增方法，但这里使用基于核酸序列的扩增（NASBA）来增加反应中存在的病毒RNA靶标的浓度，从而具有临床显着的灵敏度。实际上，等温扩增方法具有在恒定温度下运行的优点，无需对专用设备的需求，例如热循环仪，这些设备通常仅限于集中位置。

接下来，描述了通过重叠延伸PCR组装具有报告编码序列的合成脚趾开关传感器的过程，并使用合成RNA筛选合成脚趾开关传感器以在无细胞系统中获得最佳性能。对于这组寨卡病毒传感器，我们选择了编码β-半乳糖苷酶的 lacZ 基因，该酶能够切割比色底物氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷（CPRG），以产生黄色到紫色的颜色变化，可以通过眼睛或酶标器检测到。一旦确定了性能最佳的合成开关，就描述了使用合成RNA筛选引物以基于核酸序列等温扩增相应靶序列以找到提供最佳灵敏度的组的过程。

最后，诊断平台的性能在拉丁美洲进行了现场验证（图1）。为了确定临床诊断的准确性，使用来自患者的寨卡病毒样本进行基于纸张的无细胞测定;同时进行金标准RT-qPCR测定以进行比较。为了监测无比色细胞分析，我们可以在没有热循环仪的区域对结果进行现场定量。这里还介绍了手工组装的酶标仪，称为便携式，低成本，用户友好，多模式（PLUM;以下简称便携式酶标仪）²⁴。便携式酶标仪最初是作为无细胞合成脚趾开关诊断的配套设备开发的，提供了一种以高通量方式孵育和读取结果的便捷方式，为用户提供基于计算机视觉的集成软件分析。

图 1:使用纸质无细胞脚趾开关反应测试患者样品的工作流程。 请点击此处查看此图的大图。

Protocol

所有涉及人类参与者的程序均应按照伦理标准和相关准则进行，包括世界医学协会赫尔辛基宣言制定的涉及人类受试者的医学研究的伦理原则。这项研究由人类研究伦理委员会批准，许可协议号为CAAE:80247417.4.0000.5190。Fiocruz-PE机构审查委员会（IRB）放弃了本研究中所有患者的知情同意。

注意:PLUM 设备在下文中称为"便携式酶标仪"。

1. 基于核酸序列的扩增引物的计算设计

1. 通过将基因组序列放入NCBI /核苷酸^BLAST25，²⁶中^，扫描寨卡基因组以识别一组长度约为200个核苷酸（nt）至300 nt的扩增候选区域。将基因组与参考RNA序列（refseq_rna）进行比较，并搜索保持高度保守且与人类基因组没有同源性的位点（其他BLAST参数保持不变）。选择至少两个位置来设计合成脚趾开关。
2. 使用 Deiman 等人的选择标准 ²⁷ 为每个候选扩增区域生成一对基于正向和反向核酸序列的扩增引物。简而言之，设计引物时遵循以下标准:（1）GC含量在40%-60%之间;（2）长度20至24 nt，DNA解解温度高于41°C;（3）没有四个或四个以上相同核苷酸的运行;（4）最后3'核苷酸为A碱基;（5）引物二级结构和二聚体形成概率低。为每个靶区筛选8-10对引物（推荐）。
3. 将包含 T7 启动子序列 AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG（T7 启动子序列下划线）的前缀序列附加到正向引物的 5' 端，以允许使用 T7 RNA 聚合酶 （RNAP） 转录扩增子。从DNA合成公司订购引物作为DNA寡核苷酸。

2. 脚趾开关的计算设计

1. 根据网站²⁹上的说明安装NUPACK²⁸版本3.2（核酸设计套件）。使用 UNIX 操作系统和 MATLAB（数字计算平台）作为编程语言（推荐）。
2. 如步骤1.1所示，确定特定于目标病原体的靶序列（例如，病毒基因组），用于脚趾开关设计。从步骤1.2中生成的基于核酸序列的扩增子中选择寨卡靶序列。
   注意:在实践中，可以根据用户的需求首先设计和测试基于核酸序列的扩增引物或合成脚趾开关。如果已经确定了感兴趣的特定靶区（例如，从现有出版物或诊断方案中），则可以首先进行脚趾开关设计和筛选，然后设计和筛选基于核酸序列的扩增引物。如果没有确定的靶区，首先针对全基因组筛选基于核酸序列的扩增引物，以缩小选择靶标的范围，同时选择引物扩增效率。如果病原体有多个序列可用，最好设计基于核酸序列的扩增引物，专注于高度保守的区域（而不是筛选整个基因组）。
3. 在计算机上下载并安装所需的 MATLAB 软件。
4. 设置环境变量以允许在软件中调用核酸设计套件函数。为此，请打开软件，然后在默认工作文件夹中打开（或创建）startup.m 文件。接下来，将以下代码行复制到 startup.m 文件中，最后将包含核酸设计套件二进制文件的文件夹添加到 PATH 中:
   NUPACKINSTALL = '/Users/[user_name]/.../nupack3.2.2';
   setenv（'NUPACKINSTALL'，NUPACKINSTALL）;
   setenv（'PATH'，[getenv（'PATH'），sprintf（':%s/build/bin'，NUPACKINSTALL）]）;
5. 打开数字计算平台软件并导航到设计软件文件夹。运行可在 https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN 访问的设计算法。
6. 将目标序列输入到位于输入子文件夹中的design_input_file.csv中。输入包括名称、外部序列、内部序列、温度、输出名称和输出序列，如 表 1 中定义。如果尚未确定靶标的引物位点，请保持内部和外部序列相同。在设计过程中，仅考虑报告器的前 29 NT。完成后，保存并关闭更新的电子表格。
   注意:输出序列是计划用于测定的报告蛋白序列（例如， lacZ）。指定内部和外部序列可确保算法不会生成与任一引物重叠的合成脚趾开关。它还确保该测定识别寨卡基因组中的三个独特位点，以提高其特异性。
7. 选择要用于设计功能的参数:toehold_switch_design_run（num_designs，input_file，选项）。将参数值填充为:
   1. num_designs - 软件输出的每个目标的顶级设计数量。默认值为 6，可以根据需要进行更改（建议每个目标至少六个设计）。
   2. input_file - 此参数指定提供输入序列信息的文件的名称。默认值为"design_input_file.csv"，可以根据需要进行更改。
   3. 从以下选项中进行选择 - （1） 系列 A 和系列 B:代码将生成的脚趾开关版本。将 B 系列设置为 1，将 A 系列设置为 0 以生成 B 系列脚趾开关，这是寨卡病毒诊断⁶ 中使用的格式;（2） 并行:设置为 1 以利用多个内核来计算设计;否则，设置为 0;（3）反义:设置为1以生成混合目标输入的反义序列（即反向补码）的脚趾开关;否则，设置为 0。
8. 使用所选参数运行设计函数:toehold_switch_design_run（num_designs，input_file，选项）。然后，该算法将开始为感兴趣的目标生成脚趾开关设计。
9. 设计完成后，以.csv格式电子表格的形式在final_designs文件夹中找到顶部脚趾开关设计序列和相应的目标序列。该算法生成的脚趾开关DNA序列将在5'端包含T7启动子序列，在3'端包含保守的21 nt接头序列AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG。
10. 通过将生成的顶部脚趾开关设计序列放在NCBI-BLAST上并检查序列同源性来筛选这些序列。接受同源性为 40% 或更低的序列。
11. 订购脚趾开关发夹序列作为DNA寡核苷酸，然后将它们与报告基因组装成功能齐全的开关。根据所选的报告蛋白，订购必要的PCR引物以进行后续电极组装。

参数	定义
名字	输出脚趾开关序列的所需名称。
外序列	通过扩增产生的完整NASBA成绩单。
内序	排除引物结合位点的外部序列。它与外部序列匹配，但排除与正向和反向引物结合的转录本部分。
温度	算法用于计算RNA结构的温度。
输出名称	输出基因的名称（例如 lacZ， gfp）。
输出序列	输出基因的序列。

表 1:脚趾式开关设计软件中使用的每个参数的定义。

3. 通过PCR构建脚趾开关

注意: 这些步骤描述了通过重叠延伸 PCR 构建 LacZ 脚趾开关。在这里，DNA寡核苷酸用作正向引物，T7终止子用作反向引物。我们使用pCOLADuet-LacZ质粒作为 lacZ 基因（addgene:75006）的模板。任何其他包含相应序列的DNA模板都可以用作模板，前提是T7终止子包含在最终构建体中。

1. 从商业提供者处收到合成DNA寡核苷酸后，在无核酸酶水中制备浓度为10μM的合成DNA和反向扩增引物溶液。根据 表2在冰上的PCR管中组装反应。
   注意:PCR体积可以根据需要进行缩放。使用最少量 （0.1-1 ng） 的 pCOLADuet-LacZ DNA 模板，以避免需要额外的质粒去除步骤或背景 LacZ 信号。对于更高的 DNA 模板量，请使用 DpnI 限制性内切酶酶切物进行 PCR 以去除残留的质粒模板。
2. 按照表3中列出的循环条件将反应物置于热循环仪中。分析琼脂糖凝胶上的PCR产物（图2;参见补充方案和³⁰）。
3. 根据制造商的说明，使用基于离心柱的PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，并在15-30μL无核酸酶水中洗脱DNA。使用分光光度计定量DNA。

元件	卷	浓度
5X Q5 反应缓冲液	10 微升	1 倍
10 mM dNTP	1 微升	200微米
10 mM 正向引物（合成开关 DNA FW）	2.5 微升	0.5微米
10 mM 反向引物（T7 终结器RV）	2.5 微升	0.5微米
模板 DNA （pCOLADuet-LacZ）	变量	<1 纳克
Q5 高保真 DNA 聚合酶	0.5 微升	0.02 微米/微升
无核酸酶水	至 50 μL	-

表 2:用于构建脚趾开关的 PCR 组分。

步		温度	时间
初始变性		98 °C	30 秒
35 个周期	变性	98 °C	10 秒
	退火	60 °C	20 秒
	外延	72 °C	1.45 分钟
最终延期		72 °C	5 分钟
拿		4°C	-

表 3:通过 PCR 构建脚趾开关期间使用的循环条件。

4. 合成RNA靶标的制备（触发器）

1. 使用分子生物学设计软件，修改合成触发RNA模板（在步骤1.1中选择）以包含上游T7启动子序列，确保完整模板保持简短（<200 bp）。设计正向和反向引物以扩增触发序列引物（有关寡核苷酸序列，请参阅 补充方案）。
2. 将序列作为DNA寡核苷酸排序。收到后，在无核酸酶水中将合成触发DNA和扩增引物重建至10μM。根据 表2 将相应的PCR组装在冰上的薄壁管中，并使用0.5μL触发DNA超聚体（终浓度为0.1μM）作为模板DNA。
3. 将反应物放入热循环仪中，并使用 表3中列出的循环条件。使用15秒的延长时间。按照步骤3.3和 补充协议中所述评估质量并纯化触发PCR产物。
   注意:为了加快该过程，柱纯化的触发PCR产物也可以直接用于初始脚趾开关筛选。

5. 选定触发序列的 体外 转录

1. 根据 表4在冰上组装反应组分。
2. 在37°C下孵育i体外 转录（IVT）反应4小时，然后进行DNase I处理以去除模板DNA。对于 DNase I 步骤，加入 70 μL 无核酸酶水、10 μL 10x DNA 酶 I 缓冲液和 2 μL DNase I（无 RNase），并在 37 °C 下孵育 15 分钟。如果不立即进行步骤5.4，则通过加入50mM EDTA灭活DNase I并在65°C下热灭活10分钟。
3. 可选步骤:对IVT产品进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（例如尿素-PAGE）分析，以评估 补充协议中所述的RNA质量。
4. 根据制造商的说明，使用基于柱的RNA净化试剂盒纯化触发IVT产物，然后使用分光光度法定量RNA浓度和纯度。有关如何确定RNA的摩尔浓度和拷贝数/μL的说明，请参阅 补充方案 。

元件	卷	浓度
10X 反应缓冲液	1.5 微升	0.75 倍
25 mM NTP 混合物	6 微升	7.5 毫米
模板触发基因	X 微升	1微克
T7 RNA聚合酶混合物	1.5 微升	-
无核酸酶水	X 微升	至 20 μL

表4:选定触发序列的 体外 转录（IVT）。

6. 开关的初步筛选

注意:本节介绍与设置无电池、纸质脚趾开关反应相关的步骤，以及如何筛选高性能脚趾开关。步骤6.10中使用的BSA封闭滤纸应按照 补充议定书中所述提前准备。

1. 通过将 25 mg 粉末溶解在 1 mL 无核酸酶水中来制备 CPRG 储备溶液。始终将溶液保持在冰上，并储存在-20°C以备长期使用。
2. 确定要设置的反应数。对于评估的每个脚趾开关，包括无模板对照（无开关和无靶RNA-也称为无细胞单独对照），以考虑预混液可能产生的任何背景信号。包括仅开关对照，以评估在没有靶RNA的情况下的背景开关泄漏或OFF率。
3. 根据 表5中列出的标准方案，在冰上组装溶液A，溶液B，RNase抑制剂和CPRG的无细胞反应预混合物。
   注意:此处描述的步骤适用于预混液，该预混液足以进行一式三份的1.8 μL反应，并增加10%的体积以解决移液错误。应根据需要调整预混液量，具体取决于筛选的脚趾开关的数量。
4. 对于每个一式三份无细胞反应，将预混液分配到PCR管中，将所有试管保持在冰上。对于留作无细胞单独对照的试管，加入无核酸酶水至终体积为5.84μL，通过上下移液混合，然后短暂离心。对于其余的管，加入PCR纯化的脚趾开关DNA至终浓度为33nM。
5. 对于单独作为开关对照的试管，加入无核酸酶水至最终体积为 5.84 μL。对于留出用于测试脚趾开关和靶RNA组合的试管，加入 体外 转录的靶RNA至终浓度为1μM。然后，加入无核酸酶的水至终体积为 5.84 μL。 通过上下移液彻底混合所有反应，并短暂离心。
6. 在 384 孔黑色透明底板上向反应孔周围的孔中加入 30 μL 无核酸酶水。这最大限度地减少了实验过程中的蒸发，并提高了可重复性。
   注意:如果使用便携式读板器设备，请将PCR箔放在板上，并使用精密刀切出用于反应的孔以及四个角孔中的每一个。PCR箔可防止便携式酶标仪相机从空孔中过度曝光。
7. 使用2毫米活检打孔器和镊子，切开BSA堵塞的滤纸盘，并通过弹出冲头或使用镊子将它们放入反应孔中（参见制备BSA封闭滤纸的 补充方案 ）。将每个反应管中的 1.8 μL 体积一式三份分配到 384 孔板中的滤纸盘上，将所有样品以及 384 孔板始终保持在冰上。
   注意:如果使用便携式读板器设备，则向 384 孔板的四个角中的每个角添加 1.8 μL CPRG （0.6 mg/mL）。CPRG 的黄色为便携式酶标仪提供模式识别，以便在图像分析中对齐数字多孔板模板。用PCR膜覆盖板的孔以防止蒸发。
8. 将板放入读板器中，每分钟在37°C下读取OD₅₇₀ ，持续130分钟。

元件	卷	每次反应的最终浓度
解决方案 A	2.38 微升	40%
解决方案 B	1.78 微升	30%
核糖核酸酶抑制剂	0.03 微升	0.5% v/v
心肺复苏术（25毫克/毫升）	0.14 微升	0.6毫克/毫升
脚趾开关	X 微升	33 纳米
靶核糖核酸	X 微升	1 微米
无核酸酶水	至 5.94 μL	-
总体积:		5.94 微升

表5:PURExpress无细胞转录-翻译反应组分。

7. 识别高性能脚趾开关

注意:本节介绍如何分析步骤 6 中的数据，以便选择性能最佳的脚趾开关进行继续操作。

1. 首先归一化到背景OD₅₇₀吸光度开始数据分析。为此，从其他OD 570测量中减去没有任何开关或靶RNA（即无细胞单独孔）的反应的OD₅₇₀测量值。
2. 使用三点移动平均线平滑归一化数据，并将每个孔的最小值调整为零。有关为脚趾开关 27B、33B 和 47B 收集的归一化时程数据的示例，请参见 图 3 。
3. 使用此处理后的数据，通过确定脚趾开关与目标和单独开关孔之间的颜色变化率差异（即OD₅₇₀ 随时间的变化）来计算倍数变化（或ON/OFF比率）（参见计算比率的 补充协议 ; 图4）。
4. 选择具有最高开/关折叠变化的开关以进行进一步表征。省略显示最小倍数变化的性能不佳的脚趾固定开关。

8. 基于核酸序列扩增引物筛选和灵敏度

注意:在以下步骤中，首先对功能等温扩增引物进行筛选，然后通过确定给定的脚趾开关在与等温扩增偶联时可以可靠地检测到的每μL合成RNA的靶RNA拷贝数来评估其灵敏度。等温扩增后，进行无细胞反应，以鉴定成功的基于核酸序列的扩增引物组。然而，在基于核酸序列的扩增反应上运行聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶以首先缩小候选引物集的范围可能更具成本效益。在这种情况下，基于核酸序列的扩增引物组可以在适当的扩增子大小的凝胶上产生条带，可以入围后续的无细胞筛选。

1. 在无核酸酶水中制备所有正向和反向引物组的25μM储备溶液（参见 补充方案）。确定需要设置的基于核酸序列的扩增反应和随后的无细胞反应的数量。这将取决于脚趾开关的数量和相应的底漆组。
   注意:筛选引物时，重要的是始终为每个引物组包括无模板对照，以考虑由于引物相关的非特异性扩增可能产生的任何背景伪影。
2. 按如下方式设置一个 5 μL 反应（根据需要进行缩放）。在冰上解冻所有试剂。根据 表6组装反应缓冲液，核苷酸混合物和RNase抑制剂的反应预混合物。通过上下移液彻底混合，直到白色沉淀溶解，然后将等分试样分配到PCR管中。
   1. 如果预混液用于筛选基于核酸序列的扩增引物，请首先从预混液中排除引物（分配 2.55 μL 预混液）。否则，如果进行引物灵敏度分析，引物可以包含在预混液中（在这种情况下分配2.75 μL等分试样）。在变性和平衡阶段后加入酶混合物。
3. 如果筛选基于核酸序列的扩增引物，请将正向和反向引物添加到适当的试管中。在热循环仪上，如 表7所述设置孵育方案。
4. 在 2 pM 或大约 10⁶ 拷贝/μL 时加入 1 μL 无核酸酶水或 1 μL 靶触发 RNA，确保相应地标记试管。通过轻轻移液混合并短暂旋转试管。
   注意:对于引物组筛选，使用足够高的靶标触发RNA浓度，以不影响等温扩增方法的检测下限，但又不足以在没有扩增的情况下提供脚趾开关的激活。
5. 将试管移至热循环仪并开始孵育。12 分钟后，取出试管并向每个试管中加入 1.25 μL 酶混合物。通过上下移液混合并短暂离心试管。
   注意:此时，管子可以保持在室温下;但是，酶混合物应保存在冰上，直到添加到试管中。
6. 将试管返回到热循环仪，跳过41°C保持步骤以开始1小时反应孵育。
   注意:孵育后，可以将反应物放在冰上进行当天处理，或在-20°C下冷冻以进行后续处理。
7. 按照步骤6.2-6.7和 表8 组装基于纸张的无细胞脚趾开关反应，以评估引物性能。按照步骤 7.1-7.2 和 图 3 中所述分析数据。
   注意:除了前面提到的对照外，重要的是还包括阴性对照，以考虑反应可能产生的任何背景信号。此外，重要的是还包括一个带有开关的对照和2 pM（终浓度）的靶RNA作为无NASBA扩增对照。
8. 确定候选引物对，继续进行敏感性分析。根据加入孵育反应后是否发生脚趾开关激活来选择引物对。如果需要，使用更多引物组合重复引物筛选。
9. 始终将RNA样品保存在冰上，在无核酸酶水中制备以下靶RNA的系列稀释组:10⁴、10³、10²、10¹和10^{0 RNA} 拷贝/μL。 使用选定的引物组重复基于核酸序列的扩增和无细胞反应（步骤8.2-8.7），测试连续稀释系列，以确定提供最佳灵敏度的引物组。有关确定引物组灵敏度的结果示例，请参见 图5 。
   注意:理想情况下，所选的脚趾开关和引物对应每μLRNA（储备溶液浓度）检测到1-100个靶RNA拷贝。
10. 在生物一式三份中重复基于核酸序列的扩增灵敏度实验。此步骤用于在进行患者样品实验之前确认结果的可重复性。
11. 自选: 为了获得长期使用和运输的开关DNA的可靠来源，请使用任何常规克隆方法将选定的开关序列克隆到质粒中。类似地，靶标触发RNA序列也可以克隆到所选质粒中进行储存。

元件	每次反应的体积	最终浓度
NASBA反应缓冲液	1.67 微升	1 倍
NASBA核苷酸混合物	0.833 微升	1 倍
25 μM 正向底漆	0.1 微升	0.5微米
25 μM 反向底漆	0.1 微升	0.5微米
核糖核酸酶抑制剂 （40 U/μL）	0.05 微升	0.4 微米/微升
靶核糖核酸	1 微升
NASBA酶混合物	1.25 微升	1 倍
总体积	5 微升

表6:NASBA反应组分。

步	温度	时间
变性	65 °C	2 分钟
平衡	41 °C	10 分钟
拿	41 °C	∞
孵化	41 °C	1 小时
拿	4°C	-

表7:NASBA的反应条件。

元件	卷	每次反应的最终浓度
解决方案 A	2.38 微升	40%
解决方案 B	1.78 微升	30%
核糖核酸酶抑制剂	0.03 微升	0.5% v/v
心肺复苏术（25毫克/毫升）	0.14 微升	0.6毫克/毫升
脚趾开关	X 微升	33 纳米
靶核糖核酸（如适用）	X 微升	1 微米
NASBA（如适用）	0.85 微升	1:7
无核酸酶水	至 5.94 μL	-
总体积:		5.94 微升

表8:纸基无细胞反应组分。

9. 患者样本采集和病毒RNA提取

注意:本节介绍收集患者样本和使用RNA纯化试剂盒提取RNA的方案。以下方案用于从外周血中获取血清。本研究中使用的样本是从巴西伯南布哥州出现发烧、发疹、关节痛或其他虫媒病毒感染相关症状的患者收集的。

1. 收集疑似虫媒病毒感染患者的外周血样本。使用标准无菌技术进行静脉穿刺（全血管）。用匿名代码和样品收集日期标记样品管。
2. 离心血液以2，300× g 分离血清10分钟。使用移液器制备等分试样血清 （200 μL），用于 1.5 mL 管中的 RNA 提取。
   注意:如果在样品采集后不久无法进行RNA提取，则在下游应用之前，应将血清样品储存在-80°C。
3. 将含有载体RNA的560 μL制备的缓冲液AVL（病毒裂解缓冲液）移液到1.5 mL管中。将 140 μL 血清加入管中的缓冲液 AVL/载体 RNA 混合物中。通过脉冲涡旋混合15秒。
4. 在室温下孵育10分钟，然后短暂离心样品以收集管底部的内容物。向样品中加入 560 μL 乙醇 （96%-100%），并通过脉冲涡旋混合 15 秒。混合后，离心样品以收集管底部的内容物。
5. 小心地将步骤9.4中的630 μL溶液添加到离心柱中，不要弄湿边缘。按照此步骤，关闭盖子，并以6，000× g 离心1分钟。将离心柱放入干净的 2 mL 收集管中，丢弃含有滤液的用过的收集管。
6. 小心地打开旋转柱并重复步骤 9.5。小心地打开离心柱并加入 500 μL 缓冲液 AW1（洗涤缓冲液 1）。关闭盖子，并以6，000× g 离心1分钟。将离心柱放入干净的 2 mL 收集管中，丢弃含有滤液的用过的收集管。
7. 小心地打开离心柱并加入 500 μL 缓冲液 AW2（洗涤缓冲液 2）。关闭盖子并以20，000 x g 离心3分钟。将离心柱放入干净的 2 mL 收集管中，并丢弃含有滤液的用过的收集管。
8. 为避免残留缓冲液AW2的污染，以免在下游酶促反应中引起问题，请将离心柱放入干净的2 mL收集管中，并将用过的收集管与滤液一起丢弃。以20，000× g 离心1分钟。
9. 将离心柱放入干净的 1.5 mL 管中，并丢弃用过的收集管和滤液。小心地打开离心柱，加入60 μL平衡至室温的缓冲液AVE（洗脱缓冲液）。按照此步骤，关闭盖子，并在室温下孵育1分钟。
10. 以6，000 x g 离心1分钟。洗脱的RNA可以并行用作NASBA和RT-qPCR的输入。
11. 按照步骤 8.3 至 8.11 使用 1 μL 提取的患者 RNA 进行基于核酸序列的扩增和基于纸张的无细胞反应，确保包括阴性和阳性对照反应。反应后，制备384孔反应板并在37°C的便携式读板器中运行测定（详见 补充协议）。
    注意:从培养的寨卡病毒中提取的两种RNA浓度为10⁴ 和10^{2 PFU} /mL，在临床验证期间用作所有实验的阳性对照。除了前面提到的对照外，重要的是将触发器（10 ng/μL）作为阳性对照。
12. 在每次实验结束时，来自平板读数仪的原始数据（.csv文件）可以在线上传到安全的数据库。此外，便携式酶标仪生成一份报告，指示样本是寨卡病毒阳性还是阴性（图6）;有关孵育期间获得的所有图表的示例，请参阅代表性结果部分（图7）。
    注意:用户还可以 通过USB将 文件从便携式读板器传输到自己的计算机。

10.便携式读板仪

1. 便携式酶标仪装置（图8）可用作常规酶标仪²⁴的替代。有关协议和代表性结果，请参阅 补充协议。

11. 用于寨卡病毒检测的RT-qPCR方法

注意:本节概述了从患者样本中执行用于寨卡病毒检测的RT-qPCR的步骤（参见 补充方案）。

1. 为避免污染，请将RT-qPCR组分组装在与扩增过程隔离的区域（例如，清洁罩）中。将RT-qPCR缓冲液、酶和引物/探针放在冰上或冷块上。之后，根据 表9将反应添加到冰上的384孔板中。
   注意:建议所有实验使用阴性（提取对照和非模板对照[NTC]）和阳性对照（10⁴ PFU/mL）。
2. 将试剂加入 1.5 mL 微量离心管后，通过上下移液（不要涡旋）混合反应物，并将 6.5 μL 分配到每个孔中。加入 3.5 μL 的每个 RNA 模板，一式三份。
3. 将PCR膜放在板的顶部。将384孔板以600 x g 离心2分钟。
4. 使用 表10中概述的以下循环条件将板放入RT-qPCR仪中。要分析结果，请使用RT-qPCR机器设计和分析软件，并考虑自动阈值和基线（详见 补充协议）。

元件	卷	浓度
2X 定量新星探针 RT-PCR 预混液	5 微升	1 倍
100 μM 正向引物	0.08 微升	0.8微米
100 μM 反向引物	0.08 微升	0.8微米
25 μM 探头	0.04 微升	0.1微米
匡蒂诺瓦ROX参比染料	0.05 微升	1 倍
匡蒂诺瓦探头RT混合物	0.1 微升	1 倍
模板核糖核酸	3.5 微升	-
无核酸酶水	至 10 μL	-

表 9:根据美国疾病控制和预防中心（CDC USA）扩增寨卡病毒 RNA 的 RT-qPCR 组分，用于从患者样本中检测寨卡病毒³¹.

步		温度	时间
反转录		45 °C	15 分
PCR初始激活步骤		95 °C	5 分钟
45 次循环	变性	95 °C	5 秒
	组合退火/延伸	60 °C	45 秒

表10:RT-qPCR的循环条件。

Results

按照计算设计流程，通过PCR构建了三个脚趾开关。使用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物（图2）。存在大约3，000 bp的清晰条带，大约与脚趾开关偶联的 lacZ 基因的大小大致相同，通常表明反应成功。或者，没有条带、多个条带或条带大小不正确的泳道表示 PCR 失败。在PCR失败的情况下，应优化反应条件和/或引物序列。

对组装好的脚趾开关进行筛选，以评估每个传感器各自的 体外 转录触发RNA（图3）。虽然所有三个传感器都显示出OD₅₇₀ 吸光度的增加，但开关27B（图3A）具有最快的导通速率。在没有靶标触发RNA的情况下，开关33B和（在较小程度上）47B显示出OD₅₇₀ 吸光度增加，表明这些开关具有一些背景活性或泄漏性（图3B，C） - 这是候选传感器不需要的特性，因为它会降低特异性。为了更清楚地识别具有最高ON/OFF信号比的传感器，计算了OD₅₇₀ 吸光度的倍数变化（参见补充信息第5节）并绘制了图（图4）。从该分析中可以清楚地看出，开关27B是具有最佳性能的传感器，开/关比约为60。

然后通过确定与NASBA反应偶联时激活脚趾开关所需的最低RNA浓度来评估性能最佳的脚趾开关（27B）的灵敏度。该图表明，性能最佳的寨卡传感器可以检测浓度低至每μL1.24个分子（相当于~2 aM; 图5）。

在确定并验证开关27B后，传感器材料被分发给巴西伯南布哥州累西腓的团队成员。在巴西，使用寨卡病毒患者样本评估寨卡病毒诊断平台的临床诊断准确性，并结合RT-qPCR进行比较。为了验证纸质寨卡诊断平台，使用了便携式酶标仪，该酶标仪能够孵育和读取纸基传感器的比色输出。颜色从黄色变为紫色用于识别阳性样品，而阴性样品保持黄色（图6）。可视化便携式酶标仪生成的结果（图8）的另一个选项是绘制每个纸基反应随时间变化的比色响应。样品一式三份进行测试，超过阈值（红线设置为1）的样品被认为是阳性的，而低于阈值的样品被认为是阴性的（图6 和 图7）。

最后，为了评估和比较寨卡脚趾开关传感器与当前诊断寨卡病毒感染的金标准方法的临床性能，所有患者样本均与RT-qPCR并行测试。将两个代表性患者样本的扩增图一式三份用于通过RT-qPCR检测寨卡病毒（图9）。当循环阈值 （Ct） 值为 ≤38 时，样品被视为阳性;红线表示阳性样本，蓝线表示寨卡病毒阴性样本。

图2:琼脂糖凝胶电泳评估PCR产品的质量。 在1X TAE的1%琼脂糖凝胶上分析PCR产物，在80V下运行90分钟。单个清晰的条带通常表示反应成功。泳道 1:1 kb DNA 分子量标准;泳道2-4:分别为27B开关DNA、33B触发DNA和47B触发DNA。左侧的数字表示以 bp 为单位的条带大小。 请单击此处查看此图的大图。

图 3:用于纸质寨卡传感器的三个脚趾开关的原型设计。 在37°C下测量了三个纸基RNA脚趾开关传感器的性能超过130分钟。每个图形包含两条迹线，一条表示仅开关控件，另一条表示开关和触发器。这三张图表示使用脚趾开关传感器 27B （A）、33B （B） 和 47B （C） 获取的数据。误差条表示三个重复的平均值 （SEM） 的标准误差。 请点击此处查看此图的大图。

图 4:通过计算 570 nm 处吸光度的倍数变化来识别性能最佳的传感器。 通过仅开关对照和开关加触发CFPS测定之间130分钟测量吸光度（OD₅₇₀）来计算倍数变化（或最大ON/OFF比）。误差线表示来自三个重复的SEM。 请点击此处查看此图的大图。

图 5:高性能开关的灵敏度评估。 将体外 转录的寨卡RNA滴定为NASBA反应。孵育1小时后，将反应物以1:7的比例加入纸盘上的无细胞PURExpress反应中。绘制37°C下130分钟后的倍数变化。这一数字转载自²⁴。 请点击此处查看此图的大图。

图 6:装有捕获图像数据的便携式酶标仪捕获页面。 该图显示了便携式酶标仪在数据收集运行期间捕获的最终图像的示例图片。原始日期/时间戳在图像顶部可见。黄色表示对照或阴性反应，紫色表示阳性反应。 请点击此处查看此图的大图。

图 7:数据分析模式。 在左侧，用户选择他们想要绘制的数据集;然后，图形以每个样品或对照集的唯一颜色显示在右侧。红色虚线用作确定阳性和阴性样本的阈值。超过阈值的一式三份测试的样品被视为阳性，而低于阈值的样品被视为阴性。误差线表示三个重复的标准偏差（SD）。按 1 到 按 5 表示控件。 请点击此处查看此图的大图。

图8.PLUM，便携式酶标仪。 这款便携式酶标仪可用作盒中实验室，并用作温控酶标仪，以孵育和监测比色反应。这种便携式设备可以在现场对纸质寨卡传感器进行定量和高通量测量。 请点击此处查看此图的大图。

图 9:用于检测寨卡病毒的两个患者样本扩增的 RT-qPCR 图，一式三份。当循环阈值 （Ct） 值为 ≤38 时，样品被视为阳性。红色虚线用作确定阳性和阴性样本的阈值。红色迹线表示阳性样品，蓝色迹线表示阴性样品。ΔRn（δ Rn）值表示RT-qPCR仪器对所有测试样品检测到的荧光信号的归一化幅度。请点击此处查看此图的大图。

补充协议文件。请点击此处下载此文件。

补充数字。 请点击这里下载这些数字。

Discussion

这里描述的组合纸基系统可以将临床相关的分子诊断，其性能在功能上可与RT-qPCR相媲美，达到需求点⁶。重要的是，对于远程设置，现场诊断的可用性可以将获得结果的时间从几天缩短到几小时。突出了这种方法的可编程性，所描述的管道可用于检测几乎任何病原体靶标。我们将分子工具与专用便携式酶标仪配对，该酶标仪结构紧凑且与电池操作（8-9 小时）兼容，并提供板载数据分析以支持分布式应用。在其他工作中，我们已经用268个患者样本验证了硬件和寨卡病毒诊断平台的组合，并与RT-qPCR并行，发现诊断准确率为98.5%²⁴。总而言之，我们的目标是使该平台能够向研究人员转移技术，以便社区可以重新利用和改进该平台，以解决未满足的诊断需求。

计算机式脚趾开关设计过程已集成并自动化到可分为三个阶段的管道中。第一阶段生成一组脚趾开关设计，这些设计以一个核苷酸增量与靶序列杂交。第二阶段检查二级结构和脚趾开关的可用性，并消除带有帧内过早停止密码子的传感器。然后实施考虑多种因素（例如，脚趾开关的缺陷水平、脚趾开关可用性和目标部位可访问性）的评分功能，以根据总分选择顶部脚趾开关设计。在最后阶段，为顶部脚趾开关设计及其相应的目标触发器生成序列列表。应使用 NCBI/引物-BLAST²⁵ 筛选顶部传感器序列对人类转录组和密切相关的病毒基因组的特异性。在寨卡病毒基因组中筛选传感器靶位点以进行序列保存也是最佳实践，以确保传感器能够提供广泛而强大的检测。已经开发了多个版本的脚趾式开关设计软件，设计算法允许用户生成两个版本，即 A 系列 6 或 B 系列脚趾式开关⁶。在本文中，重点介绍了B系列脚趾开关设计。

在商业DNA合成之后，可以快速组装脚趾开关，然后通过对对应于靶基因组短区域（200-300 nt）的合成靶触发序列进行初始筛选来进行测试。为了筛选基于脚趾开关的传感器的性能，最好以RNA的形式添加靶序列。在本文中，概述了添加 体外 转录触发RNA所需的步骤。但是，如果可用，可以使用全长基因组模板，例如定量的病毒RNA提取物或商业合成RNA基因组或标准品。使用全长RNA基因组进行初始脚趾开关筛选是有益的，因为它可以告知其他因素（如RNA二级结构）是否会影响传感器性能。为了优化候选开关的开/关比，可以将脚趾开关DNA滴定到无细胞反应中。此步骤还可用于识别高性能的脚趾保持开关（折叠扩增或高 ON/OFF 比），并从下游表征步骤中省略泄漏的脚趾保持开关（在没有靶 RNA 的情况下的高信号）。

为了提高性能最佳的脚趾开关候选物的检测限，NASBA用于将靶标寨卡病毒RNA的临床相关浓度提高到可以通过脚趾开关检测到的水平⁶。筛选正向和反向引物组的不同组合，以确定最佳的NASBA引物和脚趾开关组合，以便在临床相关浓度下进行检测。一旦确定了理想的引物组和脚趾开关组合，该测定将进行临床验证。需要注意的是，脚趾开关和NASBA筛选阶段可能是劳动力和资源密集型的，因此测试开发最适合资源充足的研究地点。虽然我们还没有应用流程自动化，但这很可能会加速迭代设计、构建和测试周期³²。幸运的是，从传感器设计和测试到部署的周转时间可能非常短（不到一周），这使得该策略非常适合时间紧迫的情况，例如流行病爆发⁶。

即使在开发出具有临床相关灵敏度的生物传感器之后，也存在需要解决的技术挑战。由于该协议涉及手动操作并且是一个多步骤程序，因此存在样品之间交叉污染的风险。我们尽最大努力通过仔细的实验室实践来降低这种风险。在最近对268个患者样本进行的临床试验中，我们没有遇到任何污染问题;然而，这是一个重要的考虑因素²⁴.考虑到这一点，该协议仍然是实验室测定，需要熟练的用户掌握适当的分子生物学技术。部署的另一个考虑因素是从患者样本中分离RNA。在这里，我们描述了使用基于柱的核酸提取试剂盒进行RNA分离。然而，在其他工作中，我们已经展示了一种有效且简单的沸腾裂解方法（95°C2分钟）用于低负担的患者^{样品处理6}。这种策略几乎消除了与RNA提取相关的成本，并避免了使用基于柱的核酸提取试剂盒，在资源匮乏的环境中或在危机期间（如COVID-19大流行）期间的供应链问题中，这可能会带来物流挑战³³。

正如我们在 COVID-19 大流行期间所看到的那样，用于执行 RT-qPCR 的仪器本身可能成为瓶颈并限制患者获得检测的机会。这一因素在很大程度上也是财务因素，导致集中测试模式可以限制诊断访问。例如，在2015/2016年寨卡疫情期间，巴西只有五个国家参考实验室，这导致患者检测延迟。在不考虑规模经济的潜在好处的情况下，便携式酶标仪目前的商品成本为~500美元，即使考虑到劳动力和商业利润而增加五倍，仍然提供了一种负担得起的工具。相比之下，RT-qPCR 仪器的成本从 15，000 美元到 90，000 美元不等，³⁴ 美元不等。此外，拉丁美洲无细胞检测的每次检测费用约为5.48美元，而在寨卡病毒爆发时，巴西RT-qPCR的每次检测费用为~10-11美元³⁶。除了设备成本外，便携式酶标仪占地面积小（20 cm³），自动分析， 数据 通过互联网上传到云端，并且可以使用电池供电。这些功能极大地扩展了可以部署测试的潜在设置，并同时扩大了可以服务的患者群体。

迄今为止，最常见的商用大肠杆菌CFPS平台是S30和PURE系统³⁷;然而，改善低收入和中等收入国家获得诊断服务的一个关键考虑因素是这些试剂的国内供应有限。解决这一挑战的一个重要步骤是发展当地的CFPS生产。Federici实验室最近在开发一个非商业平台方面取得了重大进展，该平台在基于裂解物的无细胞系统中实施基于脚趾开关的传感器，寨卡病毒RNA¹⁴达到2.7 fM LOD。这一成就不仅允许试剂在使用国生产，避免进口关税和延误，而且劳动力成本也随着当地费率的调整，因此总体成本可以显着降低。在Federici小组概述的工作中，智利生产CFPS表达反应（5μL）的成本为6.9美分（美元）35，38，为实施基于裂解物的系统提供了双重激励（改善物流和成本）^35，38。

将RT-qPCR可比检测放入分布式诊断网络可以带来比当前依赖于将样本运输到集中式RT-qPCR设施的做法的显着优势。在寨卡病例集中的城郊地区，患者与诊断机构之间的物理距离会减慢诊断速度，并增加结果无法在临床相关时间到达患者的风险。我们希望，这里介绍的工作能够有助于使研究界能够通过知识转让，为人类健康、农业和环境监测创造分散的生物技术和便携式硬件。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
384 孔板盖 - 铝制	Sarstedt	95.1995	用于在将 384 孔板插入 PLUM 读板仪之前将其盖上
384 孔板盖 - 透明	Sarstedt	95.1994	用于在将 384 孔板插入 BioTek 读板仪之前将其盖
384 孔板	VWR	CA11006-180	将 2 mm 纸质诊断试剂放入这些板的孔中进行定量
琼脂糖	BioShop Canada	AGA001.500	凝胶电泳
BSA	BioShop Canada	ALB001.500	Whatman 滤纸封闭剂
无细胞反应	New England Biolabs	E6800L	PURExpress
CPRG	Roche	10884308001	氯酚红-b-D-吡喃半
一次性无菌活检打孔器	Integra Miltex	23233-31	用于制作适合 384 孔板的 2 mm 纸盘
DNAse I	Thermo Scientific	K2981	孵育后消化模板 DNA
	Scientific	74104	DNase I 试剂盒 用于从 IVT RNA 中去除模板 DNA
dNTPs	New England Biolabs	N0446S	用于PCR电
泳系统	Bio-Rad	1704487	用于运行琼脂糖凝胶
凝胶成像站	Bio-Rad	1708265	ChemiDoc XRS+ 成像系统
IVT 试剂盒	New England Biolabs	E2040S	用于体外转录模板（触发）RNA 用于开关筛选
Nanodrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W	用于测定核酸浓度
NASBA 试剂盒	生命科学 先进技术	NWK-1	等温扩增反应组分
无核酸酶 H20	invitrogen	10977015	添加到反应混合物中
PAGE 电泳系统	Biorad	1658001FC	用于灌注和电泳聚丙烯酰胺凝胶
pCOLADuet-LacZ DNA	Addgene	75006	https://www.addgene.org/75006/
Phusion 聚合酶/反应蛋白缓冲液	New England Biolabs	M0530L	用于 PCR
酶标仪	BioTek	BioTek NEO2	多功能酶标仪，Synergy Neo2
引物	集成 DNA 技术		定制寡核苷酸合成
Q5 聚合酶/反应缓冲液	New England Biolabs	M0491L	用于PCR测序
QIAGEN PCR纯化试剂盒	QIAGEN	27106	QIAprep 离心小量制备试剂盒
RNA上样染料	New England Biolabs	B0363S	2X RNA上样染料
RNA纯化试剂盒	QIAGEN	EN0521	QIAamp病毒RNA提取试剂盒
RNase抑制剂	New England Biolabs	M0314S	用于防止 RNase A、B 和 C
RT-qPCR 试剂盒	QIAGEN	208352	QuantiNova 探针 RT-PCR 试剂盒
SYBR Gold	Invitrogen S11494	S11494	PAGE 核酸凝胶染色剂
TAE 缓冲液	BioShop Canada	TAE222.4	凝胶电泳缓冲液
Applied	Biosystems	4484073	用于温度循环和孵育反应
Whatman 42 滤纸	GE Healthcare	1442-042	用于嵌入用于纸质诊断的分子成分