方法文章

生长锥前进过程中的肌动蛋白动力学、黏着耦合与牵引力分析

6.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63227

⸱

2021年10月21日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Systems Neurobiology and Medicine, Division of Biological Science, Nara Institute of Science and Technology, 2Laboratory of Data-Driven Biology, Division of Biological Science, Nara Institute of Science and Technology

本文内容

摘要

为了前进，生长锥必须对外部环境施加牵引力。牵引力的产生依赖于肌动蛋白动态和离合器耦合。本研究描述了分析生长锥前进过程中肌动蛋白动态、离合器耦合以及牵引力的方法。

摘要

为了建立功能性神经网络，神经元必须迁移到其适当的位置，然后向靶细胞延伸轴突。这些过程依赖于位于神经突末端的生长锥的前进。轴突生长锥通过感知局部微环境并调节细胞骨架动力学以及肌动蛋白-黏附耦合（离合器耦合）来产生驱动力。数十年的研究已鉴定了调控神经元迁移和轴突导向的引导分子、其受体及下游信号级联；然而，驱动生长锥前进和导航所需产生作用力的分子机制才刚刚开始被阐明。在神经元生长锥的前沿，肌动蛋白丝经历向后流动，这一过程由肌动蛋白聚合和肌球蛋白收缩提供动力。F-肌动蛋白的向后流动与黏附基质之间的离合器耦合可产生推动生长锥前进的牵引力。本研究描述了一种通过单点成像技术监测F-肌动蛋白向后流动的详细方案。重要的是，当该技术与F-肌动蛋白标记物Lifeact联用时，能够量化：1）F-肌动蛋白的聚合速率；以及2）F-肌动蛋白向后流动与黏附基质之间离合器耦合的效率。这两项均为生成生长锥前进和导航所需作用力的关键变量。此外，本研究还描述了牵引力显微镜技术的详细操作流程，可用于量化：3）生长锥产生的牵引力。因此，通过结合 单点成像与牵引力显微镜的分析，研究人员可监测生长锥前进和导航背后的分子力学机制。

引言

在发育中的脊椎动物大脑中，神经元会经历高度有序的迁移，并将轴突投射至适当的突触伙伴，以建立功能性的神经元网络1,2,3。位于神经突末端的生长锥是具有感觉和运动功能的结构，可决定神经元迁移和轴突发育的速度与方向3,4,5。由于神经元处于高度密集的微环境中，生长锥必须对其周围环境施加作用力才能向前移动6,7。为了理解神经元迁移和轴突导向的分子机制，对生长锥前进过程中分子力学机制的分析至关重要。

数十年的研究表明，驱动生长锥前进的牵引力是通过“离合器”机制产生的；该机制不仅存在于轴突生长锥中，也存在于迁移神经元的前导突起生长锥中8,9,10,11,12。具体而言，生长锥中的肌动蛋白丝（F-actins）在前沿处发生聚合，并在近端区域解聚，从而推动前沿膜向外延伸13,14,15。由此产生的力与肌球蛋白收缩共同作用，引发F-actin向后运动，称为逆行流（retrograde flow）7,11,16,17,18,19,20,21。离合器分子和细胞黏附分子介导了F-actin逆行流与黏附基底之间的机械耦合，并将F-actin流动的力传递至基底，从而产生推动生长锥前进的牵引力7,8,9,11,12,22。同时，肌动蛋白与基底的耦合降低了F-actin的流动速度，并将肌动蛋白的聚合转化为推动前沿膜突出的力9,10。

轴突生长锥能够感知局部化学信号，并将其转化为驱动生长锥定向迁移的驱动力3,23,24,25。例如，轴突导向分子netrin-1可激活其受体结肠癌缺失蛋白（DCC），进而激活Rho鸟苷三磷酸（GTP）结合蛋白细胞分裂控制蛋白42（Cdc42）和Ras相关C3肉毒毒素底物1（Rac1），以及它们下游的激酶p21活化激酶1（Pak1）26。Cdc42和Rac1促进1）肌动蛋白聚合，而Pak1则磷酸化一种“离合器”分子shootin122,26。shootin1通过肌动蛋白结合蛋白cortactin与F-肌动蛋白逆行流相互作用27，同时也与L1细胞黏附分子（L1-CAM）相互作用20,24。shootin1的磷酸化可增强其与cortactin和L1-CAM的结合亲和力，并加强shootin1介导的2）离合器耦合效应24,27。在生长锥内，肌动蛋白聚合和离合器耦合的不对称激活增加了朝向netrin-1来源一侧的3）牵引力，从而产生驱动生长锥转向的定向驱动力（图1）24。过去几十年中，关于神经元迁移和轴突导向的深入研究加深了人们对导向分子、其受体以及相关下游信号通路的理解2,10,28,29,30。然而，介导生长锥前进力生成的分子机制才刚刚开始被揭示；这可能归因于用于力学-生物学分析的实验方案应用尚有限。

本研究介绍了一种通过单点成像技术监测F-肌动蛋白逆行流动的详细实验方案16,18使用超分辨率显微镜、转盘共聚焦显微镜和全内反射荧光（TIRF）显微镜已广泛用于监测F-肌动蛋白的向后流动25,31,32,33,34,35,36,37,38然而，本研究中的方案采用标准的落射荧光显微镜，因此可轻松推广应用11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42与Lifeact标记F-actin结合时43, 单点斑成像技术可实现对肌动蛋白聚合速率以及F-肌动蛋白向后流动与黏附基底之间耦合效率的量化分析39,42本研究进一步描述了一种使用嵌有荧光微球的聚丙烯酰胺（PAA）凝胶进行牵引力显微镜的详细实验方案11,22,23,24,27,39,41,42,44该方法通过监测力致微珠移动来检测并量化生长锥下方的牵引力44,45提供了一套开源的牵引力分析代码，并详细解释了在生长锥迁移过程中量化牵引力的方法。结合单颗粒成像与牵引力显微镜技术，将有助于深入理解生长锥迁移与导向的分子力学机制。这些技术同样适用于分析树突棘增大过程中的分子力学机制，而树突棘的增大已被证实与学习和记忆密切相关。42.

方案

所有使用实验动物的实验均在奈良先端科学技术大学院大学机构动物护理与使用委员会的监督下进行。研究人员应遵循其所在机构及国家动物管理委员会制定的实验动物护理与使用指南。

1. 溶液与培养基的制备

  1. 按照补充文件1中汇总的方案配制溶液和培养基

2. 多聚-D-赖氨酸（PDL）/层粘连蛋白包被基质的制备

  1. 用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）溶解的 100 µg/mL 多聚赖氨酸（PDL）包被 14 mm 直径的玻璃底培养皿，在 37 °C 湿润培养箱中孵育过夜。
    注意：此步骤后切勿使玻璃表面干燥
  2. 移除 PDL 溶液，用移液器将 1 mL PBS 加至玻璃表面，每次 10 秒，重复三次。
  3. 用 PBS 溶解的 5 µg/mL 层粘连蛋白（laminin）包被培养皿，在 37 °C 湿润培养箱中孵育过夜。
  4. 移除层粘连蛋白溶液，用移液器将 1 mL PBS 加至玻璃表面，每次 10 秒，重复三次。
  5. 移除 PBS，并在玻璃表面加入 0.5 mL 神经基础培养基（neurobasal medium）。将培养皿置于 37 °C 湿润培养箱中保存。
    ​注意：PDL/层粘连蛋白包被的培养皿可在 37 °C 湿润培养箱中保存 2–3 天。

3. 海马体的解剖与解离

  1. 通过颈椎脱位法处死一只怀孕小鼠。
    注：本研究使用市售小鼠（参见材料表）。研究人员应使用在无菌环境中繁育并以人道方式对待的小鼠。
  2. 取出胚胎第16天（E16）的小鼠胚胎，并将其置于冰上。
  3. 在超净工作台中，用剪刀解剖出脑组织，并将其放入含有10 mL冰冷解剖液的无菌10 cm培养皿中。
  4. 在解剖体视显微镜下，小心剥离大脑半球的脑膜，然后使用镊子解剖出海马体。
  5. 将海马体转移至15 mL离心管中，加入5 mL冰冷消化液。将海马体在37 °C水浴中孵育20分钟。
  6. 移除消化液，并加入3 mL解剖液。
  7. 用巴斯德移液管轻柔吹打海马体四次。
  8. 将海马体在37 °C水浴中继续孵育20分钟。
  9. 将细胞悬液转移至50 mL离心管中。向未完全解离的组织中加入3 mL新的解剖液。
  10. 重复步骤3.7–3.9，直至海马体完全解离。
  11. 用巴斯德移液管轻轻旋转并吸取细胞悬液中漂浮的DNA团块。在4 °C条件下，以180 × g离心20分钟。
    注：受损细胞释放的DNA会干扰离心过程。如果神经元仍存在于上清液中，应小心去除DNA后再次离心细胞悬液。
  12. 将含有10%胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL）的Neurobasal培养基置于37 °C、5% CO2的湿润化培养箱中平衡。

4. 转染与培养神经元

  1. 移去上清液，向50 mL离心管中加入5 mL预冷的PBS。通过轻柔吹打重悬细胞沉淀。
  2. 转移 10 µL 将细胞悬液转移至微量离心管中，加入 10 µL 加入0.5%台盼蓝溶液，然后用血细胞计数板计数细胞数量。
  3. 将50 mL管中的细胞悬液在180 x g条件下离心 g 20 分钟 4 °C.
  4. 同时，分装用于转染， 1 µg pFN21A-HaloTag-肌动蛋白的 3 µg 每 1 × 10 个 pmNeonGreen-N1-Lifeact6 细胞，放入微量离心管中。
  5. 离心后，弃去上清液并加入 100 µL 将电穿孔缓冲液（转染试剂盒提供）加入50 mL离心管中。用移液器重悬细胞沉淀。
  6. 将细胞悬液与分装的DNA溶液混合，然后将混合物转移至电转杯（由 转染试剂盒）
    注意：由于气泡会干扰电穿孔，需从细胞悬液中去除气泡。
  7. 将比色皿插入电穿孔仪中（材料表），并使用程序 O-005 进行电穿孔。
  8. 立即加入1 mL预热并平衡的含10% FBS、青霉素（100 U/mL）和链霉素的Neurobasal培养基100 µg/mL)加入比色皿中。
  9. 使用转染试剂盒提供的塑料移液管，将细胞悬液转移至15 mL离心管中。
  10. 转移 10 µL 将细胞悬液转移至微量离心管中，加入 10 µL 加入0.5%台盼蓝溶液，然后用血细胞计数板对细胞数量进行计数。
  11. 从培养箱中取出经PDL/层粘连蛋白包被的玻璃底培养皿，移除神经基础培养基。
  12. 移液0.5 mL含有2.0 × 10⁵个细胞的细胞悬液5 每皿细胞数，并在湿润的培养箱中孵育 37 °C 含5% CO₂2 3 小时.
  13. 更换为含有 2% B-27 补充剂、谷氨酰胺（1 mM）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL)。将神经元置于湿润的培养箱中培养3天，温度为 37 °C 含5% CO₂2.

5. 神经元生长锥的单点成像

  1. 第几天 体外 (体外培养第)3天，在培养基中以1:2000的稀释比例加入四甲基罗丹明（TMR）配体处理神经元，于37℃孵育1小时 37 °C 含5% CO₂2.
  2. 用预热的PBS洗涤TMR配体三次。
  3. 吸除 PBS，加入 0.5 mL 预热的含 2% B-27 补充剂、谷氨酰胺（1 mM）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL).
  4. 将神经元维持 1 h 37 °C.
  5. 打开落射荧光显微镜，并将载物台培养箱设置为 37 °C.
    注意：本实验方案使用配备互补金属氧化物半导体相机、100x/1.40 NA 油浸物镜、汞灯及图像采集软件的落射荧光显微镜（参见 材料表). 其他具有同等规格的落射荧光显微镜也可用于本分析。
  6. 将经TMR配体处理的神经元置于玻璃底培养皿中，并放入预热的载物台式培养箱内。
  7. 设置图像采集参数如下：Lifeact 和 HaloTag-actin 荧光通道的曝光时间均为 500 ms；像素合并（binning）为 1 × 10.065 µm × 0.065 µm 每像素；时间间隔，3 秒；持续时间，50 帧。
  8. 选择一个强烈表达 Lifeact 且微弱表达 HaloTag-actin 的生长锥。
    注意：Lifeact 的表达应足够强，以可视化生长锥形态。HaloTag-肌动蛋白的表达应较弱，弱至无法被检测到（图2A). 荧光蛋白表达水平可通过调整转染时的DNA用量进行调节。
  9. 关闭虹膜光圈，使照明区域最小化，仅包含生长锥图2B).
    注意：最小面积的照明可减少背景信号，提高荧光信噪比（S/N），从而实现对肌动蛋白斑点的检测图2B为了进一步提高信噪比，建议直接照射生长锥，而不使用中性密度滤光片减弱光线。
  10. 获取时间序列图像（补充文件 2)。保存为多通道时间序列堆栈图像（tiff 格式）。

6. 使用图像处理与分析软件 Fiji 对 F-肌动蛋白流动速度和聚合速率进行定量分析

注意：用于量化 F-肌动蛋白流动速度和肌动蛋白聚合速率的练习数据，请参见补充文件 3。

  1. 在 Fiji 中打开多通道时间序列堆栈图像。
  2. 选择 分析 > 设置标尺，并设置图像的像素尺寸。
  3. 在丝状伪足或片状伪足的 F-actin 束中，找到一个至少持续五个时间帧向后流动的肌动蛋白斑点。
  4. 选择 图像 > 变换 > 旋转，调整图像角度，使 F-actin 束方向朝上（图 3A）。
  5. 点击工具栏上的 矩形，绘制一个包含肌动蛋白斑点及 F-actin 束顶端的矩形框（图 3B，1 和 2）。
    注意：HaloTag-肌动蛋白斑点的信号较弱。此外，由于生长锥远端较近端更薄，Lifeact 在生长锥远端的信号也较弱且微弱（图 2B）。研究人员应增强信号以优化 F-actin 流动速度和聚合速率的定量分析（图 3B）。尽管 Lifeact 在生长锥近端的信号可能饱和，但这不会影响 F-actin 远端位置的确定（图 3E，黄线）。
  6. 选择 图像 > 复制，并输入五个时间帧（图 3B，3–5）。
  7. 选择 图像 > 堆栈 > 创建拼图，输入参数：列数为 5，行数为 1，缩放因子为 1。
  8. 点击 确定，图像拼图将显示在屏幕上。
  9. 选择 图像 > 颜色 > 拆分通道，将两个荧光通道分离。
  10. F-actin 流动速度的定量分析。
    1. 选择 分析 > 设置测量，勾选 面积 和 边界矩形。
    2. 点击工具栏上的 椭圆，在肌动蛋白斑点上绘制一个圆形（图 3C，1 和 2）。
    3. 选择 图像 > 叠加 > 添加选区，圆形将叠加在图像拼图上（图 3C，3 和 4）。
      注意：可在 编辑 > 选项 > 颜色 中更改叠加颜色。
    4. 对剩余的斑点重复叠加圆形操作（图 3C，5）。
      注意：为准确确定肌动蛋白斑点的中心位置，研究人员应在每个斑点上叠加圆形。
    5. 点击工具栏上的 直线，绘制一条连接各圆形中心的直线（图 3D，1 和 2）。
    6. 选择 分析 > 测量，结果将显示在屏幕上（图 3D，3）。
      注意：结果显示中的 高度 表示在观察期间肌动蛋白斑点的位移距离（图 3D，3）。
    7. 通过将位移距离除以观察时间，计算 F-actin 的流动速度。
  11. F-actin 聚合速率的定量分析。
    1. 绘制一条连接 F-actin 束顶端的直线（图 3E，1）。
    2. 选择 分析 > 测量，结果将显示在屏幕上（图 3E，2）。
      注意：结果显示中的 高度 表示在观察期间 F-actin 束的延伸长度（图 3E，2）。
    3. 通过将延伸长度除以观察时间，计算 F-actin 的延伸速率。
    4. 将 F-actin 流动速度与延伸速率相加，计算 F-actin 的聚合速率（图 3F）。

7. 用于牵引力显微镜和神经元培养的 PAA 凝胶的制备

  1. 用于牵引力显微镜的 PAA 凝胶制备（图 4）
    1. 将 0.5 mL 溶于去离子 H2O 的 NaOH（100 mM）移入直径为 27 mm 的玻璃底培养皿中，在室温（RT）下孵育 15 分钟。
    2. 向培养皿中的 NaOH 溶液加入 50 µL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTMS），通过轻柔吹打混匀溶液，并在室温下孵育 15 分钟。
    3. 用去离子 H2O 清洗玻璃底培养皿，然后干燥。
    4. 向经 APTMS 处理的玻璃底培养皿中加入 0.5 mL 溶于 PBS 的 0.5% 戊二醛溶液，室温下孵育 30 分钟。
    5. 用去离子 H2O 清洗玻璃底培养皿并干燥。
    6. 配制溶液：去离子 H2O（412 µL）、30%（w/v）丙烯酰胺溶液（63 µL）、2.5%（w/v）双丙烯酰胺溶液（6 µL）和羧基修饰微球（荧光微珠）溶液（20 µL）。
      注：在加入丙烯酰胺溶液前，需涡旋振荡荧光微珠溶液以分散聚集的微珠。
    7. 将上述溶液在真空腔中室温去气 30 分钟。
    8. 向该溶液中加入 1 µL 溶于去离子 H2O 的 10%（w/v）过硫酸铵（APS）和 1 µL N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED），通过轻柔吹打混匀。
    9. 将一块直径为 18 mm 的玻璃盖玻片置于 15 mL 离心管的管盖上。
    10. 立即将 25 µL 上述溶液滴加至盖玻片上，然后轻轻将倒置的玻璃底培养皿覆盖在盖玻片上。室温下静置 1 小时，使丙烯酰胺聚合。
    11. 向盖玻片上滴加去离子 H2O，用弯曲针尖的注射器针头将凝胶从盖玻片上剥离。
    12. 去除 H2O，并向凝胶中加入溶于 PBS 的 sulfo-SANPAH（1 mM）。
    13. 在无菌条件下，用紫外光照射凝胶 5 分钟。随后用 PBS 洗涤凝胶三次，每次 15 分钟。
  2. 采用微球压痕法测定凝胶刚性（图 5A）44。
    1. 将特定直径和密度的微球转移至凝胶表面，然后将其置于激光扫描共聚焦显微镜的样品台上。
    2. 聚焦于凝胶表面，记录 z 轴位置（图 5B）。
    3. 同样地，聚焦于微球底部，记录 z 轴位置（图 5C）。
    4. 通过凝胶表面与微球底部的 z 轴位置之差，计算压痕深度。
    5. 根据以下公式计算凝胶的杨氏模量 E：
      figure-protocol-1
      其中 f 为经浮力校正的微球重量，d 为凝胶的压痕深度，r 为微球半径，v 为泊松比（其值为 0.3，依据先前研究46确定）。
  3. 按照第 2 节所述，用 PDL 和层粘连蛋白对凝胶进行包被。
  4. 按照第 3 和第 4 节所述，分离 E16 小鼠胚胎，解离海马组织，并以每 1.0 × 106 个细胞转染 5 µg pEGFP-C1 的条件进行转染。将 2.0 × 105 个细胞接种至 PDL/层粘连蛋白包被的凝胶上。
    ​注：进行牵引力分析时，需对荧光标记的细胞进行显微成像，以确定生长锥面积。

8. 神经元生长锥的牵引力显微镜技术

  1. 在DIV3时，将培养基更换为0.5 mL预热的含2% B-27添加剂、谷氨酰胺（1 mM）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL）。将神经元维持 1 h 37 °C.
  2. 打开激光扫描共聚焦显微镜，并将载物台顶部培养箱设置为 37 °C.
    注意：本研究使用配备有63倍/1.2数值孔径水浸物镜的激光扫描共聚焦显微镜，以及图像采集与分析软件（见 材料清单).
  3. 将神经元置于玻璃底培养皿中，并放入预热的载物台式培养箱内。
  4. 设置图像采集参数如下：扫描尺寸，512 × 512像素；扫描范围，1.5-3倍放大；扫描速度，约每帧1秒；激光波长，561 nm（荧光微球的激发波长）和488 nm（增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的激发波长）；时间间隔，3秒；持续时间，50帧。
  5. 为观察生长锥形态，选择 EGFP 强表达的生长锥。
  6. 聚焦凝胶表面，采集延时图像（图6A 和 补充文件 4).
    注意：进行牵引力分析时，使用两个荧光通道（用于荧光微球和EGFP）和一个明场通道（建议采集微分干涉差（DIC）或相差图像）。
  7. 使用图像处理软件（例如 Fiji）生成单通道时间序列 RGB 图像堆栈，并将这些图像保存为 tiff 文件。
    注意：研究人员必须保存原始数据。
  8. 应用 100 µL 10% (w/v) 十二烷基硫酸钠（SDS）溶于蒸馏水2O，将玻璃底培养皿中的凝胶基质释放，使神经元脱离基质以松弛凝胶。将培养皿在37℃下孵育5分钟 37°C 以稳定温度。
    注意：未受力基质中微珠的图像用于在牵引力分析过程中参考微珠的原始位置图6C）。SDS溶液的施加会因培养箱中的温度变化以及细胞诱导的形变松弛而改变xyz位置。因此，研究人员需要校正焦平面以及x-y位置。
  9. 聚焦于凝胶表面，获取未受应变基底中微珠的图像（图6B).
  10. 生成未受应力基底中微珠的单通道RGB图像，并将该图像保存为tiff文件。
  11. 使用 Fiji 校正未受应变基底上微珠图像的 x-y 位置
    1. 在 Fiji 中，打开未受应变基底中的微珠图像以及荧光微珠的时间序列堆栈图像。
    2. 选择 图像 > 堆叠 > 工具 > 连接. 屏幕上将出现一个对话框（图7A, 1).
    3. 选择未受应变基底中的微珠图像以及荧光微珠的时间推移堆栈图像 图像1 和 图像2，分别（图7A, 2).
    4. 点击 好的. 将未受应变基底中的微珠图像添加到时间序列堆叠图像中（图7A, 3).
    5. 使用滚动条（图7B，1，红色框），显示该图像序列的第二帧（红色箭头）。
    6. 选择 插件 > StackReg (图7B，2）。屏幕上将出现一个对话框（图7B, 3).
    7. 选择 刚体 从下拉列表中图7B，3，红色框）并单击 OK. 随后开始进行 x-y 位置的校正。
    8. 使用滚动条显示经 x-y 位置校正后的图像堆栈的第一帧。
    9. 选择 图像 > 重复 (图7C，1）。屏幕上将出现一个对话框（图 7B, 2).
    10. 输入 1 在 范围，取消选择 复制堆栈 (图7C，2），然后单击 OK未拉伸基底中经 x-y 位置校正的微珠图像将显示在屏幕上（图7C，3）。将此图像另存为 TIFF 文件。
  12. 牵引力的量化
    注意：此处所述的牵引力分析方法使用 MATLAB 以及两个 MATLAB 工具箱——“图像处理工具箱”（Image Processing Toolbox）和“并行计算工具箱”（Parallel Computing Toolbox）。研究人员需在分析前安装上述工具箱。牵引力分析代码基于 MATLAB 2018a 版本开发，因此必须使用 MATLAB 2018a 或更高版本进行分析。牵引力分析所用算法此前已有描述。22.
    1. 从以下地址下载牵引力分析代码 TFM2021： 补充文件 5. 在 MATLAB 中打开 TFM 2021
    2. 开放 main.m 在 TFM2021 中运行它，屏幕上将出现一个图形用户界面（GUI）图8A).
    3. 点击 加载未受应变的基底图像 并选择在未拉伸基底中已进行 x-y 位置校正的微珠图像。
    4. 点击 加载荧光微球图像 并选择珠子的时间序列堆栈图像。
    5. 点击 加载明场图像 选择明场的延时堆栈图像。
    6. 点击 加载GFP图像 并选择EGFP的时间序列堆栈图像。
    7. 选择 GFP 从图形用户界面的下拉列表中图8A，红色方框。
    8. 点击 感兴趣区域 通过在图形用户界面（GUI）上显示的细胞图像中点击两个点，来指定包含生长锥在内的矩形感兴趣区域（ROI）图8B).
    9. 点击 保存 图形用户界面（GUI）上的按钮图8A，红色箭头）。选定的图像序列连同感兴趣区域（ROI）将保存为一个 .mat 文件（MATLAB 格式文件）。
    10. 点击 斑点检测屏幕上将出现一个对话框。
    11. 在对话框中输入一个数值（通常为 50-150），以确定微珠检测的阈值。点击 好的 开始计算。
    12. 完成计算后，单击 绘制轨迹 放大第 8.12.8 步中选定的区域，并将检测到的微珠显示为白色圆点（图8C, 1).
      注意：确认 bead 检测（白色点）是否与荧光微球重叠。bead 检测也可能检测到背景噪声。为减少此类外部干扰，可在 Spot detect 中调整阈值。此外，在步骤 8.12.13 中手动选择正确的点。
    13. 点击 选择磁珠，并在生长锥下方标出包含正确点的多边形区域。按下 输入 在键盘上操作时，多边形区域内的白色点将变为红色图8C, 2).
    14. 点击 估算力 在图形用户界面上，然后输入以下参数的数值：像素大小， µm/pixe杨氏模量（第7.2.5步计算得到的值）；泊松比，0.3。
    15. 执行 估算力 开始计算后，软件将自动以电子表格格式文件保存计算结果。
      注意：该电子表格显示了每一时间帧的x分量、y分量及力的大小图8D）。参考 补充文件 6 用于量化牵引力的练习数据。

结果

单颗粒成像法用于量化肌动蛋白聚合速率和分子离合器耦合效率
高水平的 Lifeact 表达可实现生长锥内 F-肌动蛋白的可视化；低水平的 HaloTag-肌动蛋白表达则可用于监测 F-肌动蛋白的向后流动（图3，补充文件2）。通过追踪肌动蛋白颗粒可测量 F-肌动蛋白流动速度（图3C，D）。由于 F-肌动蛋白向后流动与黏附基底之间的力学耦合会降低其流动速度，因此可通过速度估算分子离合器的耦合效率。此外，使用 Lifeact 标记 F-肌动蛋白有助于观察 F-肌动蛋白的延伸，并可用于量化肌动蛋白聚合速率（图3E，F）。

牵引力的定量分析
严格遵循此处所述的方法将揭示生长锥下方荧光微珠的运动（图6C，补充文件4）。F-肌动蛋白向基底的逆行流动产生牵引力，导致荧光微珠在生长锥下方向后移动。牵引力分析代码通过荧光微珠的位移估算牵引力，并将计算得到的牵引力表示为力矢量。牵引力的方向和大小由力矢量的x分量和y分量确定（图8C、D）。图8D中的红色框表示一个力矢量的x分量和y分量；图8C描绘了相应的生长锥。以x-y坐标系表示，该矢量相对于x轴指向-93.8°；此方向朝向生长锥的后部（图8C）。牵引力F的大小按如下公式计算：

figure-results-1

figure-results-2
图 1：生长锥产生牵引力及导向运动的分子机制。 净素-1（netrin-1）化学吸引梯度可诱导其受体 DCC 在轴突生长锥上发生不对称激活。这进一步激活 Rac1 和 Cdc42 及其下游激酶 Pak1。Rac1 和 Cdc42 促进（1）肌动蛋白聚合，而 Pak1 对 shootin1 进行磷酸化，增强 shootin1 介导的（2）离合器耦合（clutch coupling）。生长锥内肌动蛋白动力学和离合器耦合的不对称激活，增加了朝向净素-1 来源侧的（3）牵引力，从而产生驱动生长锥定向移动的驱动力。本文所述实验方案可用于定量分析生长锥导向过程中关键变量（1）–（3）。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-3
图2：在全开和缩小的光圈下观察到的神经元生长锥的荧光图像。该生长锥表达 Lifeact 和 HaloTag-actin。 (A) 高水平的 Lifeact 表达可实现对生长锥形态的可视化。另一方面，HaloTag-actin 的表达水平非常低，即使在光圈完全打开时信号仍较弱。B当光圈适当缩小后，背景信号减弱，生长锥中出现单个肌动蛋白斑点。比例尺： 5 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

figure-results-4
图3：使用图像处理与分析软件 Fiji 定量测定 F-肌动蛋白流动速度和肌动蛋白聚合速率的步骤。 （A）调整图像角度以进行分析。（1）找到并选择一个在 F-肌动蛋白束中流动的肌动蛋白斑点（箭头所示）。（2）选择 图像 > 变换 > 旋转。（3）设置角度，使 F-肌动蛋白束方向朝上。（4）图像的角度将被改变。（B）划定包含肌动蛋白斑点和 F-肌动蛋白束的区域。（1）点击工具栏上的 矩形。（2）在图像上划定一个区域。提高图像的亮度和对比度，以便清晰显示肌动蛋白斑点及 F-肌动蛋白束的末端。（3）选择 图像 > 复制。（4）输入显示肌动蛋白斑点在 F-肌动蛋白束中流动的五个时间帧。（5）选定的图像堆栈将显示在屏幕上。（C）在肌动蛋白斑点上叠加圆形。（1）点击工具栏上的 椭圆。（2）在肌动蛋白斑点上绘制一个圆形。（3）选择 图像 > 叠加 > 添加选区。（4）圆形被叠加。（5）在其余肌动蛋白斑点上重复叠加圆形操作。（D）测量五个时间帧期间肌动蛋白斑点的位移距离。（1）点击工具栏上的 直线。（2）绘制一条连接各圆心的直线。（3）选择 分析 > 测量。结果由参数 高度（红色框）表示，反映肌动蛋白斑点的位移距离。（E）测量五个时间帧期间 F-肌动蛋白突起长度的变化。（1）绘制一条连接 F-肌动蛋白突起末端的直线。（2）选择 分析 > 测量。结果（红色框）高度表示 F-肌动蛋白束的延伸长度。（F）肌动蛋白聚合速率由 F-肌动蛋白流动速度与延伸速率之和计算得出。 另见 补充文件2。补充文件3 可协助研究人员练习上述方法。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-5
图4：PAA凝胶制备步骤。 详细说明请参见步骤7.1。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-6
图5：PAA凝胶刚性的测定。（A）微球压痕法。当微球置于嵌有荧光微珠的PAA凝胶表面时，微球的重量会导致凝胶产生压痕。通过将微球底部的z轴位置减去PAA凝胶表面的z轴位置，可计算出压痕深度。（B、C）由微球压痕并含有荧光微珠的PAA凝胶的荧光图像。使用激光扫描共聚焦显微镜采集凝胶表面（B）和微球底部（C）的图像。在压痕区域的凝胶表面，荧光 微珠的信号不可见（B，圆圈）。然而，在微球底部可以观察到这些信号。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-7
图6：神经元生长锥的力图谱分析。（A-C）嵌入聚丙烯酰胺（PAA）凝胶中的微珠荧光图像以及用EGFP标记的神经元生长锥图像。A）采集延时图像后，通过加入SDS溶液将神经元从凝胶基底上释放，并采集未受应力基底中微珠的图像（B）。C）未受应力基底中微珠图像显示了微珠在原始位置（绿色）和位移后位置（红色）的分布。生长锥的EGFP信号以蓝色显示。右侧的时空图显示了在147秒内每隔3秒微珠的移动情况，箭头指示方框区域1和2中的微珠运动轨迹。区域2中的微珠为参考微珠。比例尺：A）、B）和C）左侧为2 µm，C）中图为1 µm。另见补充文件4。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-8
图7：使用Fiji校正未受应变基底中微珠图像x-y位置的步骤。（A）将未受应变基底中的微珠图像与荧光微珠的时间序列图像堆栈进行拼接。（1）选择 图像 > 图像堆栈 > 工具 > 拼接。（2）分别在 图像1 和 图像2 中选择未受应变基底中的微珠图像和荧光微珠的时间序列图像堆栈。点击 确定。（3）未受应变基底中的微珠图像将被添加到时间序列图像堆栈中。（B）校正荧光微珠图像的x-y位置。（1）使用滚动条（红色框）在图像堆栈中选择第二帧（红色箭头）。（2）选择 插件 > StackReg。（3）从下拉列表（红色框）中选择 刚体，然后点击 确定。x-y位置的校正将开始。（C）保存经过x-y位置校正的微珠图像。在选择经过x-y位置校正的图像堆栈的第一帧后，（1）选择 图像 > 复制。（2）在 范围 中输入 1，并取消选中 复制堆栈，然后点击 确定。（3）屏幕上将显示未受应变基底中经过x-y位置校正的微珠图像。将此图像保存为tiff文件。补充文件6可帮助研究人员练习上述方法。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-9
图8：使用开源牵引力分析代码对神经元生长锥下方的牵引力进行分析。（A）用于分析牵引力的图形用户界面（GUI）。可通过下拉列表和滑块（红框所示）确认在GUI中选定的时间序列图像。（B）选择包含生长锥的区域。（1）在GUI上点击ROI，然后在细胞图像上用鼠标光标指定两个点（箭头所示）。（2）细胞图像上将出现一个红色方框，两次点击确定该方框两个角的位置。（C）选择生长锥下方检测到的微珠（白色点）。（1）在GUI上点击选择微珠（Select beads），通过点击在图像上划定一个包含生长锥的多边形区域，然后按Enter键。（2）多边形区域内的白色点将变为红色。（D）计算得到的牵引力方向与大小结果。表格中的红色方框表示由牵引力分析估算出的力矢量的x分量和y分量。在右侧图中的x-y坐标系中，生长锥产生的力矢量相对于x轴指向-93.8°；该方向指向图（C）中生长锥的后侧。补充文件6可帮助研究人员练习上述方法。请点击此处查看本图的放大版本。

补充文件1：本研究中使用的溶液和培养基配方。 详细使用方法见正文。 请点击此处下载该文件。

补充文件 2：神经生长锥中 Lifeact 的荧光成像及 HaloTag-actin 的荧光散斑成像。 Lifeact（绿色）和 HaloTag-actin（洋红色）。图像每 3 秒采集一次，总时长为 147 秒。比例尺：2 µm。另见 图 3。请点击此处下载该文件。

补充文件3：F-肌动蛋白流动速度与肌动蛋白聚合速率定量分析的练习数据。 Lifeact（绿色）和HaloTag-肌动蛋白（品红色）的多通道时间序列图像堆栈。另请参见图3。请点击此处下载该文件。

补充文件4：检测神经元生长锥牵引力的力图视频。 微珠的原始位置（绿色）和位移后位置（红色）。生长锥中的EGFP信号以蓝色显示。图像每3秒采集一次，共147秒。比例尺：2 µm。另见图6。请点击此处下载该文件。

补充文件5：牵引力分析代码。 详细使用方法请参见步骤8.12。 请点击此处下载该文件。

补充文件6：牵引力定量分析练习数据。 未受应力基底中微珠的单通道RGB图像，以及生长锥下方荧光微珠、EGFP和明场的单通道延时RGB图像序列。另请参见图7和8。请点击此处下载该文件。

讨论

本研究中描述的实验方案使用了所有实验室、研究机构和大学中常规配备的市售材料和显微镜设备。因此，研究人员可以轻松地在其研究中采用本研究所述的单颗粒成像和牵引力显微镜技术。

斑点成像可用于分析肌动蛋白聚合和离合器偶联。此外，斑点成像还可用于监测与F-肌动蛋白逆行流相互作用的离合器分子（如shootin1和cortactin）的逆行流动。利用全内反射荧光显微镜（TIRF），也可监测细胞黏附分子L1-CAM的逆行流动23,41；L1-CAM表现出“抓握”和“滑脱”行为，这些行为反映了离合器偶联的效率23,41。尽管本研究采用TMR-HaloTag系统进行斑点成像，但其他荧光蛋白（如EGFP和单体红色荧光蛋白）也可用于此类分析16,18,20,23,24,27,39。实现肌动蛋白斑点可视化的关键在于荧光标记肌动蛋白的低表达水平以及最小区域的照明（图2）。在本实验方案中，Lifeact和HaloTag-肌动蛋白信号是依次采集的。由于肌动蛋白逆行流速度相对较慢（4.5 ± 0.1 µm/min）24，不同荧光通道的顺序图像采集（约1秒间隔）不会影响F-肌动蛋白逆行流和肌动蛋白聚合的分析。Lifeact是一种广泛使用的F-肌动蛋白标记物，但可能与肌动蛋白结合蛋白产生竞争47。更为重要的是，Lifeact可能改变肌动蛋白动力学，从而影响F-肌动蛋白结构和细胞形态47,48,49。

牵引力显微镜可用于检测驱动生长锥前进的作用力。通过将神经元嵌入细胞外基质中，研究者还可以在准三维环境中分析其所产生的力11。由于生长锥产生的牵引力较弱，高倍成像对于牵引力的精确定量至关重要7。尽管也有使用纳米柱或应力敏感型生物传感器等其他方法来测量牵引力50,51，但基于聚丙烯酰胺（PAA）凝胶的方法具有高度可调性，可通过改变丙烯酰胺和双丙烯酰胺的浓度来调节基底刚度41,44,52。在本实验方案中，PAA凝胶的终浓度为3.75%丙烯酰胺和0.03%双丙烯酰胺；其杨氏模量约为270 Pa22，该刚度处于脑组织弹性模量范围（100–10,000 Pa）之内53,54,55。由于PAA凝胶具有一定厚度（约100 µm），该方法在显微镜观察时限制了高倍物镜的使用。为获得高倍图像，研究者应使用激光扫描共聚焦显微镜的放大功能。

综上所述，当前的散斑成像与牵引力显微镜技术能够对力生成过程中的关键事件进行定量分析。这些信息对于深入理解生长锥前进与导向机制具有重要价值。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究部分由AMED（课题编号21gm0810011h0005，N.I. 和 Y.S.）、JSPS科研费（JP19H03223，N.I.）以及JSPS早年研究人员资助项目（JP19K16258，T.M.）、难治性疾病大阪医学研究基金会（T.M.）和NAIST下一代跨学科研究项目（Y.S.）提供支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5% 台盼蓝染色液Nacalai29853-34
3-氨基丙基三甲氧基硅烷Sigma281778-100ML
丙烯酰胺单体Nacalai00809-85
过硫酸铵Cytiva17-1311-1
Axio Observer Z1Zeiss431007-9902-000落射荧光显微镜（单点成像）
B-27 添加剂（50倍浓缩）Thermo Fisher Scientific17504-044
牛血清白蛋白SigmaA7906-10G
C-Apochromat 63x/1.2 W CorrZeiss421787-9970-799物镜（牵引力显微镜）
盖玻片（直径 18 mm）MatsunamiC018001
D-葡萄糖Nacalai16806-25
DNaseISigmaDN25-100MG
胎牛血清Thermo Fisher Scientific10270-106
Fiji开源软件包https://imagej.net/software/fiji/
FluoSpheres 羧基修饰微球 0.2 mm，红色（580/605），2% 固体Thermo Fisher ScientificF8810羧基修饰微球
玻璃底培养皿（直径 14 mm）MatsunamiD1130H
玻璃底培养皿（直径 27 mm）MatsunamiD1140H
戊二醛溶液SigmaG5882-10X10ML
HaloTag TMR 配体PromegaG8251
HBO103 W/2Osram4050300382128汞灯（单点成像）
图像处理工具箱MathWorkhttps://www.mathworks.com/products/image.html
小鼠 EHS 肿瘤来源层粘连蛋白溶液Wako120-05751
Leibovitz’s L-15 培养基Thermo Fisher Scientific11415064
L-谷氨酰胺Nacalai16919-42
LSM710ZeissN/A共聚焦激光显微镜（牵引力显微镜）
MATLAB2018aMathWorkhttps://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html
小鼠 C57BL/6Japan SLCN/A
小鼠神经元核转染试剂盒LonzaVPG-1001
N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）Nacalai33401-72
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺Nacalai22402-02
Neurobasal 培养基Thermo Fisher Scientific21103-049
Nucleofector IAmaxaAAD-1001电穿孔仪
ORCA Flash 4.0 V2HamamatsuC11440-22CUCMOS 相机（单点成像）
木瓜蛋白酶Nacalai26036-34
并行计算工具箱MathWorkhttps://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html
pEGFP-C1Clontech1528177
青霉素-链霉素（100倍浓缩）Nacalai Tesque26253-84
pFN21A-HaloTag-actin(Minegishi et al., 2018)N/A
磷酸盐缓冲液（PBS）pH 7.4（10倍浓缩）Thermo Fisher Scientific70011-044
Plan-Apochromat 100x/1.4 OilZeiss420790-9901-000物镜（单点成像）
pmNeonGreen-N1-Lifeact(Kastian et al., 2021)N/A
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐SigmaP6407-5MG
Sulfo-SAMPHOThermo Fisher Scientific22589
十二烷基硫酸钠Nacalai08933-05
氢氧化钠（NaOH）Nacalai31511-05
钢珠Sako tekkouN/A用于测定 PAA 凝胶刚性的微球。直径 0.6 mm，密度 7.87 g/cm3。
ZEN2009Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction图像采集软件（牵引力显微镜）
ZEN2012Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction图像采集软件（单点成像）

参考文献

  1. TessierLavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274, 1123-1133 (1996).
  2. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 001834(2010).
  3. Vitriol, E. A., Zheng, J. Q. Growth cone travel in space and time: the cellular ensemble of cytoskeleton, adhesion, and membrane. Neuron. 73 (6), 1068-1081 (2012).
  4. Cooper, J. A. Cell biology in neuroscience: mechanisms of cell migration in the nervous system. Journal of Cell Biology. 202, 725-734 (2013).
  5. Dupraz, S., et al. RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain. Current Biology. 29, 3874-3886 (2019).
  6. Suter, D. M., Miller, K. E. The emerging role of forces in axonal elongation. Progress in Neurobiology. 94, 91-101 (2011).
  7. Franze, K. Integrating chemistry and mechanics: the forces driving axon growth. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 61-83 (2020).
  8. Mitchison, T., Kirschner, M. Cytoskeletal dynamics and nerve growth. Neuron. 1, 761-772 (1988).
  9. Suter, D. M., Forscher, P. Substrate-cytoskeletal coupling as a mechanism for the regulation of growth cone motility and guidance. Journal of Neurobiology. 44, 97-113 (2000).
  10. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 332-343 (2009).
  11. Minegishi, T., et al. Shootin1b mediates a mechanical clutch to produce force for neuronal migration. Cell Reports. 25, 624-639 (2018).
  12. Minegishi, T., Inagaki, N. Forces to drive neuronal migration steps. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 863(2020).
  13. Forscher, P., Smith, S. J. Actions of cytochalasins on the organization of actin filaments and microtubules in a neuronal growth cone. Journal of Cell Biology. 107, 1505-1516 (1988).
  14. Suter, D. M., Forscher, P. An emerging link between cytoskeletal dynamics and cell adhesion molecules in growth cone guidance. Current Opinion in Neurobiology. 8, 106-116 (1998).
  15. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
  16. Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells. Current Biology. 8, 1227-1230 (1998).
  17. Katoh, K., Hammar, K., Smith, P. J., Oldenbourg, R. Birefringence imaging directly reveals architectural dynamics of filamentous actin in living growth cones. Molecular Biology of the Cell. 10, 197-210 (1999).
  18. Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 295, 1083-1086 (2002).
  19. Medeiros, N. A., Burnette, D. T., Forscher, P. Myosin II functions in actin-bundle turnover in neuronal growth cones. Nature Cell Biology. 8, 215-226 (2006).
  20. Shimada, T., et al. Shootin1 interacts with actin retrograde flow and L1-CAM to promote axon outgrowth. Journal of Cell Biology. 181, 817-829 (2008).
  21. He, M., Zhang, Z. H., Guan, C. B., Xia, D., Yuan, X. B. Leading tip drives soma translocation via forward F-actin flow during neuronal migration. Jounal of Neuroscience. 30, 10885-10898 (2010).
  22. Toriyama, M., Kozawa, S., Sakumura, Y., Inagaki, N. Conversion of a signal into forces for axon outgrowth through Pak1-mediated shootin1 phosphorylation. Current Biology. 23, 529-534 (2013).
  23. Abe, K., et al. Grip and slip of L1-CAM on adhesive substrates direct growth cone haptotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 2764-2769 (2018).
  24. Baba, K., et al. Gradient-reading and mechano-effector machinery for netrin-1-induced axon guidance. Elife. 7, 34593(2018).
  25. Nichol, R. I., Hagen, K. M., Lumbard, D. C., Dent, E. W., Gomez, T. M. Guidance of axons by local coupling of retrograde flow to point contact adhesions. Journal of Neuroscience. 36, 2267-2282 (2016).
  26. Shekarabi, M., et al. Deleted in colorectal cancer binding netrin-1 mediates cell substrate adhesion and recruits Cdc42, Rac1, Pak1, and N-WASP into an intracellular signaling complex that promotes growth cone expansion. Journal of Neuroscience. 25, 3132-3141 (2005).
  27. Kubo, Y., et al. Shootin1-cortactin interaction mediates signal-force transduction for axon outgrowth. Journal of Cell Biology. 210, 663-676 (2015).
  28. Huber, A. B., Kolodkin, A. L., Ginty, D. D., Cloutier, J. F. Signaling at the growth cone: ligand-receptor complexes and the control of axon growth and guidance. Annual Review of Neuroscience. 26, 509-563 (2003).
  29. Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, 001727(2011).
  30. Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128, 29-43 (2007).
  31. Tatavarty, V., Kim, E. J., Rodionov, V., Yu, J. Investigating sub-spine actin dynamics in rat hippocampal neurons with super-resolution optical imaging. PLoS One. 4, 7724(2009).
  32. Frost, N. A., Shroff, H., Kong, H., Betzig, E., Blanpied, T. A. Single-molecule discrimination of discrete perisynaptic and distributed sites of actin filament assembly within dendritic spines. Neuron. 67, 86-99 (2010).
  33. Chazeau, A., et al. Nanoscale segregation of actin nucleation and elongation factors determines dendritic spine protrusion. EMBO Journal. 33, 2745-2764 (2014).
  34. Garcia, M., et al. Two-tiered coupling between flowing actin and immobilized N-cadherin/catenin complexes in neuronal growth cones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 6997-7002 (2015).
  35. Swaminathan, V., et al. Actin retrograde flow actively aligns and orients ligand-engaged integrins in focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 10648-10653 (2017).
  36. Tsai, T. Y., et al. Efficient front-rear coupling in neutrophil chemotaxis by dynamic myosin II localization. Developmental Cell. 49, 189-205 (2019).
  37. Zhang, X. F., et al. Regulation of axon growth by myosin II-dependent mechanocatalysis of cofilin activity. Journal of Cell Biology. 218 (7), 2329-2349 (2019).
  38. Reversat, A., et al. Cellular locomotion using environmental topography. Nature. 582, 582-585 (2020).
  39. Katsuno, H., et al. Actin migration driven by directional assembly and disassembly of membrane-anchored actin filaments. Cell Reports. 12, 648-660 (2015).
  40. Urasaki, A., et al. Shootins mediate collective cell migration and organogenesis of the zebrafish posterior lateral line system. Scientific Reports. 9, 12156(2019).
  41. Abe, K., et al. Mechanosensitive axon outgrowth mediated by L1-laminin clutch interface. Biophysical Journal. 120, 3566-3576 (2021).
  42. Kastian, R. F., et al. Shootin1a-mediated actin-adhesion coupling generates force to trigger structural plasticity of dendritic spines. Cell Reports. 35, 109130(2021).
  43. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
  44. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322, 1687-1691 (2008).
  45. Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
  46. Li, Y., Hu, Z., Li, C. New method for measuring poisson's ratio in polymer gels. Journal of Applied Polymer Science. 50, 1107-1111 (1993).
  47. Belyy, A., Merino, F., Sitsel, O., Raunser, S. Structure of the Lifeact-F-actin complex. PLoS Biology. 18, 3000925(2020).
  48. Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9, 3241(2019).
  49. Kumari, A., Kesarwani, S., Javoor, M. G., Vinothkumar, K. R., Sirajuddin, M. Structural insights into actin filament recognition by commonly used cellular actin markers. EMBO Journal. 39, 104006(2020).
  50. du Roure, O., et al. Force mapping in epithelial cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2390-2395 (2005).
  51. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466, 263-266 (2010).
  52. Koch, D., Rosoff, W. J., Jiang, J., Geller, H. M., Urbach, J. S. Strength in the periphery: growth cone biomechanics and substrate rigidity response in peripheral and central nervous system neurons. Biophysical Journal. 102 (3), 452-460 (2012).
  53. Barnes, J. M., Przybyla, L., Weaver, V. M. Tissue mechanics regulate brain development, homeostasis and disease. Journal of Cell Science. 130, 71-82 (2017).
  54. Moore, S. W., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Stretchy proteins on stretchy substrates: the important elements of integrin-mediated rigidity sensing. Developmental Cell. 19, 194-206 (2010).
  55. Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews Neuroscience. 13, 867-878 (2012).

重印与许可

标签

F-肌动蛋白逆行流单点成像牵引力显微镜神经元迁移肌动蛋白聚合共聚焦显微镜
生长锥前进过程中的肌动蛋白动力学、黏着耦合与牵引力分析
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。