方法文章

生长锥前进过程中的肌动蛋白动力学、黏着耦合与牵引力分析

DOI：

10.3791/63227

⸱

2021年10月21日

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1Laboratory of Systems Neurobiology and Medicine, Division of Biological Science, Nara Institute of Science and Technology, 2Laboratory of Data-Driven Biology, Division of Biological Science, Nara Institute of Science and Technology

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了前进，生长锥必须对外部环境施加牵引力。牵引力的产生依赖于肌动蛋白动态和离合器耦合。本研究描述了分析生长锥前进过程中肌动蛋白动态、离合器耦合以及牵引力的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了建立功能性神经网络，神经元必须迁移到其适当的位置，然后向靶细胞延伸轴突。这些过程依赖于位于神经突末端的生长锥的前进。轴突生长锥通过感知局部微环境并调节细胞骨架动力学以及肌动蛋白-黏附耦合（离合器耦合）来产生驱动力。数十年的研究已鉴定了调控神经元迁移和轴突导向的引导分子、其受体及下游信号级联；然而，驱动生长锥前进和导航所需产生作用力的分子机制才刚刚开始被阐明。在神经元生长锥的前沿，肌动蛋白丝经历向后流动，这一过程由肌动蛋白聚合和肌球蛋白收缩提供动力。F-肌动蛋白的向后流动与黏附基质之间的离合器耦合可产生推动生长锥前进的牵引力。本研究描述了一种通过单点成像技术监测F-肌动蛋白向后流动的详细方案。重要的是，当该技术与F-肌动蛋白标记物Lifeact联用时，能够量化：1）F-肌动蛋白的聚合速率；以及2）F-肌动蛋白向后流动与黏附基质之间离合器耦合的效率。这两项均为生成生长锥前进和导航所需作用力的关键变量。此外，本研究还描述了牵引力显微镜技术的详细操作流程，可用于量化：3）生长锥产生的牵引力。因此，通过结合 单点成像与牵引力显微镜的分析，研究人员可监测生长锥前进和导航背后的分子力学机制。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在发育中的脊椎动物大脑中，神经元会经历高度有序的迁移，并将轴突投射至适当的突触伙伴，以建立功能性的神经元网络1,2,3。位于神经突末端的生长锥是具有感觉和运动功能的结构，可决定神经元迁移和轴突发育的速度与方向3,4,5。由于神经元处于高度密集的微环境中，生长锥必须对其周围环境施加作用力才能向前移动6,7。为了理解神经元迁移和轴突导向的分子机制，对生长锥前进过程中分子力学机制的分析至关重要。

数十年的研究表明，驱动生长锥前进的牵引力是通过“离合器”机制产生的；该机制不仅存在于轴突生长锥中，也存在于迁移神经元的前导突起生长锥中8,9,10,11,12。具体而言，生长锥中的肌动蛋白丝（F-actins）在前沿处发生聚合，并在近端区域解聚，从而推动前沿膜向外延伸13,14,15。由此产生的力与肌球蛋白收缩共同作用，引发F-actin向后运动，称为逆行流（retrograde flow）7,11,16,17,18,19,20,21。离合器分子和细胞黏附分子介导了F-actin逆行流与黏附基底之间的机械耦合，并将F-actin流动的力传递至基底，从而产生推动生长锥前进的牵引力7,8,9,11,12,22。同时，肌动蛋白与基底的耦合降低了F-actin的流动速度，并将肌动蛋白的聚合转化为推动前沿膜突出的力9,10。

轴突生长锥能够感知局部化学信号，并将其转化为驱动生长锥定向迁移的驱动力3,23,24,25。例如，轴突导向分子netrin-1可激活其受体结肠癌缺失蛋白（DCC），进而激活Rho鸟苷三磷酸（GTP）结合蛋白细胞分裂控制蛋白42（Cdc42）和Ras相关C3肉毒毒素底物1（Rac1），以及它们下游的激酶p21活化激酶1（Pak1）26。Cdc42和Rac1促进1）肌动蛋白聚合，而Pak1则磷酸化一种“离合器”分子shootin122,26。shootin1通过肌动蛋白结合蛋白cortactin与F-肌动蛋白逆行流相互作用27，同时也与L1细胞黏附分子（L1-CAM）相互作用20,24。shootin1的磷酸化可增强其与cortactin和L1-CAM的结合亲和力，并加强shootin1介导的2）离合器耦合效应24,27。在生长锥内，肌动蛋白聚合和离合器耦合的不对称激活增加了朝向netrin-1来源一侧的3）牵引力，从而产生驱动生长锥转向的定向驱动力（图1）24。过去几十年中，关于神经元迁移和轴突导向的深入研究加深了人们对导向分子、其受体以及相关下游信号通路的理解2,10,28,29,30。然而，介导生长锥前进力生成的分子机制才刚刚开始被揭示；这可能归因于用于力学-生物学分析的实验方案应用尚有限。

本研究介绍了一种通过单点成像技术监测F-肌动蛋白逆行流动的详细实验方案16,18使用超分辨率显微镜、转盘共聚焦显微镜和全内反射荧光（TIRF）显微镜已广泛用于监测F-肌动蛋白的向后流动25,31,32,33,34,35,36,37,38然而，本研究中的方案采用标准的落射荧光显微镜，因此可轻松推广应用11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42与Lifeact标记F-actin结合时43, 单点斑成像技术可实现对肌动蛋白聚合速率以及F-肌动蛋白向后流动与黏附基底之间耦合效率的量化分析39,42本研究进一步描述了一种使用嵌有荧光微球的聚丙烯酰胺（PAA）凝胶进行牵引力显微镜的详细实验方案11,22,23,24,27,39,41,42,44该方法通过监测力致微珠移动来检测并量化生长锥下方的牵引力44,45提供了一套开源的牵引力分析代码，并详细解释了在生长锥迁移过程中量化牵引力的方法。结合单颗粒成像与牵引力显微镜技术，将有助于深入理解生长锥迁移与导向的分子力学机制。这些技术同样适用于分析树突棘增大过程中的分子力学机制，而树突棘的增大已被证实与学习和记忆密切相关。42.

方案

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所有使用实验动物的实验均在奈良先端科学技术大学院大学机构动物护理与使用委员会的监督下进行。研究人员应遵循其所属机构及国家动物管理委员会制定的实验动物护理与使用指南。

1. 溶液与培养基的制备

  1. 按照补充文件1中总结的方案配制溶液和培养基

2. 多聚-D-赖氨酸（PDL）/层粘连蛋白包被基质的制备

  1. 用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）溶解的 100 µg/mL 多聚赖氨酸（PDL）包被直径为 14 mm 的玻璃底培养皿，在 37 °C 湿润培养箱中孵育过夜。
    注意：此步骤后切勿使玻璃表面干燥
  2. 移除 PDL 溶液，加入 1 mL PBS，吹打洗涤玻璃表面，每次 10 秒，重复三次。
  3. 用 PBS 溶解的 5 µg/mL 层粘连蛋白（laminin）包被培养皿，在 37 °C 湿润培养箱中孵育过夜。
  4. 移除层粘连蛋白溶液，加入 1 mL PBS，吹打洗涤玻璃表面，每次 10 秒，重复三次。
  5. 移除 PBS，并在玻璃表面加入 0.5 mL 神经基础培养基（neurobasal medium）。将培养皿置于 37 °C 湿润培养箱中保存。
    ​注意：PDL/层粘连蛋白包被的培养皿可在 37 °C 湿润培养箱中保存 2–3 天。

3. 海马体的解剖与分离

  1. 通过颈椎脱位法处死一只怀孕小鼠。
    注意：本研究使用商业来源的小鼠（见材料表）。研究人员应使用在无菌环境中繁殖并人道饲养的小鼠。
  2. 取出胚胎发育第16天（E16）的小鼠胚胎，并将其置于冰上。
  3. 在超净工作台中，用剪刀分离出脑组织，并将其放入含有10 mL冰冷解剖液的无菌10 cm培养皿中。
  4. 在解剖体视显微镜下，小心剥离大脑半球的脑膜，然后使用镊子分离出海马体。
  5. 将海马体转移至15 mL离心管中，加入5 mL冰冷消化液。将海马体在37 °C水浴中孵育20分钟。
  6. 移除消化液，并加入3 mL解剖液。
  7. 用巴氏吸管轻轻吹打海马体四次。
  8. 将海马体在37 °C水浴中继续孵育20分钟。
  9. 将细胞悬液转移至50 mL离心管中。向未完全解离的组织中加入3 mL新的解剖液。
  10. 重复步骤3.7–3.9，直至海马体完全解离。
  11. 用巴氏吸管轻轻旋转并吸取细胞悬液中漂浮的DNA团块。在4 °C条件下，以180 × g离心20分钟。
    注意：受损细胞释放的DNA会干扰离心过程。如果神经元仍存在于上清液中，应在小心去除DNA后再次离心细胞悬液。
  12. 将含有10%胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL）的Neurobasal培养基置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中平衡。

4. 转染与培养神经元

  1. 移除上清液，向50 mL离心管中加入5 mL预冷的PBS。用移液器轻柔吹打，重悬细胞沉淀。
  2. 将10 µL细胞悬液转移至微量离心管中，加入10 µL 0.5%台盼蓝溶液，然后用血细胞计数板对细胞数量进行计数。
  3. 将50 mL管中的细胞悬液在180 x g条件下离心 g 在 4 °C 下持续 20 分钟。
  4. 同时，按每1 x 10⁶细胞分装转染用溶液，每份含pFN21A-HaloTag-actin 1 µg和pmNeonGreen-N1-Lifeact 3 µg6 细胞转入微量离心管中。
  5. 离心后，弃去上清液，向50 mL离心管中加入100 µL电穿孔缓冲液（由转染试剂盒提供）。用移液器重悬细胞沉淀。
  6. 将细胞悬液与分装的DNA溶液混合，然后将混合物转移至电转杯（由转染试剂盒提供）。
    注意：由于气泡会干扰电穿孔，需从细胞悬液中去除气泡。
  7. 将比色皿插入电穿孔仪中（材料表），并使用程序 O-005 进行电穿孔。
  8. 立即向比色皿中加入1 mL预热并平衡好的含10% FBS、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL）的Neurobasal培养基。
  9. 使用塑料移液管（转染试剂盒提供）将细胞悬液转移至15 mL离心管中。
  10. 将10 µL细胞悬液转移至微量离心管中，加入10 µL 0.5%台盼蓝溶液，然后用血细胞计数板对细胞数量进行计数。
  11. 从培养箱中取出经PDL/层粘连蛋白包被的玻璃底培养皿，移除神经基础培养基。
  12. 移液0.5 mL含有2.0 × 105 每皿细胞，在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育2 3 小时.
  13. 更换为含有 2% B-27 补充剂、谷氨酰胺（1 mM）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL）的 0.5 mL Neurobasal 培养基。将神经元置于 37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中培养 3 天。2.

5. 神经元生长锥的单点成像

  1. 第几天 体外 （培养第3天），用四甲基罗丹明（TMR）配体以1:2000的稀释比例溶于培养基中处理神经元。将神经元在37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。2.
  2. 用预热的PBS洗涤TMR配体三次。
  3. 吸除 PBS，加入 0.5 mL 预热的含 2% B-27 补充剂、谷氨酰胺（1 mM）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL）的 Leibovitz's L-15 培养基。
  4. 将神经元在37 °C下维持1小时。
  5. 打开落射荧光显微镜，并将载物台培养箱设置为37 °C。
    注意：本方案使用配备互补金属氧化物半导体相机、100x/1.40 NA 油浸物镜、汞灯及图像采集软件的落射荧光显微镜（参见 材料表也可使用其他具有同等规格的落射荧光显微镜进行此分析。
  6. 将经TMR配体处理的神经元置于玻璃底培养皿中，并放入预热的台式培养箱内。
  7. 设置图像采集参数如下：曝光时间，Lifeact 和 HaloTag-actin 荧光通道均为 500 ms；像素合并（binning），1 × 1（每像素 0.065 µm × 0.065 µm）；时间间隔，3 s；持续时间，50 帧。
  8. 选择一个强烈表达 Lifeact 且微弱表达 HaloTag-actin 的生长锥。
    注意：Lifeact 的表达应足够强，以可视化生长锥形态；HaloTag-肌动蛋白的表达应较弱，弱至无法被检测到图2A荧光蛋白的表达水平可通过调整转染时的DNA用量来调节。
  9. 关闭虹膜光圈，使照明区域最小化，仅包含生长锥图2B).
    注意：照射最小面积可减少背景信号，提高荧光信噪比（S/N），从而实现对肌动蛋白斑点的检测图2B为了进一步提高信噪比，建议直接照射生长锥，而不使用中性密度滤光片减弱光线。
  10. 获取延时图像（补充文件 2）。保存为多通道延时序列图像（TIFF 格式）。

6. 使用图像处理与分析软件 Fiji 对 F-肌动蛋白流动速度和聚合速率进行定量分析

注意：有关F-肌动蛋白流动速度和肌动蛋白聚合速率的定量练习数据，请参见补充文件3。

  1. 在 Fiji 中打开多通道延时堆栈图像。
  2. 选择 分析 > 设置尺度，并设定图像的像素大小。
  3. 在丝状伪足或片状伪足的 F-肌动蛋白束中，找到一个至少持续五个时间帧向后流动的肌动蛋白斑点。
  4. 选择 图像 > 变换 > 旋转，调整图像角度，使 F-肌动蛋白束方向朝上（图 3A）。
  5. 点击工具栏上的 矩形，绘制一个包含肌动蛋白斑点和 F-肌动蛋白束尖端的矩形框（图 3B，1 和 2）。
    注意：HaloTag-肌动蛋白斑点的信号较弱。此外，生长锥远端的 Lifeact 信号也较弱且微弱（图 2B），因为生长锥远端比近端更薄。研究者应增强信号，以优化 F-肌动蛋白流动速度和聚合速率的定量分析（图 3B）。尽管生长锥近端的 Lifeact 信号可能饱和，但这不会影响 F-肌动蛋白远端末端的确定（图 3E，黄色线）。
  6. 选择 图像 > 复制，并输入五个时间帧（图 3B，3-5）。
  7. 选择 图像 > 堆栈 > 制作拼贴图，输入参数：列数为 5，行数为 1，缩放因子为 1。
  8. 点击 确定，图像拼贴图将显示在屏幕上。
  9. 选择 图像 > 颜色 > 拆分通道，将两个荧光通道分离。
  10. F-肌动蛋白流动速度的定量分析。
    1. 选择 分析 > 设置测量值，并选择 面积 和 边界矩形。
    2. 点击工具栏上的 椭圆，在肌动蛋白斑点上绘制一个圆形（图 3C，1 和 2）。
    3. 选择 图像 > 叠加 > 添加选区，圆形将叠加在图像拼贴图上（图 3C，3 和 4）。
      注意：可在 编辑 > 选项 > 颜色 中更改叠加颜色。
    4. 对剩余的斑点重复叠加圆形操作（图 3C，5）。
      注意：为准确确定肌动蛋白斑点的中心，研究者应在斑点上叠加圆形。
    5. 点击工具栏上的 直线，绘制一条连接各圆形中心的直线（图 3D，1 和 2）。
    6. 选择 分析 > 测量，结果将显示在屏幕上（图 3D，3）。
      注意：结果显示中的 高度 表示在观察期间肌动蛋白斑点的位移距离（图 3D，3）。
    7. 通过将位移距离除以观察时间，计算 F-肌动蛋白流动速度。
  11. F-肌动蛋白聚合速率的定量分析。
    1. 绘制一条连接 F-肌动蛋白束尖端的直线（图 3E，1）。
    2. 选择 分析 > 测量，结果将显示在屏幕上（图 3E，2）。
      注意：结果显示中的 高度 表示在观察期间 F-肌动蛋白束的延伸长度（图 3E，2）。
    3. 通过将延伸长度除以观察时间，计算 F-肌动蛋白延伸速率。
    4. 将 F-肌动蛋白流动速度与延伸速率相加，计算 F-肌动蛋白聚合速率（图 3F）。

7. 用于牵引力显微镜和神经元培养的PAA凝胶制备

  1. 用于牵引力显微镜的聚丙烯酰胺（PAA）凝胶制备（图4）
    1. 将0.5 mL溶于去离子H2O中的NaOH（100 mM）加入直径为27 mm的玻璃底培养皿中，在室温（RT）下孵育15分钟。
    2. 向培养皿中的NaOH溶液中加入50 µL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTMS），通过轻柔吹打混匀溶液，并在室温下孵育15分钟。
    3. 用去离子H2O清洗玻璃底培养皿并干燥。
    4. 将0.5 mL溶于PBS中的0.5%戊二醛溶液加入经APTMS处理的玻璃底培养皿中，在室温下孵育30分钟。
    5. 用去离子H2O清洗玻璃底培养皿并干燥。
    6. 配制溶液：去离子H2O（412 µL）、30%（w/v）丙烯酰胺溶液（63 µL）、2.5%（w/v）双丙烯酰胺溶液（6 µL）和羧基修饰微球（荧光微珠）溶液（20 µL）。
      注：在将荧光微珠溶液加入丙烯酰胺溶液前，需涡旋振荡以分散聚集的微珠。
    7. 将上述溶液置于真空腔中，在室温下脱气30分钟。
    8. 向该溶液中加入1 µL溶于去离子H2O的10%（w/v）过硫酸铵（APS）和1 µL N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED），并通过轻柔吹打混匀。
    9. 将一片直径为18 mm的玻璃盖玻片放置于15 mL离心管的管盖上。
    10. 立即向盖玻片上加入25 µL上述溶液，然后轻轻将倒置的玻璃底培养皿覆盖在盖玻片上，在室温下使丙烯酰胺聚合1小时。
    11. 向盖玻片上滴加去离子H2O，使用弯头针头将盖玻片从凝胶表面剥离。
    12. 去除H2O，并向凝胶中加入溶于PBS的磺基-SANPAH（1 mM）。
    13. 在无菌条件下，用紫外光照射凝胶5分钟。随后用PBS洗涤凝胶三次，每次15分钟。
  2. 采用微球压痕法测定凝胶刚度（图5A）44。
    1. 将特定直径和密度的微球转移至凝胶表面，并将其置于激光共聚焦显微镜的样品台上。
    2. 聚焦于凝胶表面，记录z轴位置（图5B）。
    3. 同样地，聚焦于微球底部，记录z轴位置（图5C）。
    4. 通过凝胶表面与微球底部z轴位置之差，计算压痕深度。
    5. 根据以下公式计算凝胶的杨氏模量E：
      弹性模量方程，压痕测试中杨氏模量的公式。
      其中f为经浮力校正后的微球重量，d为凝胶的压痕深度，r为微球半径，v为泊松比（其值为0.3，依据先前研究确定46）。
  3. 按照第2节所述方法，用PDL和层粘连蛋白包被凝胶。
  4. 按照第3和第4节所述方法，分离E16小鼠胚胎，解离海马组织，并以每1.0 × 106个细胞转染5 µg pEGFP-C1。将2.0 × 105个细胞接种于PDL/层粘连蛋白包被的凝胶上。
    ​注：进行牵引力分析时，需对荧光标记的细胞进行显微成像，以确定生长锥面积。

8. 神经元生长锥的牵引力显微镜技术

  1. 在DIV3时，将培养基更换为0.5 mL预热的Leibovitz's L-15培养基，其中含有2% B-27添加剂、谷氨酰胺（1 mM）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL）。将神经元在37 °C下维持1小时。
  2. 开启激光扫描共聚焦显微镜，并将载物台顶部培养箱设置为37 °C。
    注：本研究使用的激光扫描共聚焦显微镜配备有63x/1.2 NA水浸物镜以及图像采集与分析软件（见材料表）。
  3. 将含有神经元的玻璃底培养皿置于预热的载物台顶部培养箱中。
  4. 设置图像采集参数如下：扫描尺寸为512 × 512像素；扫描区域为1.5–3倍放大；扫描速度约为每帧1秒；激光波长为561 nm（荧光微珠的激发波长）和488 nm（增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的激发波长）；时间间隔为3秒；持续时间为50帧。
  5. 为观察生长锥形态，选择一个EGFP表达强烈的生长锥。
  6. 聚焦于凝胶表面，并采集延时图像（图6A和补充文件4）。
    注：进行牵引力分析时，应使用两个荧光通道（分别用于荧光微珠和EGFP）以及一个明场通道（推荐采集微分干涉差（DIC）或相差图像）。
  7. 使用图像处理软件（例如Fiji）生成单通道延时RGB图像堆栈，并将这些图像保存为tiff文件。
    注：研究人员必须同时保存原始数据。
  8. 向玻璃底培养皿中加入100 µL 10%（w/v）溶于蒸馏H2O的十二烷基硫酸钠（SDS），以通过使神经元从基质上脱离来松弛凝胶基质。在37°C孵育5分钟以稳定温度。
    注：未受应力基质中微珠的图像将用于牵引力分析过程中微珠原始位置的参考（图6C）。SDS溶液的应用会因培养箱内的温度变化以及细胞诱导形变的松弛而导致xyz位置发生变化。因此，研究人员需要校正焦平面以及x-y位置。
  9. 聚焦于凝胶表面，并采集未受应力基质中微珠的图像（图6B）。
  10. 生成未受应力基质中微珠的单通道RGB图像，并将该图像保存为tiff文件。
  11. 使用Fiji校正未受应力基质中微珠图像的x-y位置
    1. 在Fiji中打开未受应力基质中的微珠图像和荧光微珠的延时堆栈图像。
    2. 选择图像 > 堆栈 > 工具 > 拼接，屏幕上将出现一个对话框（图7A，1）。
    3. 分别在图像1和图像2中选择未受应力基质中的微珠图像和荧光微珠的延时堆栈图像（图7A，2）。
    4. 点击确定，未受应力基质中的微珠图像将被添加到延时堆栈图像中（图7A，3）。
    5. 使用滚动条（图7B，1，红色框）显示堆栈图像的第二帧（红色箭头）。
    6. 选择插件 > StackReg（图7B，2），屏幕上将出现一个对话框（图7B，3）。
    7. 从下拉列表中选择刚体（图7B，3，红色框），然后点击确定，开始进行x-y位置校正。
    8. 使用滚动条显示x-y位置校正后的堆栈图像的第一帧。
    9. 选择图像 > 复制（图7C，1），屏幕上将出现一个对话框（图7B，2）。
    10. 在范围中输入1，取消选中复制堆栈（图7C，2），然后点击确定。屏幕上将显示未受应力基质中经x-y位置校正后的微珠图像（图7C，3）。将此图像保存为tiff文件。
  12. 牵引力的量化
    注：此处描述的牵引力分析方法使用MATLAB以及两个MATLAB工具箱：“图像处理工具箱”和“并行计算工具箱”。研究人员需在分析前安装这些工具箱。牵引力分析代码基于MATLAB 2018a版本开发，因此必须使用MATLAB 2018a或更高版本进行分析。牵引力分析所用算法此前已有描述22。
    1. 从补充文件5下载牵引力分析代码TFM2021。在MATLAB中打开TFM2021。
    2. 在TFM2021中打开main.m并运行。屏幕上将出现图形用户界面（GUI）（图8A）。
    3. 点击加载未受应力基质图像，并选择经x-y位置校正的未受应力基质中的微珠图像。
    4. 点击加载荧光微珠图像，并选择微珠的延时堆栈图像。
    5. 点击加载明场图像，并选择明场的延时堆栈图像。
    6. 点击加载GFP图像，并选择EGFP的延时堆栈图像。
    7. 在GUI的下拉列表中选择GFP（图8A，红框）。
    8. 点击ROI，通过在GUI显示的细胞图像上点击两个点，指定包含生长锥的矩形感兴趣区域（ROI）（图8B）。
    9. 点击GUI上的保存按钮（图8A，红色箭头）。所选的堆栈图像连同ROI将被保存为.mat文件（MATLAB格式文件）。
    10. 点击斑点检测，屏幕上将出现一个对话框。
    11. 在对话框中输入一个数值（通常为50–150），以确定微珠检测的阈值。点击确定开始计算。
    12. 计算完成后，点击绘制轨迹，放大第8.12.8步选定的区域，并将检测到的微珠显示为白色圆点（图8C，1）。
      注：确认微珠检测结果（白色圆点）是否与荧光微珠重叠。微珠检测可能同时捕获背景噪声。为减少此类外部干扰，请在“斑点检测”中调整阈值。此外，在第8.12.13步中手动选择正确的圆点。
    13. 点击选择微珠，并在生长锥下方划定一个包含正确圆点的多边形区域。按键盘上的回车键。多边形区域内的白色圆点将变为红色（图8C，2）。
    14. 在GUI上点击估算力，然后输入以下参数值：像素大小（µm/像素）；杨氏模量（在步骤7.2.5中计算得到的值）；泊松比，0.3。
    15. 执行估算力以启动计算。软件将自动将计算结果保存为电子表格格式文件。
      注：电子表格显示每一时间帧的x分量、y分量及力的大小（图8D）。参见补充文件6获取用于牵引力量化的练习数据。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单点成像法量化肌动蛋白聚合速率和离合器耦合效率
高水平的 Lifeact 表达可实现生长锥内 F-肌动蛋白的可视化；低水平的 HaloTag-肌动蛋白表达则可用于监测 F-肌动蛋白的逆行流动（图3，补充文件2）。通过追踪肌动蛋白斑点，可测量 F-肌动蛋白的流动速度（图3C，D）。由于 F-肌动蛋白逆行流动与黏附基质之间的机械耦合会降低 F-肌动蛋白的流动速度，因此可通过速度估算离合器耦合效率。此外，使用 Lifeact 对 F-肌动蛋白进行标记有助于观察 F-肌动蛋白的延伸情况，可用于量化肌动蛋白聚合速率（图3E，F）。

牵引力的定量分析
严格遵循此处介绍的方法将揭示生长锥下方荧光微珠的运动情况（图6C，补充文件4）。F-肌动蛋白向基底的逆行流动产生牵引力，导致荧光微珠在生长锥下方向后移动。牵引力分析程序通过荧光微珠的位移估算牵引力，并将计算得到的牵引力表示为一个力矢量。牵引力的方向和大小由该力矢量的x分量和y分量确定（图8C，D）。图8D中的红色框表示一个力矢量的x分量和y分量；图8C描绘了对应的生长锥。以x-y坐标系表示，该矢量相对于x轴指向-93.8°方向；此取向指向生长锥的后方（图8C）。牵引力的大小F按如下公式计算：

静力平衡方程，F=√(x²+y²)，矢量大小公式，数学示意图。

Netrin-1轴突生长、肌动蛋白聚合机制示意图；Rac1与Cdc42信号通路。
图1：生长锥产生牵引力及导向运动的分子机制。 Netrin-1化学吸引梯度可诱导轴突生长锥上其受体DCC发生不对称激活，进而激活Rac1和Cdc42及其下游激酶Pak1。Rac1和Cdc42促进（1）肌动蛋白聚合，而Pak1磷酸化shootin1，增强shootin1介导的（2）离合器耦合（clutch coupling）。生长锥内肌动蛋白动力学与离合器耦合的不对称激活，增加了朝向Netrin-1来源一侧的（3）牵引力，从而产生驱动生长锥定向移动的驱动力。本文所介绍的实验方案可用于定量分析生长锥导向过程中的上述关键变量（1）–（3）。请点击此处查看该图的高清版本。

不同光圈设置下的细胞成像比较；Lifeact、HaloTag-actin标记的荧光。
图2：在光圈全开和收窄条件下神经元生长锥的荧光图像。该生长锥表达Lifeact和HaloTag-actin。（A）高表达的Lifeact可清晰显示生长锥的形态。而HaloTag-actin的表达水平非常低，在光圈全开时信号微弱。（B）当适当收窄光圈时，背景信号减弱，生长锥内单个肌动蛋白斑点变得可见。比例尺：5 µm。请点击此处查看此图的放大版本。

肌动蛋白动态的荧光显微镜分析；图像处理与测量步骤示意图。
图3：使用图像处理与分析软件Fiji量化F-肌动蛋白流动速度和肌动蛋白聚合速率的步骤。（A）调整图像角度以进行分析。（1）找到并选择一个在F-肌动蛋白束中流动的肌动蛋白斑点（箭头所示）。（2）选择 图像 > 变换 > 旋转。（3）设置角度，使F-肌动蛋白束方向朝上。（4）图像的角度将被改变。（B）划定包含肌动蛋白斑点和F-肌动蛋白束的区域。（1）点击工具栏上的 矩形 工具。（2）在图像上划定一个区域。提高图像的亮度和对比度，以便清晰显示肌动蛋白斑点和F-肌动蛋白束的尖端。（3）选择 图像 > 复制。（4）输入显示肌动蛋白斑点在F-肌动蛋白束中流动的五个时间帧。（5）所选的图像堆栈将显示在屏幕上。（C）在肌动蛋白斑点上叠加圆形。（1）点击工具栏上的 椭圆 工具。（2）在肌动蛋白斑点上绘制一个圆形。（3）选择 图像 > 叠加 > 添加选区。（4）圆形被叠加到图像上。（5）在其余的肌动蛋白斑点上重复叠加圆形操作。（D）测量五个时间帧内肌动蛋白斑点的位移距离。（1）点击工具栏上的 直线 工具。（2）绘制一条连接各圆形中心的直线。（3）选择 分析 > 测量。结果由参数 高度（红色框）表示，反映肌动蛋白斑点的位移距离。（E）测量五个时间帧内F-肌动蛋白突起长度的变化。（1）绘制一条连接F-肌动蛋白突起尖端的直线。（2）选择 分析 > 测量。结果（红色框）高度 表示F-肌动蛋白束的延伸长度。（F）肌动蛋白聚合速率由F-肌动蛋白流动速度与延伸速率之和计算得出。另见 补充文件2。补充文件3 可帮助研究人员练习上述方法。请点击此处查看此图的放大版本。

丙烯酰胺凝胶表面图案化过程；化学步骤、聚合及紫外光照射示意图。
图 4：PAA 凝胶制备步骤。 详细说明请参见步骤 7.1。请点击此处查看该图的放大版本。

微球PAA凝胶压痕实验；荧光微珠示意图及显微镜结果。
图5：PAA凝胶刚性的测定。（A）微球压痕法示意图。当微球置于嵌有荧光微珠的PAA凝胶表面时，微球的重量会使凝胶产生压痕。通过将微球底部的z轴位置减去PAA凝胶表面的z轴位置，可计算出压痕深度。（B，C）微球压痕下含荧光微珠的PAA凝胶的荧光图像。使用激光扫描共聚焦显微镜获取凝胶表面（B）和微球底部（C）的图像。在压痕区域的凝胶表面，荧光微珠信号不可见（B，圆圈）。然而，在微球底部可观察到信号。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

EGFP 和微珠动态的荧光显微镜图像；显示位置和位移分析的示意图。
图 6：神经元生长锥的力图谱分析。（A-C）嵌入聚丙烯酰胺（PAA）凝胶中的微珠以及通过EGFP标记显示的神经元生长锥的荧光图像。在获取延时图像（A）后，通过加入SDS溶液将神经元从凝胶基底上释放，并采集未受应力基底中微珠的图像（B）。(C) 未受应力基底中的微珠图像显示了微珠在原始位置（绿色）和位移后位置（红色）。生长锥的EGFP信号以蓝色显示。右侧的明暗强度变化图（kymograph）显示了在147秒时间内每隔3秒微珠的运动情况，箭头指示方框区域1和2中的轨迹。区域2中的微珠为参考微珠。比例尺：(A)、(B) 和 (C，左) 为 2 µm，(C，中) 为 1 µm。另见补充文件4。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光微球图像处理步骤：图像拼接、刚体变换、复制。
图7：使用Fiji校正未受应变基底中微球图像x-y位置的步骤。（A）将未受应变基底中的微球图像与荧光微球的时间序列图像堆栈进行拼接。（1）选择 图像 > 图像堆栈 > 工具 > 拼接。（2）分别在 图像1 和 图像2 中选择未受应变基底中的微球图像和荧光微球的时间序列图像堆栈。点击 确定。（3）未受应变基底中的微球图像将被添加到时间序列图像堆栈中。（B）校正荧光微球图像的x-y位置。（1）使用滚动条（红色框）在图像堆栈中选择第二帧（红色箭头）。（2）选择 插件 > StackReg。（3）从下拉列表（红色框）中选择 刚体，然后点击 确定。x-y位置的校正将开始。（C）保存经过x-y位置校正的微球图像。在选中经过x-y位置校正的图像堆栈的第一帧后，（1）选择 图像 > 复制。（2）在 范围 中输入 1，并取消选中 复制堆栈，然后点击 确定。（3）屏幕上将显示未受应变基底中经过x-y位置校正的微球图像。将此图像保存为tiff文件。补充文件6 可帮助研究人员练习上述方法。请点击此处查看该图的放大版本。

牵引力显微镜工作流程；MATLAB界面；荧光微珠图像；数据分析结果。
图8：使用开源牵引力分析代码分析神经元生长锥下方的牵引力。（A）用于分析牵引力的图形用户界面（GUI）。通过下拉列表和滑块（红框所示）可在GUI中确认所选的延时图像。（B）选择包含生长锥的区域。（1）在GUI上点击ROI，然后在细胞图像上用鼠标光标指定两个点（箭头所示）。（2）细胞图像上将出现一个红色方框，两次点击确定两个角的位置。（C）选择生长锥下方检测到的微珠（白色点）。（1）在GUI上点击选择微珠，通过点击在图像上划定一个包含生长锥的多边形区域，然后按Enter键。（2）多边形区域内的白色点将变为红色。（D）计算得到的牵引力方向与大小结果。电子表格中的红色框表示由牵引力分析估算出的力矢量的x分量和y分量。在右侧面板的x-y坐标系中，生长锥产生的力矢量相对于x轴指向-93.8°；该方向指向图（C）中生长锥的后方。补充文件6可帮助研究人员练习上述方法。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件 1：本研究中使用的溶液与培养基配方。详细使用方法见正文。 请点击此处下载该文件。

补充文件 2：神经生长锥中 Lifeact 的荧光成像及 HaloTag-肌动蛋白的荧光斑点成像。 Lifeact（绿色）和 HaloTag-肌动蛋白（洋红色）。图像每 3 秒采集一次，总时长为 147 秒。比例尺：2 µm。另请参见 图 3。请点击此处下载该文件。

补充文件3：F-肌动蛋白流动速度与肌动蛋白聚合速率定量分析的练习数据。 一段Lifeact（绿色）和HaloTag-肌动蛋白（洋红色）的多通道延时成像序列图像。另见图3。请点击此处下载该文件。

补充文件4：检测神经元生长锥牵引力的力图视频。 微珠的原始位置（绿色）和位移后位置（红色）。生长锥中的EGFP信号以蓝色显示。图像每3秒采集一次，共147秒。比例尺：2 µm。另见图6。请点击此处下载该文件。

补充文件5：牵引力分析代码。 详细使用方法请参见步骤8.12。 请点击此处下载该文件。

补充文件6：牵引力定量分析的练习数据。 未受应力基底中微珠的单通道RGB图像，以及生长锥下方荧光微珠、EGFP和明场的单通道延时RGB图像序列。另请参见图7和8。请点击此处下载该文件。

讨论

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本研究中描述的实验方案使用了所有实验室、研究机构和大学中常规配备的市售材料和显微镜设备。因此，研究人员可以轻松地在其研究中采用本研究所述的单颗粒成像和牵引力显微镜技术。

斑点成像可用于分析肌动蛋白聚合和离合器偶联。此外，斑点成像还可用于监测与F-肌动蛋白逆行流相互作用的离合器分子（如shootin1和cortactin）的逆行流动。利用全内反射荧光显微镜（TIRF），也可监测细胞黏附分子L1-CAM的逆行流动23,41；L1-CAM表现出“抓握”和“滑脱”行为，这些行为反映了离合器偶联的效率23,41。尽管本研究采用TMR-HaloTag系统进行斑点成像，但其他荧光蛋白（如EGFP和单体红色荧光蛋白）也可用于此类分析16,18,20,23,24,27,39。实现肌动蛋白斑点可视化的关键在于荧光标记肌动蛋白的低表达水平以及最小区域的照明（图2）。在本实验方案中，Lifeact和HaloTag-肌动蛋白信号是依次采集的。由于肌动蛋白逆行流速度相对较慢（4.5 ± 0.1 µm/min）24，不同荧光通道的顺序图像采集（约1秒间隔）不会影响F-肌动蛋白逆行流和肌动蛋白聚合的分析。Lifeact是一种广泛使用的F-肌动蛋白标记物，但可能与肌动蛋白结合蛋白产生竞争47。更为重要的是，Lifeact可能改变肌动蛋白动力学，从而影响F-肌动蛋白结构和细胞形态47,48,49。

牵引力显微镜可用于检测驱动生长锥前进的作用力。通过将神经元嵌入细胞外基质中，研究者还可以在准三维环境中分析其所产生的力11。由于生长锥产生的牵引力较弱，高倍成像对于牵引力的精确定量至关重要7。尽管也有使用纳米柱或应力敏感型生物传感器等其他方法来测量牵引力50,51，但基于聚丙烯酰胺（PAA）凝胶的方法具有高度可调性，可通过改变丙烯酰胺和双丙烯酰胺的浓度来调节基底刚度41,44,52。在本实验方案中，PAA凝胶的终浓度为3.75%丙烯酰胺和0.03%双丙烯酰胺；其杨氏模量约为270 Pa22，该刚度处于脑组织弹性模量范围（100–10,000 Pa）之内53,54,55。由于PAA凝胶具有一定厚度（约100 µm），该方法在显微镜观察时限制了高倍物镜的使用。为获得高倍图像，研究者应使用激光扫描共聚焦显微镜的放大功能。

综上所述，当前的散斑成像与牵引力显微镜技术能够对力生成过程中的关键事件进行定量分析。这些信息对于深入理解生长锥前进与导向机制具有重要价值。

披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本研究部分由AMED（课题编号21gm0810011h0005，N.I. 和 Y.S.）、JSPS科研费（JP19H03223，N.I.）以及JSPS早年研究人员资助项目（JP19K16258，T.M.）、难治性疾病大阪医学研究基金会（T.M.）和NAIST下一代跨学科研究项目（Y.S.）提供支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5% 台盼蓝染色液Nacalai29853-34
3-氨基丙基三甲氧基硅烷Sigma281778-100ML
丙烯酰胺单体Nacalai00809-85
过硫酸铵Cytiva17-1311-1
Axio Observer Z1Zeiss431007-9902-000落射荧光显微镜（单点成像）
B-27 添加剂（50倍浓缩）Thermo Fisher Scientific17504-044
牛血清白蛋白SigmaA7906-10G
C-Apochromat 63x/1.2 W CorrZeiss421787-9970-799物镜（牵引力显微镜）
盖玻片（直径 18 mm）MatsunamiC018001
D-葡萄糖Nacalai16806-25
DNaseISigmaDN25-100MG
胎牛血清Thermo Fisher Scientific10270-106
Fiji开源软件包https://imagej.net/software/fiji/
FluoSpheres 羧基修饰微球 0.2 mm，红色（580/605），2% 固体Thermo Fisher ScientificF8810羧基修饰微球
玻璃底培养皿（直径 14 mm）MatsunamiD1130H
玻璃底培养皿（直径 27 mm）MatsunamiD1140H
戊二醛溶液SigmaG5882-10X10ML
HaloTag TMR 配体PromegaG8251
HBO103 W/2Osram4050300382128汞灯（单点成像）
图像处理工具箱MathWorkhttps://www.mathworks.com/products/image.html
小鼠 EHS 肿瘤来源层粘连蛋白溶液Wako120-05751
Leibovitz’s L-15 培养基Thermo Fisher Scientific11415064
L-谷氨酰胺Nacalai16919-42
LSM710ZeissN/A共聚焦激光显微镜（牵引力显微镜）
MATLAB2018aMathWorkhttps://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html
小鼠 C57BL/6Japan SLCN/A
小鼠神经元核转染试剂盒LonzaVPG-1001
N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）Nacalai33401-72
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺Nacalai22402-02
Neurobasal 培养基Thermo Fisher Scientific21103-049
Nucleofector IAmaxaAAD-1001电穿孔仪
ORCA Flash 4.0 V2HamamatsuC11440-22CUCMOS 相机（单点成像）
木瓜蛋白酶Nacalai26036-34
并行计算工具箱MathWorkhttps://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html
pEGFP-C1Clontech1528177
青霉素-链霉素（100倍浓缩）Nacalai Tesque26253-84
pFN21A-HaloTag-actin(Minegishi et al., 2018)N/A
磷酸盐缓冲液（PBS）pH 7.4（10倍浓缩）Thermo Fisher Scientific70011-044
Plan-Apochromat 100x/1.4 OilZeiss420790-9901-000物镜（单点成像）
pmNeonGreen-N1-Lifeact(Kastian et al., 2021)N/A
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐SigmaP6407-5MG
Sulfo-SAMPHOThermo Fisher Scientific22589
十二烷基硫酸钠Nacalai08933-05
氢氧化钠（NaOH）Nacalai31511-05
钢珠Sako tekkouN/A用于测定 PAA 凝胶刚性的微球。直径 0.6 mm，密度 7.87 g/cm3。
ZEN2009Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction图像采集软件（牵引力显微镜）
ZEN2012Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction图像采集软件（单点成像）

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