利用烟草天蛾作为昆虫模型系统进行大麻素临床前研究

摘要

本实验方案提供了使用烟草天蛾幼虫的指导信息 烟草天蛾 在大麻素研究中. 本文所述方法包含了监测昆虫模型在大麻二酚（CBD）处理下生理和行为变化所需的所有试剂与实验方案。

摘要

随着医学领域对大麻素的关注日益增加，多种哺乳动物模型已被用于阐明其尚未明确的药理功能。然而，哺乳动物研究仍面临诸多困难，因此有必要开发非哺乳动物模型用于大麻素研究。作者提出烟草天蛾 Manduca sexta 作为一种新型昆虫模型系统。本实验方案介绍了如何制备含不同浓度大麻二酚（CBD）的人工饲料、建立培养环境，以及监测其在CBD处理下产生的生理和行为变化。简言之，在收到天蛾卵后，将其置于25 °C、12小时光照/12小时黑暗的条件下孵化1–3天，随后随机分配至对照组（以麦胚为基础的人工饲料，AD）、溶剂对照组（AD + 0.1%中链甘油三酯油，MCT油）和处理组（AD + 0.1% MCT油 + 1 mM 或 2 mM CBD）。饲料制备完成后，将1^龄幼虫 individually 置于50 mL试管中，并在管内插入一根木制搅拌棒，试管口用纱布封盖。每隔2天记录一次幼虫对CBD处理的生理和行为反应。这种简便的培养方法使研究人员能够在单次实验中检测大量样本。此外，由于其相对较短的生活周期，研究人员可在同质种群的多个世代中研究大麻素处理的长期影响，从而为更高阶哺乳动物模型的实验设计提供数据支持。

引言

近年来，由于大麻素具有治疗癫痫¹、帕金森病²、多发性硬化症³以及多种癌症^4,5,6的潜力，公众的关注主要集中在其上，尤其是大麻二酚（CBD）。自2018年《农业改善法案》（Public Law 115-334，即2018年农业法案）将Cannabis合法化为一种农产品以来，Cannabis及其大麻素衍生物在食品、化妆品和制药行业中的应用呈指数级增长。此外，单一大麻素及大麻素混合物的临床级分离物已在人体受试者⁷、细胞系^5,8以及多种动物模型系统^9,10中成功进行了测试。

对于验证大麻素对某种特定疾病的疗效和不良反应而言，临床试验是最理想的方法。然而，临床试验面临诸多挑战，包括伦理/机构审查委员会（IRB）审批、受试者的招募与留任¹¹。为了克服这些障碍，研究人员采用了多种人体细胞系，因为来源于人体的细胞系成本较低、易于操作、可规避伦理问题，并且能够提供一致且可重复的实验结果，因为细胞系是“不含其他细胞和化学物质交叉污染的纯细胞群体”¹²。

Alves 等人（2021）¹³在胎盘滋养层细胞中以剂量依赖方式检测了 CBD，滋养层细胞是胎盘的特化细胞，在胚胎着床及与母体蜕膜化子宫的相互作用中发挥关键作用¹⁴。他们的结果表明，CBD 导致细胞活力下降、细胞周期进程受阻以及细胞凋亡的诱导。这些观察结果揭示了孕妇使用Cannabis可能带来的负面影响¹³。同样，一系列细胞系也被用于研究 CBD 在人类疾病（尤其是多种癌症）中的药理作用。体外研究成功证明了 CBD 对胰腺癌¹⁵、乳腺癌⁸和结直肠癌细胞¹⁶具有抗肿瘤作用。然而，尽管某些细胞系（如 HeLa、HEK293）易于获取和操作，但其遗传和表型特征容易因培养条件或操作方式的改变而发生变化¹⁷。

在Cannabis研究中，已采用多种动物模型系统，从小型动物如小鼠¹⁸、豚鼠¹⁹和兔¹⁹，到大型动物如犬²⁰、仔猪²¹、猴²²和马²³，用于探索未知的治疗作用。由于小鼠在解剖学、生理学和遗传学上与人类高度相似²⁴，已成为大麻素研究中最常用的动物模型系统。尤为重要的是，小鼠神经系统中存在与人类相似的CB1/2受体。此外，小鼠的生命周期比人类短，易于饲养，且拥有丰富的遗传资源，因此更便于在整个生命周期中监测大麻素的作用。哺乳动物系统被广泛应用，并已成功证明CBD可缓解癫痫类疾病¹、创伤后应激障碍⁹、口腔溃疡²⁵以及类痴呆症状¹⁰。小鼠模型还实现了对群体内个体间社会互动的研究，而此类研究在大型动物和人类中极为困难²⁶。

尽管动物模型系统具有诸多优势，但其成本仍然较高，且在药物给药和数据收集过程中需要 intensive care。此外，由于实验设计和严谨性方面的局限性，小鼠模型在研究中存在不可重复性和对人类疾病状态模拟不佳的问题，因而受到 scrutiny²⁷。

随着对大麻素医学/临床前研究需求的不断增加，亟需一种非哺乳动物的模式系统。无脊椎动物模型相较于脊椎动物模型具有传统优势，其显著优点包括易于饲养大量样本、成本低廉，并使研究人员能够监测遗传背景均一的多代种群²⁸。最近一项研究证实，果蝇（Drosophila melanogaster）是一种有效的昆虫模型系统，可用于研究大麻素在调控摄食行为中的药理作用²⁹。在众多昆虫模型系统中，作者聚焦于烟草天蛾（Manduca sexta），也称卡罗来纳天蛾或鹰蛾，作为一种用于大麻素研究的新型昆虫模型系统。

Manduca sexta 属于天蛾科。这种昆虫是美国南部最常见的植物害虫，以茄科植物为食。该昆虫模型在昆虫生理学、生物化学、神经生物学以及药物相互作用研究中具有悠久的研究历史。Manduca sexta 的 研究资源包括一个草图基因组序列，使得研究人员能够在分子水平上理解关键的细胞过程³⁰。该模型系统的另一重要优势是其体型较大，在18至25天的幼虫发育期间，体长可超过100 mm，体重可达10 g。较大的体型使研究人员能够实时方便地监测其对大麻二酚（CBD）处理所引起的形态学和行为学变化。此外，由于体型较大，研究人员可在无需高分辨率显微镜设置的情况下，利用腹部神经系统（包括从幼虫中解剖出的神经节）进行电生理反应的检测。这一独特优势使得研究人员能够便捷地探究施用大麻素后产生的急性及长期反应。

尽管具有如此多样的用途， M. sexta 最近才开始探索其作为实验模型的适用性 大麻 和大麻素 研究。2019年，作者首次利用昆虫模型系统验证了以下假设： 大麻 已进化出产生大麻二酚的能力，以保护自身免受昆虫食草动物的侵害^30,31结果表明，植物利用CBD作为摄食抑制剂，有效抑制了害虫的生长。 M. sexta 幼虫，以及导致死亡率升高³¹该研究还证明了CBD对乙醇中毒幼虫的挽救作用，并指出了乙醇作为CBD载体可能存在的溶剂效应。如所示，该昆虫模型系统可在3至4周内有效评估大麻素的治疗效果，相较于其他动物模型，所需人力和成本更低。尽管昆虫模型缺乏大麻素受体（即.，无CB1/2受体），该模型系统为通过非依赖大麻素受体的途径理解大麻素的药理学作用提供了有价值的工具。

本研究的作者此前曾将烟草天蛾作为大麻素研究的模型系统³¹。在仔细评估使用M. sexta的利弊后，我们提供了一种方法，涉及为临床前试验准备饲料的适当护理与制备流程，为今后在实验室中开展临床前研究提供了可能。

方案

1. 天蛾幼虫的准备与大麻二酚处理

1. 获取150–200个有活力的 M. sexta 卵和以小麦胚芽为基础的人工饲料（见材料表）。
2. 将蛾类幼虫卵置于含有小麦胚芽为基础的人工饲料（AD）层的聚苯乙烯培养皿中，并将卵转移至昆虫饲养箱（见材料表），在25 °C、相对湿度40%–60%的条件下培养。
3. 在25 °C、相对湿度40%–60%的昆虫饲养箱中，使烟草天蛾卵孵化1–3天。
4. 通过将1.26 g纯度>98%的CBD分离物溶于20 mL无水乙醇（200 proof）或100%中链甘油三酯（MCT）油中，配制200 mM的CBD储备液（见材料表）。
   注意：CBD分离物对光敏感，需避光操作。
5. 将5 mL和10 mL的200 mM CBD储备液分别加入1,000 g人工饲料中，使饲料中CBD的终浓度分别为1 mM和2 mM。
   注意：确保饲料与CBD储备液充分混合，直至形成完全均匀的混合物。将含CBD储备液的人工饲料置于塑料袋中手工揉捏至少45分钟。
   警告：咖啡搅拌机或其他任何金属研磨器效果不佳。
6. 将三种培养基——对照组（AD）、溶剂对照组（AD + 0.1%乙醇或MCT油）以及含CBD培养基（AD + 0.1%乙醇或MCT油 + 1 mM/2 mM CBD）——各取20 g，分别加入50 mL离心管底部。
7. 将1龄幼虫（长约2 mm）随机分配至50 mL试管中，每管一只，并用带孔盖子或纱布封口（见材料表）。
   注意：将试管倒置，并在25 °C、相对湿度40%–60%的昆虫饲养箱中培养昆虫。
8. 在25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环的昆虫饲养箱中继续培养（见材料表）。

2. M. sexta 幼虫生长、摄食量及死亡率测定

1. 测量幼虫生长（即使用分析天平测量个体容器中生物的（体长、体型和体重）等参数，并在转移后每2天记录一次死亡情况，直至观察到化蛹，即体壁硬化并呈现深褐色外骨骼层。
   1. 记录每组幼虫在分别引入对应饲料前的初始质量（单位：克），并在每次测量时从初始质量中减去幼虫的质量，以确定幼虫在不同发育阶段之间的质量增加，直至幼虫完成化蛹阶段。
   2. 记录各龄期发育阶段之间的天数，以了解不同饲料条件下幼虫生长至化蛹各阶段发育时间的差异。
      注意：从容器中刮取粪便样本时，应避免任何霉菌污染。根据实验目的，收集样本以备后续检测使用（例如，CBD积累速率计算，微生物群落分析）。在蜕皮或蜕皮期等脆弱阶段，必须小心处理昆虫。从容器中取出幼虫时，应使用平头宽镊子轻轻夹住昆虫的主体部分，在昆虫正在蜕去外层表皮时，切勿强行剥离。
2. 测量饮食消耗量³¹ 通过称量容器在1之间的饲料消耗量^st 龄期幼虫与化蛹。记录实验开始时饲料的初始重量，并在幼虫进入完全化蛹阶段时，从剩余饲料重量中减去初始重量。
   注意：粪便物质应从饮食摄入量的测量中排除。粪便物质及其他碎屑（即., 皮肤脱落物）可通过将容器倒置从培养基中轻松去除。
3. 进行运动能力测量时，让受试昆虫在实验腔室内适应环境至少5分钟，然后记录其移动距离³¹ 5只一组，共三组^th 龄期昆虫（体长80-100毫米）在自动化计算机化恐惧条件反射实验箱中移动（参见 材料表).
4. 分析迁移响应³¹ 使用运动检测软件以每秒60帧的速度记录视频，持续5分钟（参见 材料表）可生成运动指数。

3. 统计学分析

1. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey 事后检验，分析幼虫生长（i.e.，体型和体重）和运动指数的差异³²。
2. 使用对数秩检验（log-rank (Mantel-Cox) test）³³ 进行生存曲线的比较。
   注意：所有统计分析均使用统计分析软件完成（见材料表）。

结果

Manduca sexta 作为研究大麻素毒性的模型系统
图1 展示了使用烟草天蛾 Manduca sexta 进行CBD实验的关键组成部分。大量昆虫（>20只）在25 °C、12小时光照:12小时黑暗的条件下单独饲养。每隔2天测量昆虫的体型、体重和死亡率，以监测高剂量CBD（2 mM）处理后的短期和长期反应。

图2展示了CBD对昆虫生长发育的不利影响。在人工饲料（AD）上饲养的昆虫表现出最佳的生长表现。使用0.1%中链甘油三酯（MCT）油作为CBD分离物溶解剂的溶剂对照组也表现出正常生长，无任何不良影响。然而，高剂量的CBD（2 mM）导致体重下降（图2C），并比对照组和溶剂对照组具有更高的死亡率（图2D）。

讨论

饲喂实验表明，高剂量的CBD（2 mM）抑制了昆虫的生长并增加了死亡率³¹。该昆虫模型对乙醇也表现出敏感性；然而，CBD能有效解毒乙醇毒性，使其存活率、摄食量和觅食行为恢复至与对照组相似的水平（图3A、B）³¹。所述昆虫模型系统包含三个关键步骤：（1）确保M. sexta卵在大小和孵化时间上保持一致；（2）制备均匀混合大麻素并达到目标浓度的培养基；（3）在维持40%–60%理想湿度的同时，防止培养基受到真菌污染。该昆虫模型系统使我们能够在25天内完成从培养基制备到数据收集与分析的研究过程。最重要的是，该昆虫系统在大量样本中产生了稳定一致的结果。

为了确保人工饲养的M. sexta幼虫成功生长，必须将容器内的相对湿度维持在40%–60%。如果容器无法保持较高的湿度，含有大麻素的人工饲料会迅速失水干燥，导致昆虫死亡，从而提前终止实验。然而，在密闭系统中，高湿度环境...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
分析天平	Mettler Instrument Corp.	AE100S
大麻二酚分离物（>99.4%）	Lilu's Garden
纱布	VWR INTERNATIONAL	470150-438
Corning 50 mL 透明聚丙烯（PP）离心管	VWR	89093-192
乙醇，200 证明	Sigma-Aldrich	EX0276-1
恐惧条件反射实验舱	Coulbourn Instruments
昆虫饲养舱	Darwin Chambers	INR034
中链甘油三酯（MCT）油	Walmart
运动检测软件（Actimetrics）	Coulbourn Instruments
聚苯乙烯培养皿（120 mm × 120 mm × 17 mm）	VWR INTERNATIONAL	688161
烟草天蛾幼虫人工饲料	Carolina Biological Supply Company	商品编号 # 143908	即用型天蛾幼虫饲料
烟草天蛾卵	Carolina Biological Supply Company	商品编号 # 143880	每单位 30–50 粒