本实验方案提供了使用烟草天蛾幼虫的指导信息 烟草天蛾 在大麻素研究中. 本文所述方法包含了监测昆虫模型在大麻二酚（CBD）处理下生理和行为变化所需的所有试剂与实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
随着医学领域对大麻素的关注日益增加，多种哺乳动物模型已被用于阐明其尚未明确的药理功能。然而，哺乳动物研究仍面临诸多困难，因此有必要开发非哺乳动物模型用于大麻素研究。作者提出烟草天蛾 Manduca sexta 作为一种新型昆虫模型系统。本实验方案介绍了如何制备含不同浓度大麻二酚（CBD）的人工饲料、建立培养环境，以及监测其在CBD处理下产生的生理和行为变化。简言之，在收到天蛾卵后，将其置于25 °C、12小时光照/12小时黑暗的条件下孵化1–3天，随后随机分配至对照组（以麦胚为基础的人工饲料，AD）、溶剂对照组（AD + 0.1%中链甘油三酯油，MCT油）和处理组（AD + 0.1% MCT油 + 1 mM 或 2 mM CBD）。饲料制备完成后，将1龄幼虫 individually 置于50 mL试管中，并在管内插入一根木制搅拌棒，试管口用纱布封盖。每隔2天记录一次幼虫对CBD处理的生理和行为反应。这种简便的培养方法使研究人员能够在单次实验中检测大量样本。此外，由于其相对较短的生活周期，研究人员可在同质种群的多个世代中研究大麻素处理的长期影响，从而为更高阶哺乳动物模型的实验设计提供数据支持。
引言
近年来，由于大麻素具有治疗癫痫1、帕金森病2、多发性硬化症3以及多种癌症4,5,6的潜力，公众的关注主要集中在其上，尤其是大麻二酚（CBD）。自2018年《农业改善法案》（Public Law 115-334，即2018年农业法案）将Cannabis合法化为一种农产品以来，Cannabis及其大麻素衍生物在食品、化妆品和制药行业中的应用呈指数级增长。此外，单一大麻素及大麻素混合物的临床级分离物已在人体受试者7、细胞系5,8以及多种动物模型系统9,10中成功进行了测试。
对于验证大麻素对某种特定疾病的疗效和不良反应而言，临床试验是最理想的方法。然而，临床试验面临诸多挑战，包括伦理/机构审查委员会（IRB）审批、受试者的招募与留任
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方案
1. 天蛾幼虫的准备与大麻二酚处理
- 获取150–200个有活力的 M. sexta 卵和以小麦胚芽为基础的人工饲料（见材料表）。
- 将蛾类幼虫卵置于含有小麦胚芽为基础的人工饲料（AD）层的聚苯乙烯培养皿中，并将卵转移至昆虫饲养箱（见材料表），在25 °C、相对湿度40%–60%的条件下培养。
- 在25 °C、相对湿度40%–60%的昆虫饲养箱中，使烟草天蛾卵孵化1–3天。
- 通过将1.26 g纯度>98%的CBD分离物溶于20 mL无水乙醇（200 proof）或100%中链甘油三酯（MCT）油中，配制200 mM的CBD储备液（见材料表）。
注意：CBD分离物对光敏感，需避光操作。 - 将5 mL和10 mL的200 mM CBD储备液分别加入1,000 g人工饲料中，使饲料中CBD的终浓度分别为1 mM和2 mM。
注意：确保饲料与CBD储备液充分混合，直至形成完全均匀的混合物。将含CBD储备液的人工饲料置于塑料袋中手工揉捏至少45分钟。
警告：咖啡搅拌机或其他任何金属研磨器效果不佳。 - 将三种培养基——对照组（AD）、溶剂对照组（AD + 0.1%乙醇或MCT油）以及含CBD培养基（AD + 0.....
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结果
Manduca sexta 作为研究大麻素毒性的模型系统
图1 展示了使用烟草天蛾 Manduca sexta 进行CBD实验的关键组成部分。大量昆虫（>20只）在25 °C、12小时光照:12小时黑暗的条件下单独饲养。每隔2天测量昆虫的体型、体重和死亡率，以监测高剂量CBD（2 mM）处理后的短期和长期反应。
图2展示了CBD对昆虫生长发育的不利影响。在人工饲料（AD）上饲养的昆虫表现出最佳的生长表现。使用0.1%中链甘油三酯（MCT）油作为CBD分离物溶解剂的溶剂对照组也表现出正常生长，无任何不良影响。然而，高剂量的CBD（2 mM）导致体重下降（图2C），并比对照组和溶剂对照组具有更高的死亡率（图2D）。
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讨论
饲喂实验表明，高剂量的CBD（2 mM）抑制了昆虫的生长并增加了死亡率31。该昆虫模型对乙醇也表现出敏感性；然而，CBD能有效解毒乙醇毒性，使其存活率、摄食量和觅食行为恢复至与对照组相似的水平（图3A、B）31。所述昆虫模型系统包含三个关键步骤：（1）确保M. sexta卵在大小和孵化时间上保持一致；（2）制备均匀混合大麻素并达到目标浓度的培养基；（3）在维持40%–60%理想湿度的同时，防止培养基受到真菌污染。该昆虫模型系统使我们能够在25天内完成从培养基制备到数据收集与分析的研究过程。最重要的是，该昆虫系统在大量样本中产生了稳定一致的结果。
为了确保人工饲养的M. sexta幼虫成功生长，必须将容器内的相对湿度维持在40%–60%。如果容器无法保持较高的湿度，含有大麻素的人工饲料会迅速失水干燥，导致昆虫死亡，从而提前终止实验。然而，在密闭系统中，高湿度环境.......
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致谢
本研究由科罗拉多州立大学普韦布洛分校大麻研究所、韩国科学技术信息通信部（2021-DD-UP-0379）及春川市（Hemp R&D 与工业化，2020-2021年）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 分析天平 | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
| 大麻二酚分离物（>99.4%） | Lilu's Garden | ||
| 纱布 | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
| Corning 50 mL 透明聚丙烯（PP）离心管 | VWR | 89093-192 | |
| 乙醇，200 证明 | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
| 恐惧条件反射实验舱 | Coulbourn Instruments | ||
| 昆虫饲养舱 | Darwin Chambers | INR034 | |
| 中链甘油三酯（MCT）油 | Walmart | ||
| 运动检测软件（Actimetrics） | Coulbourn Instruments | ||
| 聚苯乙烯培养皿（120 mm × 120 mm × 17 mm） | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
| 烟草天蛾幼虫人工饲料 | Carolina Biological Supply Company | 商品编号 # 143908 | 即用型天蛾幼虫饲料 |
| 烟草天蛾卵 | Carolina Biological Supply Company | 商品编号 # 143880 | 每单位 30–50 粒 |
参考文献
- Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).
- Leehey, M. A., et al.
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