ACT1-CUP1测定确定出芽酵母中剪接体突变体的底物特异性敏感性

摘要

ACT1-CUP1测定是一种铜生长测定，可快速读取前体信使RNA（pre-mRNA）剪接以及突变剪接因子对剪接体功能的影响。本研究提供了一个协议，并强调了解决感兴趣的拼接问题的定制可能。

摘要

剪接体或其底物中引入的突变极大地促进了我们对剪接体功能复杂性的理解。无论是疾病相关还是功能选择，许多这些突变都已使用模式生物酿 酒 酵母（酵母）的生长测定进行了研究。剪接特异性铜生长测定或ACT1-CUP1测定在表型水平上提供了对突变的全面分析。ACT1-CUP1测定利用报告基因在正确拼接时赋予铜公差。因此，在铜存在的情况下，酵母活力的变化与剪接中mRNA产生的变化相关。在典型的实验中，酵母剪接体受到不同的非共识剪接报告基因和感兴趣的剪接因子突变的挑战，以检测对剪接的任何协同或相反影响。这里给出了铜板制备、酵母细胞电镀和数据评估的完整描述。描述了一系列免费的实验，突出了ACT1-CUP1报告基因的多功能性。ACT1-CUP1测定是剪接工具箱中方便的工具，这要归功于直接读取突变效应和在该领域继续使用的比较可能性。

引言

剪接体是一种大型生物机器，可催化去除前体信使RNA（pre-mRNA^）中的内含子和非编码区域1^，2。在单独研究蛋白质或RNA时，表征近100种蛋白质和5种非编码RNA中的1种中的单点突变体的作用通常是模棱两可的。突变组件功能的变化可以在完整的功能剪接体的背景下最好地在体内进行评估。

这里描述的铜生长测定是 酿酒 酵母或出芽酵母剪接效率的快速衡量标准。该测定由C.F. Lesser和C. Guthrie开发并于1993年发表，结合了与简单模式生物的易用性和细胞活力的直接^读数3。活力与这些细胞中的剪接体识别和拼接报告转录本的能力相关。

这种铜生长测定通常称为ACT1-CUP1测定。ACT1-CUP1这个名字起源于两个基因融合在一起，创造了剪接效率的报告基因。ACT1是酵母的肌动蛋白基因，其高表达并具有有效的剪接内含子^4，5。Cup1p是一种铜螯合剂，可将铜隔离在细胞中，以防止干扰正常的细胞功能⁶，

方案

1. 酵母菌株构建

1. 生成或获得酿 酒酵母 菌株，其背景包括 leu2 和 cup1Δ。要生成此背景，请使用采用乙酸锂和单链DNA³⁹的成熟酵母方法。
   注意:单倍体酵母菌株可能包含一个，两个或多个 CUP1^6，38拷贝。在设计敲除引物以侧翼 CUP1 基因位置时，请参阅所选酵母菌株的基因组信息。
2. 进行酵母转化以通过基因组掺入或在质粒上掺入QSP。使用完善的协议，例如先前研究⁴⁰，^41，42中描述的方案。
3. 使用步骤1.2中产生的菌株进行酵母转化。添加所需的ACT1-CUP1报告质粒。
   注意:细胞必须保留在亮氨酸脱落（-Leu）板和培养基上，以确保在此转化后保留ACT1-CUP1报告质粒。
4. 执行步骤 1.2。和 1.3.对于要测试的每个QSP和每个ACT1-CUP1报告质粒，包括对照菌株。

2. 铜....

结果

生长测定，如ACT1-CUP1，需要对多个菌落进行目视比较评估。在这里，将每种菌株在一夜之间生长至饱和，稀释至OD₆₀₀ 为0.5，并镀在含有0 mM至1.1 mM CuSO₄ 铜浓度范围的20个板上（图3）。该范围小于协议中列出的范围，因为它允许全面评估下面使用和描述的QSP和ACT1-CUP1报告的影响。对板进行成像和评分（图 3和 补充表3）。

对于这个代表性的实验，酵母背景包括一个被破坏的 ADE2 基因，导致菌落是不同深浅的红色（图3A，B）。腺苷生产途径中的这种常见酵母破坏导致腺苷的红色色素前体积聚。因此，红色是酵母菌落成熟的指标（即存在的细胞的数量和年龄）。对于ACT1-CUP1测定的目的，红色可以作为污染真菌物种的指示剂，如果颜色为白色或黄色。颜色可以是铜耐受性.......

讨论

ACT1-CUP1是一种生长测定，必须注意确保观察到的生长差异只能归因于剪接缺陷。所有菌株在铺板前应以类似的方式处理，包括具有相似的长度和类型的生长和储存条件。如果使用温度敏感菌株，ACT1-CUP1测定应仅在这些菌株生长与野生型相当的条件下进行。相关地，对于QSP成分，建议具有相同的酵母背景和QSP基因的表达水平，以免影响结果的解释。在考虑要使用的QSP和报告器数量时，不建议使用针复制器方法一次检测超过30个菌株。随着执行每个步骤的额外时间，细胞将稳定，并且由于细胞活力降低，测定结果将不一致。

除了ACT1-CUP1作为生长测定固有的限制外，QSP可能对剪接产生比该方法可以解决的更复杂的影响。由于剪接是一个多步骤的过程，并且因子被回收，观察到的表型可能导致扰动影响多个剪接步骤。即使对于可以跟踪ACT1-CUP1的后续分析也是如此，其中一些将在下面描述。数据将突出显示过程中最受干扰的步骤，即使其他步骤可能会受到拼接因子功能改变的影响。

ACT1-CUP1报告基因的引物扩展首先用于Lesser和Guthrie的原始论文，如果AC.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 无菌微量离心管	Fisher Scientific	05-408-129	或其他制造商的类似产品。
2 mL 无菌微量离心管	Fisher Scientific	05-408-138	或其他制造商的类似产品。
50 mL 无菌离心管	Fisher Scientific	07-201-332	或其他制造商的类似产品。
96 孔圆底微孔板	Fisher Scientific	07-200-760	或其他制造商的类似产品。
190 度乙醇	Fisher Scientific	22-032-600	或其他制造商的类似产品。
500 mL 过滤系统（0.22 µm）	CellTreat Scientific 产品	229707	或其他制造商的类似产品。
琼脂	Fisher Scientific	BP1423-500	分子级琼脂都可以。
Autoclave	Tuttnauer	3870EA	或其他制造商的类似产品。
本生灯	Humboldt	PN6200.1	或其他制造商的类似产品。
细胞密度计	VWR	490005-906	或其他可测量 595 nm 处吸光度的光谱设备。
硫酸铜 五水合	物 Fisher Scientific	LC134051	或其他制造商的类似产品。
数字成像系统	Cytiva	29399481	ImageQuant 4000（用于图 3）， Amersham ImageQuant 800 或其他制造商的类似商品。
过滤混合液 （-Leu）	USBiological Life Sciences	D9525	为您的实验使用合适的过滤混合液。您也有可能将酵母营养标记用于您的查询扰动。在这种情况下，脱落混合物应适用于该标记物和 Leu
D-Glucose	Fisher Scientific	AAA1682836	或其他制造商的类似商品。
凝胶条带定量软件	Cytiva	29-0006-05	ImageQuant TL v8.1（用于图 5A）或其他制造商的类似产品。
手持相机	尼康	D3500	或其他制造商的类似产品。
近红外凝胶成像设备	Cytiva	29238583	Amersham Typhoon NIR（用于图 5a）或其他制造商的类似物品。
实验室级夹具	Fisher Scientific	05-769-7Q	或其他制造商的类似产品。
实验室级支架和夹	Fisher Scientific	12-000-101	或其他制造商的类似产品。
磁力搅拌棒	Fisher Scientific	14-513-51	或其他制造商的类似产品。
针式复制器	VP Scientific	VP 407AH
半微量一次性比色皿	VWR	97000-590	或其他制造商的类似产品。
摇床	JEIO Tech	IST-3075	或其他制造商的类似产品。
分光光度计	Biowave	80-3000-45	或任何可以测量 600 nm 处吸光度的分光光度计。
方板	VWR	102091-156	也可以使用圆板，但如果使用销复制器，则更具挑战性。
搅拌板	Fisher Scientific	11-520-16S	或其他制造商的类似产品。
酵母氮基	USBiological Life Sciences	Y2025	或其他制造商的同类产品。