ACT1-CUP1测定确定出芽酵母中剪接体突变体的底物特异性敏感性

摘要

ACT1-CUP1测定是一种铜生长测定，可快速读取前体信使RNA（pre-mRNA）剪接以及突变剪接因子对剪接体功能的影响。本研究提供了一个协议，并强调了解决感兴趣的拼接问题的定制可能。

摘要

剪接体或其底物中引入的突变极大地促进了我们对剪接体功能复杂性的理解。无论是疾病相关还是功能选择，许多这些突变都已使用模式生物酿 酒 酵母（酵母）的生长测定进行了研究。剪接特异性铜生长测定或ACT1-CUP1测定在表型水平上提供了对突变的全面分析。ACT1-CUP1测定利用报告基因在正确拼接时赋予铜公差。因此，在铜存在的情况下，酵母活力的变化与剪接中mRNA产生的变化相关。在典型的实验中，酵母剪接体受到不同的非共识剪接报告基因和感兴趣的剪接因子突变的挑战，以检测对剪接的任何协同或相反影响。这里给出了铜板制备、酵母细胞电镀和数据评估的完整描述。描述了一系列免费的实验，突出了ACT1-CUP1报告基因的多功能性。ACT1-CUP1测定是剪接工具箱中方便的工具，这要归功于直接读取突变效应和在该领域继续使用的比较可能性。

引言

剪接体是一种大型生物机器，可催化去除前体信使RNA（pre-mRNA^）中的内含子和非编码区域1^，2。在单独研究蛋白质或RNA时，表征近100种蛋白质和5种非编码RNA中的1种中的单点突变体的作用通常是模棱两可的。突变组件功能的变化可以在完整的功能剪接体的背景下最好地在体内进行评估。

这里描述的铜生长测定是 酿酒 酵母或出芽酵母剪接效率的快速衡量标准。该测定由C.F. Lesser和C. Guthrie开发并于1993年发表，结合了与简单模式生物的易用性和细胞活力的直接^读数3。活力与这些细胞中的剪接体识别和拼接报告转录本的能力相关。

这种铜生长测定通常称为ACT1-CUP1测定。ACT1-CUP1这个名字起源于两个基因融合在一起，创造了剪接效率的报告基因。ACT1是酵母的肌动蛋白基因，其高表达并具有有效的剪接内含子^4，5。Cup1p是一种铜螯合剂，可将铜隔离在细胞中，以防止干扰正常的细胞功能⁶，^7，8。ACT1-CUP1报告基因按顺序包含这些基因，使得只有当ACT1内含子发生前mRNA剪接时，CUP1才处于正确的阅读框中（图1）。所得融合蛋白含有肌动蛋白的前 21 个氨基酸和全长 Cup1p 蛋白，可提高酵母在富含铜的环境中的活力³.因此，报告基因拼接量的增加导致更高的Cup1p浓度和更高的铜电阻（图1）。与其他报告基因相比，CUP1即使在低水平下也会影响细胞活力，具有广泛的灵敏度范围，可用于直接选择剪接突变³，^6，7。此外，CUP1对于标准酵母生长不是必需的，因此在该测定的设置过程中不会影响细胞稳态。作为缺失或温度生长测定的补充，ACT1-CUP1提供了有关在其他最佳酵母生长条件下对剪接的影响的信息。

剪接体通过三个内含子序列识别其底物，即5'剪接位点（5'SS）、分支位点（BS）和3'剪接位点（3'SS）。已经产生了许多ACT1-CUP1报告基因，其中包含这些位点的非共识序列。 最常见的 ACT1-CUP1报告基因的选择如图1和 表1所示。由于剪接体在剪接周期的不同点与每个剪接位点唯一地相互作用，因此可以根据使用非共识报告基因的不同步骤测试剪接体的稳健性。非共识报告基因以内含子内的突变位置及其突变的碱基命名。例如，A3c是一个在5'SS处发生突变的报告基因，特别是从共识腺苷到胞嘧啶的位置3。该报告将与影响5'SS选择和使用的剪接体突变发生强烈相互作用。在他们最初的研究中，Lesser和Guthrie确定了哪些5'SS突变抑制剪接³。同年晚些时候，Burgess和Guthrie在ATPase Prp16p⁹突变的抑制筛选中发表了所有三个剪接位点的非共识报告。将共识与非共识报告基因进行比较，ACT1-CUP1测定是了解酵母剪接体的稳健性和选择性以及推断其他真核生物剪接体功能的重要关键。

由于非共识ACT1-CUP1报告基因使剪接体对进一步扰动敏感，因此可以通过报告基因来表征单个剪接因子突变的影响，其积极影响或负面影响。这已被应用于以各种方式拼接研究问题。首先，ACT1-CUP1测定可以并且已经被用作剪接因子突变的遗传筛选。例如，最大的剪接蛋白Prp8p作为剪接体RNA核心催化剪接反应的平台。这部分是通过Prp8p突变体如何改善或减少不同ACT1-CUP1报告基因^10，11，^12，13，¹⁴，¹⁵，^16，17的剪接来推断的。剪接体的其他蛋白质成分也已使用ACT1-CUP1进行了研究，包括Hsh155p，Cwc2p，Cef1p和Ecm2p¹⁸，¹⁹，20，²¹，²²，²³，^24，25。Prp16p和其他四种参与剪接体转化的ATP酶的能量阈值也已通过该测定⁹，²⁶，²⁷，^28，29，30进行了研究。利用ACT1-CUP1对小核RNA（snRNA）进行了广泛的研究，以鉴定它们协调的前mRNA序列以及snRNA在剪接^过程中经历的二级结构的变化3，^31，32，33，³⁴，³⁵，^36，37。

ACT1-CUP1测定需要酵母菌株，其中CUP1基因的所有拷贝都被敲除。由于CUP1可以具有高拷贝数⁶，^38，因此制备完整的敲除菌株可能需要多轮或广泛的筛选。因此，cup1Δ酵母菌株经常在实验室之间共享，记者也是如此。

如果从质粒拷贝评估剪接因子中的突变，则应敲除该因子的野生型基因。此外，酵母背景应允许选择至少两个质粒，一个包含ACT1-CUP1报告基因，历史上在亮氨酸营养选择质粒上，另一个包含将要研究的剪接机制中的突变或扰动（图2）。通常，在一次测定中，多个酵母菌株，每个菌株携带查询剪接扰动（QSP）和不同的报告基因，将测试查询对剪接的影响。

ACT1-CUP1测定中的自变量允许研究人员评估QSP的严重程度。这些自变量是铜的浓度和多个非共识拼接报告基因的选择。首先，由于酵母菌株生长在含有一系列铜浓度的平板上（图2），因此设置测定包括选择所用浓度的梯度。研究可以利用过程铜浓度梯度来获得活性的初始读数，然后以更精细的梯度重复测定以确定细微的活性差异。第二个变量是可以测试的ACT1-CUP1报告基因的广泛范围（图 1和 表1）。如果QSP在非共识报告基因与野生型存在的情况下对酵母活力的影响不同，则可以得出结论，QSP影响剪接步骤或剪接体中在识别或处理内含子该区域期间重要的区域。

酵母工具箱非常广泛，ACT1-CUP1测定是剪接研究的一个组成部分。ACT1-CUP1测定通常与对QSP影响的更深入的遗传，结构和/或生化分析一起进行。由于这些更详细的研究通常具有更长的程序和/或更高的价格标签，因此常见的方法是首先筛选具有ACT1-CUP1的有趣突变体。

这里提供的是ACT1-CUP1测定方案，包括铜板制备。该测定为研究人员提供了QSP对剪接影响的初步答案，以及哪些内含子区域受扰动的影响最大。

方案

1. 酵母菌株构建

1. 生成或获得酿 酒酵母 菌株，其背景包括 leu2 和 cup1Δ。要生成此背景，请使用采用乙酸锂和单链DNA³⁹的成熟酵母方法。
   注意:单倍体酵母菌株可能包含一个，两个或多个 CUP1^6，38拷贝。在设计敲除引物以侧翼 CUP1 基因位置时，请参阅所选酵母菌株的基因组信息。
2. 进行酵母转化以通过基因组掺入或在质粒上掺入QSP。使用完善的协议，例如先前研究⁴⁰，^41，42中描述的方案。
3. 使用步骤1.2中产生的菌株进行酵母转化。添加所需的ACT1-CUP1报告质粒。
   注意:细胞必须保留在亮氨酸脱落（-Leu）板和培养基上，以确保在此转化后保留ACT1-CUP1报告质粒。
4. 执行步骤 1.2。和 1.3.对于要测试的每个QSP和每个ACT1-CUP1报告质粒，包括对照菌株。

2. 铜板制备

1. 选择适合被测报告器的铜浓度范围（常用报告基因致死率见 表1 ）。
   注意:综合铜浓度范围的一个例子是 30 种不同的铜浓度，分别为 0 mM、0.025 mM、0.05 mM、0.075 mM、0.1 mM、0.15 mM、0.2 mM、0.25 mM、0.3 mM、0.35 mM、0.4 mM、0.45 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1.0 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM， 1.4 mM、1.5 mM、1.6 mM、1.7 mM、1.8 mM、1.9 mM、2.0 mM、2.25 mM 和 2.5 mM Cu²⁺。
2. 制作1M CuSO₄ 的储备溶液，并通过0.22μm PES（聚醚砜）无菌过滤器进行无菌过滤器。
3. 根据所需的铜板，在无菌水中制备 2 mL 稀释的 CuSO₄ 储备液。
   注意:由于具有0 mM Cu 2 +的板将始终作为参考进行分析和成像，因此建议制作两个0 mM Cu^{2 +}板，一个在电镀步骤的开始，一个在电镀步骤（步骤3.4）结束时。
   1. 计算板体积的40 mL中最终所需铜浓度的原液量（补充表1）。
   2. 将计算量的无菌水和 1 M CuSO₄ 储备液加入无菌 2 mL 管中。
4. 倒入用于ACT1-CUP1测定的板。
   注意:以下方案的替代方案是首先将培养基和琼脂合并在一个大容器中，并在高压灭菌后等分到较小的容器中，以实现每个板的不同铜浓度。无论采用哪种方法，重要的是要确保所有板之间的介质浓度一致，尽管每个板具有不同的铜浓度。
   1. 在每个要倒入的空盘子上贴上它所含的最终铜浓度。每种要测试的铜浓度至少准备一个方形板。
   2. 标记每个待测铜浓度的 100 mL 瓶子。
   3. 向每个瓶子中加入790毫克琼脂（2%w / v琼脂）和搅拌棒。
   4. 在一个大烧杯中，将-Leu生长培养基混合用于所有要倒入的铜板。每个要制作的板，将 265 mg 酵母氮碱 （YNB） 和 64 mg 减去亮氨酸（以及维持细胞中 QSP 质粒可能需要的任何其他营养素）溶解在 34 mL 去离子水中。
   5. 将 34 mL 的 -Leu 生长培养基溶液加入每个制备的 100 mL 瓶中，并用铝箔盖盖。用预期的铜浓度标记箔。
   6. 高压灭菌器，使用推荐的高压灭菌器液体循环对琼脂进行灭菌和溶解。
   7. 尽快向每个瓶子中加入 4 mL 的 20% w/v 葡萄糖（无菌过滤）。
   8. 匹配标签并将 CuSO₄ 的 2 mL 稀释液添加到其预期瓶中。
      注意:由于可以同时制作数十块铜板，每块铜板的浓度不同，因此在所有瓶子、管子和板上清楚地标上预期的铜浓度将防止在板浇注过程中出现混淆。
   9. 使用搅拌板混合~30秒，然后将35 mL倒入或移液到标记的板中，避免气泡。储存或使用前冷却。
      注意:通常，板在测定前1天或2天制作，并在4°C下储存，直到使用前几个小时。在电镀开始之前，板应处于室温（RT）（步骤3.4）。

3. ACT1-CUP1测定

1. 在-Leu板上划出所需的菌株。
   注意:如果使用冷冻原液工作，应注意确保细胞在电镀前从储存中充分复活。推荐的程序是从低温库存中划线，并使其在30°C下生长3-5天。 然后，重新放置一个小样本，让它在30°C下再生长2-3天。
2. 在 10 mL 培养基中培养过夜培养物。
   1. 使用与步骤2.4.2中所述的相同比例制备-Leu生长培养基。每 10 mL 培养基中，将 66 mg 酵母氮基 （YNB） 和 16 mg 减去亮氨酸的脱落混合物加入 9 mL 去离子水中。通过0.22μm PES无菌过滤器。
   2. 对于酵母菌株，将 9 mL -Leu 生长培养基和 1 mL 20% w/v 葡萄糖（无菌过滤）加入无菌 50 mL 锥形管中。
   3. 使用无菌棒或移液管吸头，收集一个小（~1毫米圆形）酵母样本并接种培养基。
   4. 在180rpm和30°C下摇动所有过夜培养物。
      注意:如果可用，可以使用旋转器代替振动台。
3. 将菌株稀释至OD₆₀₀ 0.5±0.05在10%甘油中。
   1. 每种菌株，将 100 μL 培养物加入含有 900 μL 水的比色皿中。
   2. 用分光光度计测量OD₆₀₀ 。
   3. 计算在 2 mL 的最终体积中 OD₆₀₀ 为 0.5 时所需的稀释度。
   4. 将每种菌株在10%甘油（无菌）中稀释至OD₆₀₀ 0.5。
   5. 重新测量OD₆₀₀ 以确认电池密度在0.5±0.05的所需范围内。
4. 将应变板镀在铜板上。
   注意:可以使用多种方法对菌株进行铺板，包括手动移液 5-10 μL 体积、使用重复或多通道移液器或使用针式复制器进行冲压。下面介绍了最后一种方法，尽管无论使用哪种方法，大多数步骤都是相似的。
   1. 设置无菌工作地点和点燃的本生燃烧器。
   2. 对于 48 针复制器，将 200 μL 每种稀释菌株移液到 96 孔板的单独孔中。用 200 μL 10% 甘油（无菌）填充 6 x 8 网格中的空白区域。
      注意:补充 表2中列出了九种酵母菌株的电镀方案示例。
   3. 将复制器浸入95%（v / v）乙醇和火焰的浅培养皿中以消毒。火焰熄灭后让它冷却至少 2 分钟，以避免热量冲击细胞。
   4. 将四个板放在燃烧器附近并取下盖子。
   5. 将复制器浸入96孔板中，然后快速将其提起。
   6. 轻轻地放在盘子上，轻轻地来回摇晃，以促进良好的转移。
   7. 以一个快速的动作提起，并以完全相同的方向放置在96孔板中。
   8. 对最多三个其他板重复此操作。重复将复制器浸入乙醇中，燃烧以消毒并等待每四个板冷却的过程。
   9. 板铺好后，以平稳的动作向侧面移动，但仍在火焰的消毒伞内。
      注意:建议在火焰附近进行酵母稀释和电镀。板在干燥时很容易被污染。
   10. 在盖上盖子之前让板完全干燥，通常为3-5分钟。
   11. 将板在30°C孵育3天。

4. 数据收集和分析

1. 从培养箱中取出板并目视检查它们。
2. 使用可用的相机或其他数字成像系统记录板的图像。
3. 记录（或评分）每个菌株的最后一个铜浓度可见增长。
   注意:细胞能够拼接并保持活力，直到该浓度。为了保持一致性，请始终使用相同的方法，无论是通过肉眼还是从板图像中，对最后的活性铜浓度进行评分。肉眼有时可以看到非常小的菌落，但在图像上看不到。直接目视检查或从图像记录之间的差异很小，通常是梯度中的一个步骤。由于出版物中经常使用菌落的图像，因此建议按图像进行评分。
4. 结合来自同一菌株的多个ACT1-CUP1测定的数据，得出有关QSP如何影响剪接的结论。
   注意:出版物数字通常显示0 mM Cu²⁺ 浓度的酵母菌落图像，最后一个活铜浓度以及菌落死亡的后续浓度。数据也可以显示为条形图，带有重复之间标准偏差的误差条。数据不需要归一化，但可以通过将WT剪接因子控制的活力设置为1并比较引入的突变的影响来进行归一化。

结果

生长测定，如ACT1-CUP1，需要对多个菌落进行目视比较评估。在这里，将每种菌株在一夜之间生长至饱和，稀释至OD₆₀₀ 为0.5，并镀在含有0 mM至1.1 mM CuSO₄ 铜浓度范围的20个板上（图3）。该范围小于协议中列出的范围，因为它允许全面评估下面使用和描述的QSP和ACT1-CUP1报告的影响。对板进行成像和评分（图 3和 补充表3）。

对于这个代表性的实验，酵母背景包括一个被破坏的 ADE2 基因，导致菌落是不同深浅的红色（图3A，B）。腺苷生产途径中的这种常见酵母破坏导致腺苷的红色色素前体积聚。因此，红色是酵母菌落成熟的指标（即存在的细胞的数量和年龄）。对于ACT1-CUP1测定的目的，红色可以作为污染真菌物种的指示剂，如果颜色为白色或黄色。颜色可以是铜耐受性...

讨论

ACT1-CUP1是一种生长测定，必须注意确保观察到的生长差异只能归因于剪接缺陷。所有菌株在铺板前应以类似的方式处理，包括具有相似的长度和类型的生长和储存条件。如果使用温度敏感菌株，ACT1-CUP1测定应仅在这些菌株生长与野生型相当的条件下进行。相关地，对于QSP成分，建议具有相同的酵母背景和QSP基因的表达水平，以免影响结果的解释。在考虑要使用的QSP和报告器数量时，不建议使用针复制器方法一次检测超过30个菌株。随着执行每个步骤的额外时间，细胞将稳定，并且由于细胞活力降低，测定结果将不一致。

除了ACT1-CUP1作为生长测定固有的限制外，QSP可能对剪接产生比该方法可以解决的更复杂的影响。由于剪接是一个多步骤的过程，并且因子被回收，观察到的表型可能导致扰动影响多个剪接步骤。即使对于可以跟踪ACT1-CUP1的后续分析也是如此，其中一些将在下面描述。数据将突出显示过程中最受干扰的步骤，即使其他步骤可能会受到拼接因子功能改变的影响。

ACT1-CUP1报告基因的引物扩展首先用于Lesser和Guthrie的原始论文，如果AC...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 无菌微量离心管	Fisher Scientific	05-408-129	或其他制造商的类似产品。
2 mL 无菌微量离心管	Fisher Scientific	05-408-138	或其他制造商的类似产品。
50 mL 无菌离心管	Fisher Scientific	07-201-332	或其他制造商的类似产品。
96 孔圆底微孔板	Fisher Scientific	07-200-760	或其他制造商的类似产品。
190 度乙醇	Fisher Scientific	22-032-600	或其他制造商的类似产品。
500 mL 过滤系统（0.22 µm）	CellTreat Scientific 产品	229707	或其他制造商的类似产品。
琼脂	Fisher Scientific	BP1423-500	分子级琼脂都可以。
Autoclave	Tuttnauer	3870EA	或其他制造商的类似产品。
本生灯	Humboldt	PN6200.1	或其他制造商的类似产品。
细胞密度计	VWR	490005-906	或其他可测量 595 nm 处吸光度的光谱设备。
硫酸铜 五水合	物 Fisher Scientific	LC134051	或其他制造商的类似产品。
数字成像系统	Cytiva	29399481	ImageQuant 4000（用于图 3）， Amersham ImageQuant 800 或其他制造商的类似商品。
过滤混合液 （-Leu）	USBiological Life Sciences	D9525	为您的实验使用合适的过滤混合液。您也有可能将酵母营养标记用于您的查询扰动。在这种情况下，脱落混合物应适用于该标记物和 Leu
D-Glucose	Fisher Scientific	AAA1682836	或其他制造商的类似商品。
凝胶条带定量软件	Cytiva	29-0006-05	ImageQuant TL v8.1（用于图 5A）或其他制造商的类似产品。
手持相机	尼康	D3500	或其他制造商的类似产品。
近红外凝胶成像设备	Cytiva	29238583	Amersham Typhoon NIR（用于图 5a）或其他制造商的类似物品。
实验室级夹具	Fisher Scientific	05-769-7Q	或其他制造商的类似产品。
实验室级支架和夹	Fisher Scientific	12-000-101	或其他制造商的类似产品。
磁力搅拌棒	Fisher Scientific	14-513-51	或其他制造商的类似产品。
针式复制器	VP Scientific	VP 407AH
半微量一次性比色皿	VWR	97000-590	或其他制造商的类似产品。
摇床	JEIO Tech	IST-3075	或其他制造商的类似产品。
分光光度计	Biowave	80-3000-45	或任何可以测量 600 nm 处吸光度的分光光度计。
方板	VWR	102091-156	也可以使用圆板，但如果使用销复制器，则更具挑战性。
搅拌板	Fisher Scientific	11-520-16S	或其他制造商的类似产品。
酵母氮基	USBiological Life Sciences	Y2025	或其他制造商的同类产品。