ACT1-CUP1检测确定芽殖酵母剪接体突变体对底物特异性的敏感性

摘要

ACT1-CUP1 检测是一种铜生长检测方法，可快速评估前体信使RNA（pre-mRNA）的剪接情况，以及突变型剪接因子对剪接体功能的影响。本研究提供了一项实验方案，并强调了可根据感兴趣的剪接问题进行定制化的可能性。

摘要

剪接体或其底物中引入的突变极大地促进了我们对剪接体功能复杂性的理解。无论是与疾病相关还是经功能筛选获得，许多此类突变均已在模式生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，酵母）中通过生长实验进行了研究。剪接特异性的铜生长实验，即ACT1-CUP1实验，可在表型水平上对突变进行全面分析。ACT1-CUP1实验利用报告基因系统，当报告基因被正确剪接时，酵母获得铜耐受性。因此，在铜存在条件下，酵母存活能力的变化反映了通过剪接过程产生的mRNA水平的变化。在典型实验中，通过引入不同的非共识剪接报告基因以及感兴趣的剪接因子突变，对酵母剪接体施加挑战，以检测其对剪接产生的协同或拮抗效应。本文提供了铜平板制备、酵母细胞涂布及数据分析的完整操作流程，并介绍了一系列互补实验，突显了ACT1-CUP1报告系统的多功能性。由于能够直接读取突变效应，并且可在该研究领域持续进行比较分析，ACT1-CUP1实验已成为剪接研究工具箱中一种实用且有效的工具。

引言

剪接体是一种大型生物分子机器，可催化前体信使RNA（pre-mRNA）中内含子（非编码区）的移除^1,2。 在研究近100种蛋白质和5种非编码RNA中的某一个组分时，若单独分析该蛋白或RNA，单个点突变效应的表征往往难以明确。 突变组分功能的变化最好在完整且具有活性的剪接体背景下，通过体内（in vivo）实验进行评估。

本文所述的铜诱导生长实验是快速评估酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或芽殖酵母剪接效率的一种方法。该实验由 C.F. Lesser 和 C. Guthrie 开发并于1993年发表，结合了使用简单模式生物操作便捷以及细胞存活率读数直观的优点³。细胞存活率与这些细胞中剪接体识别和剪接报告转录本的能力密切相关。

这种铜生长检测通常被称为ACT1-CUP1检测。名称ACT1-CUP1来源于两个融合基因，用于报告剪接效率。ACT1是酵母的肌动蛋白基因，高度表达且含有一个高效剪接的内含子^4,5。Cup1p是一种铜螯合蛋白，可在细胞内结合铜....

方案

1. 酵母菌株构建

1. 构建或获取一种背景基因为 leu2 和 cup1Δ 的 S. cerevisiae 菌株。构建该背景时，可采用成熟的酵母转化方法，如乙酸锂法结合单链DNA³⁹。
   注意：单倍体酵母菌株可能含有一个、两个或多个 CUP1 拷贝^6,38。设计用于侧翼包围 CUP1 基因位点的敲除引物时，应参考所选酵母菌株的基因组信息。
2. 对酵母进行转化，将QSP通过基因组整合或质粒形式引入。可采用已有成熟方案，例如先前研究中描述的方法^40,41,42。
3. 利用步骤1.2中获得的菌株进行酵母转化，以引入所需的 ACT1-CUP1 报告质粒。
   注意：转化后，细胞必须在缺乏亮氨酸的培养基（-Leu）平板和液体培养基中培养，以确保 ACT1-CUP1 报告质粒的稳定保留。
4. 针对每一个待检测的QSP和每一个ACT1-CUP1报告质粒（包括对照菌株），重复执行步骤1.2....

结果

生长实验（如 ACT1-CUP1）需要对多个菌落进行视觉上的比较评估。在此实验中，每种菌株均在液体培养基中过夜培养至饱和，稀释至 OD₆₀₀ 为 0.5，随后接种于 20 块含有不同浓度铜（从 0 mM 到 1.1 mM CuSO₄）的平板上（图 3）。该浓度范围比方案中列出的范围更小，以便全面评估后续所使用和描述的 QSPs 以及 ACT1-CUP1 报告系统的影响。平板随后被成像并进行评分（图 3 和 补充表 3）。

在本代表性实验中，酵母背景菌株的 ADE2 基因被破坏，导致菌落呈现不同程度的红色（图3A、B）。该基因是腺苷合成通路中常见的敲除位点，其失活会导致红色色素前体物质在细胞内积累。因此，红色深浅可作为酵母菌落成熟度的指标（即反映细胞数量和培养时间）。在 ACT1.......

讨论

ACT1-CUP1 是一种生长检测实验，需特别注意确保所观察到的生长差异仅可归因于剪接缺陷。所有菌株在点板前应以相似的方式处理，包括经历相似时长和类型的生长过程以及储存条件。若使用温度敏感型菌株，ACT1-CUP1 实验应仅在这些菌株的生长状况与野生型相当的条件下进行。类似地，对于 QSP 组分，建议使用相同的酵母背景并保持 QSP 基因表达水平一致，以避免干扰实验结果的解读。在考虑使用的 QSP 和报告基因数量时，不建议每次使用复制平板法同时检测超过 30 个菌株。由于每一步操作所需时间增加，细胞会逐渐沉降，导致细胞活力下降，从而使实验结果不一致。

除了ACT1-CUP1作为生长检测方法本身存在的局限性外，定量剪接分析（QSP）对剪接过程的影响可能比该方法所能解析的更为复杂。由于剪接是一个多步骤过程，且剪接因子会被循环利用，因此观察到的表型可能是由干扰影响了多个剪接步骤所致。这一点即使在后续可对ACT1-CUP1进行补充的分析中也同样成立，其中一些方法如下所述。数据将突出显示受干扰最显著的步骤，尽管剪接因子功能的改变可能也影响了其他步骤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 无菌微量离心管	Fisher Scientific	05-408-129	或不同制造商的同类产品。
2 mL 无菌微量离心管	Fisher Scientific	05-408-138	或不同制造商的同类产品。
50 mL 无菌离心管	Fisher Scientific	07-201-332	或不同制造商的同类产品。
96孔圆底微量培养板	Fisher Scientific	07-200-760	或不同制造商的同类产品。
190 proof 乙醇	Fisher Scientific	22-032-600	或不同制造商的同类产品。
500 mL 过滤系统（0.22 µm）	CellTreat Scientific Products	229707	或不同制造商的同类产品。
琼脂	Fisher Scientific	BP1423-500	任何分子级琼脂均可使用。
高压灭菌器	Tuttnauer	3870EA	或不同制造商的同类产品。
本生灯	Humboldt	PN6200.1	或不同制造商的同类产品。
细胞密度计	VWR	490005-906	或其他可在595 nm波长下测定吸光度的光谱设备。
五水硫酸铜	Fisher Scientific	LC134051	或不同制造商的同类产品。
数字成像系统	Cytiva	29399481	ImageQuant 4000（用于图3）、 Amersham ImageQuant 800，或不同制造商的同类产品。
营养缺陷型混合物（-Leu）	USBiological Life Sciences	D9525	请根据实验选择合适的营养缺陷型混合物。若实验中还使用了其他酵母营养标记物，则应使用针对该标记物和亮氨酸（Leu）的营养缺陷型混合物。
D-葡萄糖	Fisher Scientific	AAA1682836	或不同制造商的同类产品。
凝胶条带定量分析软件	Cytiva	29-0006-05	ImageQuant TL v8.1（用于图5A），或不同制造商的同类产品。
手持式相机	Nikon	D3500	或不同制造商的同类产品。
近红外凝胶成像仪	Cytiva	29238583	Amersham Typhoon NIR（用于图5a），或不同制造商的同类产品。
实验室级夹具	Fisher Scientific	05-769-7Q	或不同制造商的同类产品。
实验室级支架与夹具	Fisher Scientific	12-000-101	或不同制造商的同类产品。
磁力搅拌子	Fisher Scientific	14-513-51	或不同制造商的同类产品。
点样复制器	VP Scientific	VP 407AH
半微量一次性比色皿	VWR	97000-590	或不同制造商的同类产品。
摇床	JEIO Tech	IST-3075	或不同制造商的同类产品。
分光光度计	Biowave	80-3000-45	或任何可在600 nm波长下测定吸光度的分光光度计。
方形培养皿	VWR	102091-156	也可使用圆形培养皿，但若使用点样复制器则操作更具挑战性。
磁力搅拌器	Fisher Scientific	11-520-16S	或不同制造商的同类产品。
酵母氮源基础培养基	USBiological Life Sciences	Y2025	或不同制造商的同类产品。