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方法文章

基于开放搜索策略在Acinetobacter baumannii O-连接糖肽鉴定中的应用

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DOI：

10.3791/63242

⸱

2021年11月2日

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

开放搜索能够鉴定出带有先前未知聚糖组成的糖肽。本文以Acinetobacter baumannii为模型，针对细菌样本提出了一种简化的开放搜索方法，以及后续以聚糖为重点的糖肽搜索策略。

摘要

蛋白质糖基化在细菌生物体中正被越来越多地认为是一种常见的修饰，参与原核生物的生理功能，并有助于致病菌种的最佳感染能力。因此，人们对表征细菌糖基化的研究兴趣日益增长，同时也需要高通量分析工具来鉴定这些糖基化事件。尽管自下而上的蛋白质组学能够轻松产生丰富的糖肽数据，但原核生物中观察到的糖类在广度和多样性上均极高，使得细菌糖基化事件的鉴定极具挑战性。

传统上，细菌蛋白质组数据集中糖链组成的确定依赖人工操作，导致该分析主要局限于特定领域的专家进行定制化处理。近年来，基于开放搜索的方法已成为识别未知修饰的一种强大替代方案。通过分析肽段序列上观察到的独特修饰频率，开放搜索技术能够识别复杂样品中与肽段结合的常见糖链。本文介绍了一种简化的工作流程，用于糖蛋白质组学数据的解读与分析，展示了如何利用开放搜索技术在无需预先了解糖链组成的情况下识别细菌糖肽。

采用该方法可快速鉴定样品中的糖肽，以解析糖基化差异。以Acinetobacter baumannii为模型，这些方法能够比较不同菌株间的聚糖组成，并鉴定出新的糖蛋白。综上所述，本研究展示了开放数据库搜索技术在细菌糖基化鉴定中的广泛适用性，使得对这些高度多样化的糖蛋白组的表征比以往更加便捷。

引言

蛋白质糖基化是指将碳水化合物连接到蛋白质分子上的过程，是自然界中最常见的翻译后修饰（PTMs）之一1,2。在所有生命领域中，已进化出一系列复杂的机制，专门用于生成影响多种细胞功能的糖蛋白1,3,4,5。尽管蛋白质糖基化可发生在多种氨基酸上6,7，但N-连接和O-连接糖基化是自然界中观察到的两种主要形式。N-连接糖基化涉及将聚糖连接至天冬酰胺（Asn）残基的氮原子，而O-连接糖基化则是将聚糖连接至丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）或酪氨酸（Tyr）残基的氧原子7。尽管糖基化系统所靶向的氨基酸残基具有相似性，但连接在蛋白质上的聚糖结构差异使得糖基化成为自然界中化学多样性最丰富的PTM类别。

尽管真核生物的糖基化系统具有聚糖多样性，但这些系统通常在所利用的独特碳水化合物种类数量上受到限制。其产生的多样性主要源于这些碳水化合物在聚糖中的排列方式8,9,10,11,12。相比之下，由于细菌和古菌系统能够生成大量独特的单糖，其聚糖多样性几乎不受限制2,10,13,14,15,16,17。生命不同领域中所观察到的聚糖多样性差异，为糖基化事件的表征与鉴定带来了重大的分析挑战。对于真核生物的糖基化而言，能够预测聚糖组成促进了糖生物学研究的日益增长；然而，细菌的糖基化研究却尚未达到同样水平，目前仍主要局限于少数专业实验室开展。随着质谱（MS）仪器在生物科学领域中的可及性不断提高，基于质谱的方法现已成为糖蛋白质组学分析的主要手段。

质谱（MS）已成为表征糖基化的关键工具，目前常采用自上而下（top-down）和自下而上（bottom-up）两种方法对糖蛋白进行分析6。自上而下的蛋白质组学方法用于评估特定蛋白质的整体糖基化模式18,19，而自下而上的方法则可用于对糖肽进行糖链特异性的表征，即使来源于复杂混合物亦可实现6,20,21,22,23。在糖肽分析中，获得具有信息量的碎片谱图对于糖基化事件的表征至关重要24,25。目前多种碎裂技术已在仪器上常规可用，包括基于共振离子阱的碰撞诱导解离（IT-CID）、束型碰撞诱导解离（CID）以及电子转移解离（ETD）。这些碎裂方法在糖肽分析中各有优缺点25,26，且在过去十年中，将其应用于糖基化分析已取得显著进展6,20。然而，在细菌糖基化分析中，关键限制因素并非糖肽的碎裂能力，而是难以预测样品中可能存在的糖链组成。在这些系统中，由于细菌糖链种类多样且性质未知，限制了糖肽的鉴定，即使目前已有针对真核生物糖肽分析的多种聚焦于糖基化的搜索工具（如 O-Pair27、GlycopeptideGraphMS28 和 GlycReSoft29）被广泛使用。为解决这一问题，需要采用替代性的搜索策略，其中开放性搜索工具的应用已成为研究细菌糖基化的有力手段30。

开放搜索（也称为盲搜或通配符搜索）能够识别具有未知或意外翻译后修饰（PTMs）的肽段21,30,31,32。开放搜索采用多种计算技术，包括 curated 修饰搜索、多步数据库搜索或宽质量容差搜索33,34,35,36,37。尽管开放搜索具有巨大潜力，但其应用通常受到分析时间显著增加以及与限制性搜索相比未修饰肽段检测灵敏度下降的限制31,32。未修饰肽段-谱图匹配（PSMs）检测的减少是由于这些技术伴随的假阳性PSM率升高所致，这需要更严格的过滤以维持期望的假发现率（FDRs）33,34,35,36,37。最近，一些工具的出现显著提高了开放搜索的可及性，包括 Byonic31,38、Open-pFind39、ANN-SoLo40 和 MSFragger21,41。这些工具通过显著缩短分析时间并实施处理异质性糖链组成的方法，实现了对糖基化事件的稳健鉴定。

本文介绍了一种利用开放搜索方法鉴定细菌糖肽的简化流程，并以革兰氏阴性医院感染病原体Acinetobacter baumannii作为模型。A. baumannii具有一个保守的O-连接糖基化系统，该系统负责对多种蛋白质底物进行修饰，称为PglL蛋白糖基化系统42,43,44。尽管不同菌株中被糖基化的靶蛋白相似，但由于介导蛋白糖基化的糖链由荚膜位点（称为K位点）合成，PglL糖基化系统表现出高度变异性44,45,46。这导致来源于单一或有限聚合K单元的多样化糖链（也称为K单元）被添加到蛋白质底物上30,44,46。在本研究中，利用FragPipe软件中的开放搜索工具MSfragger，对A. baumannii不同菌株中的糖链进行鉴定。通过结合开放搜索与人工审校，可开展"以糖链为重点的搜索"，进一步提高细菌糖肽的鉴定效率。该多步骤鉴定策略整体上使得研究人员无需在新糖基化事件表征方面具备丰富经验，即可实现糖肽的有效鉴定。

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方案

注意：细菌糖肽样品的制备与分析可分为四个部分（图1）。 本研究评估了三种已测序的 A. baumannii 菌株的糖基化情况（表1）。各菌株的蛋白质组FASTA数据库可通过Uniprot获取。本实验方案中所用缓冲液的组成见表2。

1. 蛋白质组学分析用蛋白质样品的制备

  1. 目标蛋白质组样品的分离
    1. 若使用完整细胞，需用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，以去除培养基中可能存在的蛋白质污染物。洗涤后迅速冷冻细胞，并于 -80 °C 保存至使用前。
    2. 若使用分步分离的样品（如膜组分制备物），需确保所用试剂不会干扰后续的液相色谱-质谱（LC-MS）分析50.
    3. 如果使用了十二烷基硫酸钠（SDS）、Triton X-100、NP-40 或月桂酰基肌氨酸等去垢剂，需采用丙酮沉淀或 SP3 样品制备方法去除这些去垢剂51或商品化的蛋白质组学纯化柱，例如 S-traps52或者，用与质谱兼容或可去除的去垢剂（如脱氧胆酸钠（SDC）或辛基葡萄糖苷）替代不兼容的去垢剂。
    4. 确保用于样品制备的所有塑料器皿和玻璃器皿均未经过高压灭菌。经高压灭菌的玻璃器皿和塑料制品通常会严重污染小分子量化合物（如聚合物），这些物质在质谱（MS）中极易被检测到。
  2. 全细胞样品的溶解
    1. 将约10 mg洗涤后速冻的细胞重悬于200 µL新鲜配制的脱氧胆酸钠裂解缓冲液（SDC裂解缓冲液：4% SDC溶于100 mM Tris，pH 8.5）中。
      注意：可向 SDC 裂解缓冲液中添加蛋白酶抑制剂以减少蛋白质降解。
    2. 将样品在95 °C下振荡加热10分钟（在恒温混匀仪上以2000 rpm振荡），然后置于冰上10分钟。重复此过程两次，以确保样品充分裂解和溶解。
      注意：样品可在此时于 -80 °C 长期保存。若进行保存，后续处理前需在 95 °C 加热使其重新溶解。
  3. 使用二辛可宁酸（BCA）蛋白质检测试剂盒测定样品蛋白浓度53将样品置于冰上保存，以减少蛋白质降解。
    注意：进行全蛋白质组分析时，20–100 µg 蛋白质已足以满足纳米液相色谱-质谱（nano LC-MS）分析的需求，该分析通常每次仅需少于 2 µg 的蛋白质消化产物。制备过量的肽段可用于重复分析，或在需要深度蛋白质组覆盖时进行进一步分级。若采用亲水相互作用色谱法（HILIC）进行糖肽富集分析，则需要 100–500 µg 蛋白质。
  4. 还原并烷基化样品。
    1. 加入1/10th 加入10×还原/烷基化缓冲液（100 mM Tris 2-羧乙基氯化膦；400 mM 2-氯乙酰胺溶于1 M Tris，pH 8.5），使终浓度为1×，将样品在45 °C、1,500 rpm振荡条件下避光孵育30分钟。
      注意：在将10x还原/烷基化缓冲液加入样品前，需检测其pH值，确保pH约为7.0–8.0，因为较低的pH会导致SDC沉淀。
  5. 短暂离心样品，加入胰蛋白酶/Lys-C（~10 µL，溶于100 mM Tris，pH 8.5），使终浓度的蛋白酶：蛋白质比例为1:100。在37 °C、1,500 rpm振荡条件下孵育消化液过夜（最长18 h）。为确保蛋白质完全消化，可采用1:50至1:200的胰蛋白酶/Lys-C蛋白酶：蛋白质比例。
  6. 通过向样品中加入1.25倍体积的100%异丙醇来终止消化反应。涡旋混匀样品1分钟，然后短暂离心。
    注意：样品可在 -20 °C 保存，以备后续进一步处理。
  7. 加入相当于样品体积0.115倍的10%三氟乙酸（TFA；终浓度约为1% TFA）酸化样品，涡旋混匀后短暂离心。

2. 蛋白质组样品的处理

  1. 蛋白质组样品的肽段纯化
    1. 为每个样品制备一个苯乙烯-二乙烯基苯-反相磺酸盐（SDB-RPS）停止-流动提取（Stage）小柱，方法如前所述54。
      1. 经验上，为结合50 μg肽段，使用钝头针（14 G）从47 mm2 SDB-RPS膜上切下三个SDB-RPS圆片。对于更大肽段量，相应增加圆片数量。
    2. 在使用SDB-RPS Stage小柱前，依次加入至少十个柱床体积的以下缓冲液，并通过离心（25 °C，3 min，500 × g）使缓冲液流经小柱，或使用注射器轻轻施加压力推动缓冲液通过小柱，以完成小柱的预处理。
      1. 用150 µL 100%乙腈润湿小柱。
      2. 用150 µL 30%甲醇、1%三氟乙酸（TFA）溶于18.2 MΩ H2O中洗涤小柱。
      3. 用150 µL 90%异丙醇、1% TFA用18.2 MΩ H2O平衡后平衡小柱。
    3. 通过离心（25 °C，3 min，500 × g）或使用注射器轻轻施加压力，将样品（含50%异丙醇、1% TFA）加载至SDB-RPS Stage小柱上。
    4. 通过离心（25 °C，3 min，500 × g）或使用注射器轻轻施加压力，用以下缓冲液洗涤SDB-RPS Stage小柱。
      注：可使用额外洗涤步骤或替代缓冲液以去除非肽类污染物，例如使用乙酸乙酯替代异丙醇55。
      1. 用150 µL 90%异丙醇、1% TFA洗涤小柱。
      2. 用150 µL 1% TFA溶于18.2 MΩ H2O中洗涤小柱。
    5. 使用150 µL含5%氢氧化铵的80%乙腈溶液，通过离心或使用注射器轻轻施加压力，从SDB-RPS Stage小柱中洗脱肽段。将洗脱液收集至独立离心管中。
      注：使用前立即在通风橱中用塑料容器配制含5%氢氧化铵的80%乙腈溶液。
    6. 在25 °C下通过真空离心干燥洗脱的肽段。
      注：若进行HILIC富集，此时可取肽段洗脱液的1-10%，干燥后作为总蛋白质组输入对照。
  2. 糖肽样品的富集
    1. 制备两性离子亲水相互作用液相色谱（ZIC-HILIC）Stage小柱，方法如前所述54,56。
      1. 简要而言，使用钝头针（14 G）从47 mm2 C8膜上切下一个C8圆片，并将其装入P200吸头中作为筛板。将约5 mm高度的ZIC-HILIC材料（重悬于50%乙腈、50% 18.2 MΩ H2O中）通过注射器轻轻加压加载至筛板上。
    2. 在使用ZIC-HILIC Stage小柱前，通过依次加入以下缓冲液并使用注射器轻轻施加压力，对填料进行预处理。
      ​注：为确保ZIC-HILIC填料表面伪水层的完整性（富集糖肽所必需），填料必须始终保持湿润。洗涤填料时，始终保留约10 µL溶剂在填料上方，并确保洗涤液或样品直接加入该残留溶剂中。
      1. 用20个柱床体积（200 µL）ZIC-HILIC洗脱缓冲液（0.1% TFA溶于18.2 MΩ H2O中）平衡填料。
      2. 用20个柱床体积（200 µL）ZIC-HILIC制备缓冲液（95%乙腈溶于18.2 MΩ H2O中）洗涤填料。
      3. 用20个柱床体积（200 µL）ZIC-HILIC上样/洗涤缓冲液（80%乙腈、1% TFA用18.2 MΩ H2O平衡）洗涤填料。
    3. 将干燥的消化后样品（来自步骤2.1.6）重悬于ZIC-HILIC上样/洗涤缓冲液中，终浓度为4 µg/µL（例如，对于200 µg肽段，用50 µL ZIC-HILIC上样/洗涤缓冲液重悬）。涡旋混匀1分钟以确保样品充分重悬，然后在25 °C下以2,000 × g离心1分钟。
    4. 将重悬的肽段样品加载至已预处理的ZIC-HILIC小柱中。
      1. 使用注射器轻轻施加压力，用20个柱床体积（200 µL）ZIC-HILIC上样/洗涤缓冲液洗涤三次（总计60个柱床体积）。
      2. 用20个柱床体积（200 µL）ZIC-HILIC洗脱缓冲液洗脱糖肽至1.5 mL离心管中，随后在25 °C下通过真空离心干燥洗脱液。

3. 蛋白质组/糖肽富集样品的液相色谱-质谱分析

  1. 用缓冲液 A*（2% 乙腈，0.1% 三氟乙酸）重悬样品，使终浓度达到 1 µg/µL（例如，对于 50 µg 肽段，加入 50 µL 缓冲液 A* 重悬）。
  2. 将样品上样至与质谱仪联用的高效液相色谱/超高效液相色谱（HPLC/UPLC）系统，以实现糖肽的分离与鉴定。
    注意：色谱柱参数，包括内径、长度、流速、色谱树脂类型以及所需上样肽段量，应根据所用分析系统和梯度时间进行优化；有关分析系统优化方法的示例，请参见57。
  3. 监测质谱数据的采集过程，确保数据按照预设参数进行采集。
    注意：对于组成分析，使用碰撞诱导解离（CID）碎裂已足够。由于糖基化修饰的存在，糖肽离子通常比非糖基化肽段具有更高的 m/z 值和更低的电荷密度。为确保这些离子可被检测，应设置 MS1 质量扫描范围为 400 至 2,000 m/z。
  4. 使用 CID 对选定离子进行碎裂，确保采集到包含对糖链结构表征至关重要的氧鎓离子在内的低 m/z 碎片离子。
    注意：糖肽的 CID 碎裂行为受肽段序列、糖链结构以及碎裂能量的共同影响25,58,59。尽管可采用多种不同的碰撞能量，但最优策略是采用阶梯式碰撞能量，即结合使用多个碰撞能量值25,59,60。
  5. 如有条件，可采用其他碎裂方法，例如电子转移解离（ETD）用于糖基化位点定位，或离子阱 CID（IT-CID）辅助确定糖链组成。
    ​注意：这两种碎裂方法对于组成分析并非必需，但可用于进一步深入分析感兴趣的糖肽。

4. 蛋白质组/糖肽富集样品的分析

  1. 预过滤数据文件以在FragPipe中实现搜索
    1. 如果数据集中包含 ETD 或 IT-CID 扫描，请使用 MSConvert 从数据文件中过滤掉这些扫描事件61 在使用 FragPipe 搜索之前。
      注意：对于下述的开放搜索参数，仅需使用束型 CID 数据。
  2. 在FragPipe中执行开放式搜索
    1. 打开FragPipe并点击 工作流程 在工作流程下拉菜单中，选择 开放 搜索选项，然后单击 添加文件 将待搜索的数据文件导入 FragPipe图2A).
    2. 点击 数据库 标签并点击启动下载管理器 下载这允许使用 Uniprot 蛋白质组 ID 从 Uniprot 下载蛋白质组数据库。 点击 添加诱饵蛋白和污染物 选项内的 下载管理器 将诱饵蛋白和污染物蛋白纳入数据库。
    3. 对于更严格的 FDR 阈值，请点击 验证 标签并修改 过滤并报告 值来自 0.01 到 所需的错误发现率.
      注意：FragPipe 的默认设置将确保在蛋白质水平上达到 1% 的错误发现率（FDR）。
    4. 点击 MSfragger 标签。在 峰匹配 盒，增加 前体离子质量容差 从默认的500 Da调整至 2,000 Da 以识别较大的修饰图2A).
    5. 点击 运行 标签，并定义 FragPipe 输出结果的保存位置。点击 运行 单击按钮以开始搜索。
  3. 利用跨数据集鉴定出的PSM（来自FragPipe输出的psm.tsv文件），通过绘制各数据集中观测到的质荷增量（delta masses）频率来识别潜在的糖链结构图3）。使用通过 PRIDE 登录号 PXD027820 获取的 R 脚本，基于 MSfragger 输出结果生成质荷偏差图。 
    注意：这些脚本对开放搜索结果仅进行 minimal 后处理，因为这些脚本的主要目的是辅助可视化 delta mass 谱型。重要的是，仅观察到丰富的 delta mass 并不能证明该修饰可能是糖链，因为将 delta mass 鉴定为糖链需要对相应的 MS2 事件进行进一步分析。
  4. 为实现对样品中糖肽的表征，应重点关注高置信度的质荷偏差（delta mass）鉴定结果，这些结果对应于高超评分（hyperscore）的匹配项。
    1. 为辅助评估糖肽谱图，可使用肽段注释工具，例如 Interactive Peptide Spectral Annotator63，这能够实现肽段相关离子在谱图中的指认，从而允许手动识别糖链相关离子（图4).
      注意：在本文提供的数据集中，高分值 >30 被视为高分，因为这些分数位于所有已鉴定糖肽的前 50% 范围内（图5).
  5. 在确定高置信度的糖肽后，识别常观察到的糖链相关离子（图4以提高糖肽的鉴定能力。
    注意：通过在搜索中纳入与聚糖相关的离子（称为聚糖聚焦搜索），可提高糖肽鉴定的准确性。
    1. 点击 MSfragger FragPipe 选项卡中，将观察到的糖链的确定质量差值纳入 可变修饰 和 质量偏移 切片。通过在输入框中键入数值来添加这些质量 可变修饰 和 质量偏移 质量分离的各个部分 /. 将这些糖链的糖链相关碎片质量加入到 糖基化/不稳定修饰 MSFragger 的部分
      注意： 图2B 概述了进行糖类靶向搜索所需的关键信息 A. baumannii 菌株 AB307-0294
  6. 将与蛋白质组学研究相关的所有质谱数据上传至集中式蛋白质组学数据库，例如 PRIDE 或 MASSIVE 数据库。
    注：本研究相关的所有数据均已存入 PRIDE 蛋白质组学数据库，可通过 PRIDE 登录号 PXD027820 获取。

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结果

为了说明开放搜索在细菌糖肽分析中的应用价值，本研究评估了三种 A. baumannii 菌株 AB307-0294、ACICU 和 D1279779 的 O-连接糖链的化学多样性。A. baumannii 不同菌株间的 O-连接糖蛋白组具有高度变异性，这是因为参与糖基化的糖链来源于高度可变的荚膜基因座44,45,46。这种化学多样性使得 A. baumannii 成为开展开放搜索研究的理想模型系统。尽管此前尚未对这三种菌株的糖蛋白组进行过评估，但其中两种菌株 AB307-029464 和 ACICU65 的荚膜结构已被阐明，而 D1279779 菌株的荚膜结构仍有待解析。

与AB307-0294的荚膜一致，对AB3...

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讨论

开放搜索是一种用于鉴定未知修饰的有效且系统的方法。虽然在细菌蛋白质组样本中鉴定未知糖链传统上是一项耗时且技术要求较高的工作，但近年来诸如MSfragger21,41和Byonic31,38等工具的发展使得能够快速有效地鉴定出可能与肽段结合的潜在糖链所对应的增量质量（delta masses），从而进一步表征。对标准蛋白质组样本以及糖肽富集后的蛋白质组样本进行开放搜索，均可鉴定出潜在的糖肽（图1）。许多细菌系统中糖肽具有较高的普遍性和丰度，使得无需糖肽富集即可直接检测这些修饰6。尽管对于许多糖基化系统而言，糖肽富集方法的性能通常仍优于非富集方法70，但值得注意的是，并非所有糖链都同样适用于富集策略71

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致谢

N.E.S 获得了澳大利亚研究理事会未来奖学金（FT200100270）和ARC发现项目资助（DP210100362）的支持。我们感谢生物21分子科学与生物技术研究所的墨尔本质谱与蛋白质组学平台提供质谱仪器的使用机会。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
14 G Kel-F Hub 点样式 3Hamilton 公司hanc90514
2-氯乙酰胺Sigma Aldrich Pty LtdC0267-100G
乙腈Sigma Aldrich Pty Ltd34851-4L
氢氧化铵 (28%)Sigma Aldrich Pty Ltd338818-100ML
BCA 蛋白检测试剂 APierce23228
BCA 蛋白检测试剂 BPierce23224
C8 Empore 固相萃取柱Sigma Aldrich Pty Ltd66882-UC8 材料的替代供应商为 Affinisep（https://www.affinisep.com/about-us/）
甲酸Sigma Aldrich Pty Ltd5.33002
异丙醇Sigma Aldrich Pty Ltd650447-2.5L
甲醇Fisher ChemicalM/4058/17
SDB-RPS Empore 固相萃取柱（反相磺酸盐）Sigma Aldrich Pty Ltd66886-USDB-RPS 材料的替代供应商为 Affinisep（https://www.affinisep.com/about-us/）
脱氧胆酸钠Sigma Aldrich Pty LtdD6750-100G
ThermoMixer CEppendorf2232000083
三氟乙酸Sigma Aldrich Pty Ltd302031-10X1ML
三(2-羧乙基)膦盐酸盐Sigma Aldrich Pty LtdC4706-2G
三(羟甲基)氨基甲烷Sigma Aldrich Pty Ltd252859-500G
胰蛋白酶/赖氨酰内肽酶蛋白酶混合物PromegaV5073
真空浓缩仪Labconco7810040
ZIC-HILIC 材料Merck1504580001可用于一次性固相萃取柱的树脂可通过将大规格柱中的填料倒出并使用游离树脂获得

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基于开放搜索策略在Acinetobacter baumannii O-连接糖肽鉴定中的应用
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