本文介绍了一种改进的趋化性检测实验方案。该方案旨在减少传统细菌趋化性方法的操作步骤和成本，为研究植物-微生物相互作用提供有价值的资源。
本文内容
摘要
摘要
趋化性鉴定对于根际促生细菌的研究与应用具有重要意义。我们建立了一种简便的方法，通过简单的步骤在无菌载玻片上快速鉴定能够诱导根际促生细菌趋化运动的化学引诱物。via 将细菌溶液（OD600 = 0.5）和无菌化学引诱物水溶液分别以相隔1 cm的距离滴加到载玻片上，再用接种环将化学引诱物水溶液与细菌溶液连接。将载玻片置于洁净工作台中室温静置20分钟，最后收集化学引诱物水溶液进行细菌计数和显微观察。本研究通过多次实验结果的比较，表明该方法克服了传统细菌趋化性实验方法的多种不足，减少了平板计数的误差，缩短了实验周期。在化学引诱物物质的鉴定方面，与传统方法相比，该新方法可节省2-3天时间。此外，该方法使任何研究人员均可在1-2天内系统完成一次细菌趋化性实验。该实验方案可作为研究植物-微生物互作的重要工具。
引言
趋化性对于植物促生根际细菌（PGPR）在根部的定殖以及理解植物-微生物相互作用具有重要意义1植物根系分泌物中的一类低分子量化合物（趋化性吸引物）可诱导植物根际促生菌向根际的趋化运动2苹果酸、柠檬酸及根系分泌物中的其他组分可刺激趋化性 芽孢杆菌属 菌株3例如，玉米根系分泌物中的葡萄糖、柠檬酸和延胡索酸能够招募细菌 根面4D-半乳糖, 哪个 源自根系分泌物，可诱导趋化性 Bacillus velezensis SQR95有机酸（包括延胡索酸、苹果酸和琥珀酸）影响多种植物根际促生菌的趋化性和定殖能力 Cajanus cajan - 玉米间作系统6水稻根系分泌物中的齐墩果酸对菌株FP35具有化学趋吸引作用7其他植物渗出物（包括组氨酸、精氨酸和天冬氨酸）在细菌的趋化反应中可能发挥关键作用8植物渗出物作为信号分子，可引导细菌的定向移动，这是根际定殖的第一步。植物根际促生菌（PGPR）对植物宿主具有促进生长等有益作用，因此PGPR对植物的定殖过程具有重要意义。
已有多种方法用于分析细菌趋化性。泳动平板法是先前描述的方法之一9。该方法使用半固体培养基制备平板，将含琼脂（1.0%，w/v）的趋化缓冲液加入平板中，加热后与趋化吸引物混合。然后将8 µL细菌悬液滴加至平板中央，将平板置于28 °C培养箱中。定期观察并拍照记录。然而，泳动平板法的实验周期非常长。在类毛细管法10中，移液器吸头用作盛装100 µL细菌悬液的腔室，1 mL注射器针头作为毛细管。将含有不同浓度梯度趋化吸引物的注射器针头插入100 µL移液器吸头中。室温孵育3小时后，取出注射器针头，内容物经稀释后接种于培养基上。通过平板上的菌落形成单位（CFUs）表示注射器内细菌的聚集情况。然而，类毛细管法在重复实验间的实验误差较大。另一种方法采用了微流控SlipChip装置11。简言之，将牛血清白蛋白（BSA）溶液注入所有通道，并用真空泵抽除。随后分别向顶部、中部和底部微孔中加入含不同趋化吸引物的溶液（仅用于定性检测时浓度为1 mM）、磷酸盐缓冲液悬浮的细菌细胞以及磷酸盐缓冲液（阴性对照）。然后在室温避光条件下孵育30分钟，随后检测微孔中的细菌细胞。然而，微流控SlipChip装置成本较高。因此，上述每种方法均各有优缺点。
我们建立了一种改进的趋化性检测方法，利用无菌载玻片快速鉴定根系分泌物中的根际细菌趋化物，无需复杂步骤。本研究通过多次比较实验结果，证明该方法克服了传统细菌趋化性实验方法的多种缺陷。该方法降低了平板计数的误差，并缩短了实验周期。因此，若用于鉴定趋化性物质，此新方法可节省2-3天时间，并降低实验材料成本。
方案
1. 材料与设备
注意：Bacillus altitudinis LZP02 (CP075052) 在本研究中分离自中国东北水稻的根际12,13。
- 在LB培养基（胰蛋白胨 10 g L-1；NaCl 8 g L-1；酵母提取物 5 g L-1）中培养 B. altitudinis LZP02 菌株 10 小时。于 4 °C 条件下，以 9,569 × g 离心 2 分钟收集菌体，并用含 15% 甘油的溶液于 -80 °C 保存。
注：本实验所用水稻种子（Oryza sativa Longgeng 46）由黑龙江省农业科学院水稻研究所提供。
2. 根系分泌物的收集
- 将水稻种子随机放置于人工气候室中。
注意：水稻种子使用30% H2O2 消毒30分钟，并在水中浸泡过夜。培养条件如下：控制光照（16/8小时光暗循环）、温度（22 ± 2 °C）和相对湿度（῀70%）。 - 培养水稻种子一周，并添加无菌水两次。
- 选取大小相近的水稻幼苗，种植于50 mL的Murashige和Skoog（MS）液体培养基中。在22 °C下，于无菌条件下培养48小时。
注意：水稻根系分泌物将释放到MS培养基中14,15,16。
3. 根系分泌物的液相色谱-质谱分析
- 收集 100 µL 样品（含根系分泌物的MS培养基）置于1.5 mL离心管中。加入 20 µL 加入提取溶剂（乙腈-甲醇-水，2:2:1，含内标），在45 Hz条件下均质化样品4分钟，随后在冰浴中超声处理5分钟。
- 重复匀浆和超声处理循环三次。将样品在 -20 °C 1小时，随后在133,778 x g 和 4 °C 15分钟。
- 将所得上清液转移至液相色谱-质谱小瓶中，并于 -80 °C 直至进行UHPLC-QE分析。通过混合所有样品上清液的等量部分制备质量控制（QC）样品。
注意：每个样品的体积为 600 µL （每次实验设六个重复） - 使用超高效液相色谱系统（UHPLC）和UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm × 100 mm）进行LC-MS/MS分析， 1.8 µm）和 Q Exactive12.
- 使用0.1%甲酸水溶液和5 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相A，乙腈作为流动相B。分别使用甲酸和乙酸铵作为正离子和负离子模式。
- 洗脱梯度设置如下：0 分钟，1% B；1 分钟，1% B；8 分钟，99% B；10 分钟，99% B；10.1 分钟，1% B；12 分钟，1% B。流速和进样量分别设置为 0.5 mL/min 和 2 µL分别。
注意：大分子（>1,000 道尔顿）无法被检测到。
4. 趋化性实验
- 制备趋化剂水溶液，确保其无菌。使用0.22 µm细菌滤器过滤趋化剂溶液。
注：趋化剂水溶液为通过液相色谱-质谱（LC-MS）研究获得的单一物质溶于水所得。浓度和体积可根据不同实验适当调整。此处以柠檬酸溶液为例。所有操作均需在灯旁进行。 - 在玻璃载片上以1 cm间隔标记中心位置。确保玻璃载片已在火焰上多次灭菌。
- 在玻璃载片左侧加入30 µL趋化剂溶液。确保细菌已在LB培养基中培养至对数生长期（2 × 108 CFU/mL）。在玻璃载片右侧加入30 µL菌液。
注：设置阴性对照组，加入等体积无菌水。使用生理盐水（0.9% NaCl）作为阳性对照，以排除分子间作用力对实验结果的影响。 - 将接种环在火焰上多次灭菌。用接种环连接趋化剂水溶液与菌液，并在洁净台中室温静置20分钟。
注：实验必须在无风环境中进行。根据不同菌株的运动能力，可适当调整断开连接线前的静置时间。 - 20分钟后，用滤纸断开连接线。
- 确保1.5 mL离心管无菌。收集玻璃载片左侧的趋化剂水溶液，并转移至1.5 mL无菌离心管中。
- 向离心管中加入适量体积的沙黄染液。2分钟后，取混匀液体，使用血细胞计数板进行细菌计数和显微镜观察。
5. 结果分析
- 使用以下公式计算被吸引的可存活微生物数量：
其中 NBC：细菌细胞总数；N：80 个格内的细菌数量。
注意：采用统计分析软件进行数据分析。误差基于三次独立重复实验值，通过单因素方差分析（one-way ANOVA）及 Turkey 事后检验（post-hoc analysis）计算得出。当 P ≤ 0.05 时认为差异具有统计学意义。
结果
在正离子模式和负离子模式下分别检测到584种和937种已知代谢物。既往研究表明，趋化因子通常是有机酸、氨基酸和碳水化合物17,18。
本研究从水稻根际分泌物的液相色谱-质谱（LC-MS）分析中筛选出16种化学引诱物用于后续实验（表1）。采用泳动平板法，筛选水稻根部分泌的低分子量化合物中对根际B. altitudinis LZP02具有趋化吸引作用的物质。为比较不同化学引诱物的趋化能力，引入趋化指数（RCI），即处理组细菌数量与相应对照组的比值19。RCI值越高，表明对引诱物的趋化反应越强。结果表明，100 µM柠檬酸（RCI = 2.34）和100 µM咖啡酸（RCI = 1.85）的趋化指数最高（图2）。代表性图像显示，与对照组（CK）相比，柠檬酸和咖啡酸周围的菌群聚集区域更大（图3）。
采用新的趋化性检测方法（图1）结果显示，柠檬酸、咖啡酸和半乳糖实验组（100 µM）的细菌浓度显著高于阴性对照组和阳性对照组。其中，柠檬酸的趋化吸引力最强。实验结果（图4 和 表2）与传统游动平板法的结果（图2）一致。新的趋化性检测的代表性显微图像见 图5。
与泳动平板法相比，我们的结果证实了新趋化性检测方法的可行性。该技术可显著节省时间，降低试剂成本，并减少结果误差。新方法的结果直观，且能够显示细菌的运动能力。
图 1：新型趋化实验的示意图。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：泳动平板法的结果。（A）B. altitudinis LZP02 对有机酸、酚酸和碳水化合物浓度递增的趋化反应。（B）B. altitudinis LZP02 对氨基酸浓度递增的趋化反应。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：泳动平板法结果。 比较B. altitudinis LZP02 对有机酸的趋化响应。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：新型趋化性检测方法的结果。 NBC：细菌细胞总数。B. altitudinis LZP02 对柠檬酸、咖啡酸和半乳糖浓度递增的趋化反应。结果表示为每次测定至少三次重复实验的平均值。误差线表示基于三次不同重复实验值的标准差（SD）。根据单因素方差分析（one-way ANOVA）及后续 Turkey 检验，不同字母标记的柱子在 P ≤ 0.05 水平上差异显著。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：新型趋化性检测方法的结果。 图像在光学显微镜下获得。（A）CK，（B）生理盐水溶液，（C）柠檬酸。请点击此处查看该图的放大版本。
| 索引 | 名称 | 得分 | 丰度 |
| POS01062 | Citric acid | 0 | 200471.6 |
| NEG00016 | Malic acid | 0.9944492 | 2093440.97 |
| NEG00038 | 2,5-dihydroxybenzoic acid | 0.8886685 | 114774.98 |
| POS01763 | Caffeic acid | 0 | 6195.5 |
| POS00154 | Ferulic acid | 0.4725294 | 12723.95 |
| POS02156 | Fructose | 0 | 6767.81 |
| POS01289 | Galactose | 0 | 871476.14 |
| NEG00021 | Mannose | 0.9898174 | 683176.34 |
| POS00037 | Valine | 0.9660872 | 5985865.24 |
| POS00018 | Proline | 0.9887274 | 2739147.17 |
| POS00124 | Phenylalanine | 0.6106034 | 11940645.8 |
| POS00092 | Glycine | 0.7418478 | 22787114.1 |
| POS00079 | Threonine | 0.8086754 | 1039040.18 |
| NEG00010 | Leucine | 0.9962673 | 3546561.95 |
| POS00266 | Histidine | 0 | 3010220.41 |
| POS01993 | Serine | 0 | 645602.04 |
| 注：第一列中的 POS 和 NEG 分别表示正离子和负离子索引。第三列表示使用二级质谱进行数据库匹配打分，未打分的趋化物质则通过一级质谱进行匹配。得分范围为 0 到 1。 | |||
表1：通过LC-MS研究在水稻根际分泌物中鉴定出的16种化学吸引物。
| 趋化剂 | RCI |
| NaCl | 1.95±0.03 |
| 柠檬酸 | 3.63±0.12 |
| 咖啡酸 | 2.71±0.26 |
| 半乳糖 | 2.56±0.16 |
表2：新型趋化性检测方法的趋化性指数（RCI）。
讨论
越来越多的研究表明，植物与细菌的相互作用主要发生在根际，并受到根系分泌物的影响20,21,22,23,24。植物根系分泌物包含多种初级代谢物，如酚酸、有机酸和氨基酸，以及更复杂的次生代谢产物25,26,27。对于每一种细菌而言，根际分泌物中的特定物质已被证明具有招募作用。在该研究领域中，文献报道的许多趋化性方法高度依赖于具体的检测体系。已有多种方法的报道，各自具有特定的优势与局限性。
在本研究中，我们重点介绍了一种改进的趋化性实验方法，用于快速鉴定根系分泌物中根际细菌的化学引诱物。本实验方案的所有步骤均在无菌条件下进行。在第4步中，我们使用接种环将化学引诱物水溶液与细菌溶液连接，并将载玻片在室温下静置20分钟。需要注意的是，连接线的宽度应控制在约2 mm，且实验必须在无风环境中进行。
应根据所使用的实验菌株进行适当的调整。对数生长期的选择应依据不同菌株的生长周期而定。对于具有不同群集运动能力的菌株，可在断开连接管路前适当调整培养时间。体型较小、在光学显微镜下无法观察的细菌不适用于本方法。例如，纳米细菌直径可小至80 nm，只能通过电子显微镜观察。本方法适用于具有鞭毛的菌株。
新方法降低了平板计数的误差，并缩短了实验周期。在趋化物质的鉴定中，新方法可节省2-3天时间。新方法使任何研究人员均可在1-2天内系统地完成一次细菌趋化实验。与微流控装置相比，新方法成本更低。该实验方案还克服了传统细菌趋化方法的一些缺点。此外，新方法还可应用于多种其他场景。例如，可利用该方法快速鉴定受特定植物根系分泌物信号刺激的土壤细菌。新方法设计简单、操作便捷，具有很高的应用价值。本实验方案可作为研究和理解植物-微生物相互作用的宝贵资源。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到中国国家自然科学基金（编号31870493）、中国黑龙江重点研发项目（GA21B007）和中国黑龙江省高校基础研究经费（编号135409103）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,5-二羟基苯甲酸 | 北京英诺化学科技有限公司 & Technology C.,Ltd. | 490-79-9 | |
| 乙腈 | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| 乙酸铵 | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| 咖啡酸 | 北京英诺科创科学 & Technology C.,Ltd. | 331-39-5 | |
| 离心 | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| 柠檬酸 | 北京英诺恒盛科技有限公司 & Technology C.,Ltd. | 77-92-9 | |
| 洁净台 | 上海博迅工业有限公司 | BJ-CD | |
| 阿魏酸 | 北京英诺恒芯科技有限公司 & Technology C.,Ltd. | 1135-24-6 | |
| 甲酸 | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| 果糖 | 北京英诺科创学 & Technology C.,Ltd. | 57-48-7 | |
| 半乳糖 | 北京英诺化学科技有限公司 & Technology C.,Ltd. | 59-23-4 | |
| 甘氨酸 | 北京英诺科创科技 & Technology C.,Ltd. | 56-40-6 | |
| 研磨机 | 上海精信工业发展 有限公司 | JXFSTPRP-24 | |
| 组氨酸 | 北京英诺恒生科技有限公司 & Technology C.,Ltd. | 71-00-1 | |
| 内标物：2-氯-L-苯丙氨酸 | 上海恒百生物科技有限公司 | 103616-89-3 | |
| 亮氨酸 | 北京英诺科创科技有限公司 & Technology C.,Ltd. | 61-90-5 | |
| 苹果酸 | 北京英诺恒生科技有限公司 & Technology C., Ltd. | 6915-15-7 | |
| 甘露糖 | 北京英诺恒盛科技有限公司 & Technology C.,Ltd. | 3458-28-4 | |
| 质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive Focus | |
| 甲醇 | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| 光学显微镜 | Olympus | BX43 | |
| 苯丙氨酸 | 北京英诺化学科技有限公司 & Technology C.,Ltd. | 63-91-2 | |
| 脯氨酸 | 北京英诺科创学 & Technology C.,Ltd. | 147-85-3 | |
| 刻度 | 赛多利斯 | BSA124S-CW | |
| 丝氨酸 | 北京英诺科创科学 & Technology C.,Ltd. | 56-45-1 | |
| 苏氨酸 | 北京英诺科创科学 & Technology C.,Ltd. | 72-19-5 | |
| UHPLC | 安捷伦 | 1290 UHPLC | |
| 超声波仪器 | 深圳雷德邦电子 有限公司 | PS-60AL | |
| 缬氨酸 | 北京英诺化学科技有限公司 & Technology C.,Ltd. | 7004-03-7 |
参考文献
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends in Microbiology. 22 (9), 517-527 (2014).
- Haichar, Z., Santaella, C., Heulin, T., Achouak, W. Root exudates mediated interactions belowground. Soil Biology and Biochemistry. 77 (7), 69-80 (2014).
- Zhang, N., et al. Effects of different plant root exudates and their organic acid components on chemotaxis, biofilm formation and colonization by beneficial rhizosphere-associated bacterial strains. Plant and Soil. 374 (1-2), 689-700 (2014).
- Zhang, N., et al. Whole transcriptomic analysis of the plant-beneficial rhizobacterium Bacillus amyloliquefaciens SQR9 during enhanced biofilm formation regulated by maize root exudates. BMC Genomics. 16 (1), 685(2015).
- Lui, Y., et al. Induced root-secreted D-galactose functions as a chemoattractant and enhances the biofilm formation of Bacillus velezensis SQR9 in an mcpa-dependent manner. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (17), 785-797 (2020).
- Vora, S. M., Joshi, P., Belwalkar, M., Archana, G. Root exudates influence chemotaxis and colonization of diverse plant growth-promoting rhizobacteria in the Cajanus cajan - Zea mays intercropping system. Rhizosphere. 18 (12), 100331(2021).
- Sampedro, I., et al. Effects of halophyte root exudates and their components on chemotaxis, biofilm formation and colonization of the halophilic bacterium halomonas anticariensis FP35T. Microorganisms. 8 (4), 575(2020).
- Liu, X. L., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. A dual role amino acid from sesbania rostrata seed exudates in the chemotaxis response of Azorhizobium caulinodans ORS571. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1134-1147 (2019).
- Ling, N., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. Identification and role of organic acids in watermelon root exudates for recruiting Paenibacillus polymyxa SQR-21 in the rhizosphere. European Journal of Soil Biology. 47 (6), 374-379 (2011).
- Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiology. 148 (3), 1547-1556 (2008).
- Shen, C., et al. Bacterial chemotaxis on Slipchip. Lab on a Chip. 14 (16), 3074-3080 (2014).
- Liu, H., et al. Bacillus pumilus LZP02 promotes rice root growth by improving carbohydrate metabolism and phenylpropanoid biosynthesis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (10), 1222-1231 (2020).
- Goswami, M., Deka, S. Isolation of a novel rhizobacteria having multiple plant growth promoting traits and antifungal activity against certain phytopathogens. Microbiological Research. 240, 126516(2020).
- Kaiira, M., Chemining'Wa, G., Ayuke, F., Baguma, Y., Nganga, F. Profiles of compounds in root exudates of rice, cymbopogon, desmodium, mucuna and maize. Journal of Agricultural Sciences Belgrade. 64 (4), 399-412 (2019).
- Shi, Y., et al. Effect of rice root exudates and strain combination on biofilm formation of Paenibacillus polymyxa and Paenibacillus macerans. African Journal of Microbiology Research. 6 (13), 3343-3347 (2012).
- Lee, H. W., Ghimire, S. R., Shin, D. H., Lee, I. J., Kim, K. U. Allelopathic effect of the root exudates of K21, a potent allelopathic rice. Weed Biology and Management. 8 (2), 85-90 (2008).
- Belimov, A. A., et al. Rhizobacteria that produce auxins and contain 1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid deaminase decrease amino acid concentrations in the rhizosphere and improve growth and yield of well-watered and water-limited potato (Solanum tuberosum). Annals of Applied Biology. 167 (1), 11-25 (2015).
- Ankati, S., Podile, A. R. Metabolites in the root exudates of groundnut change during interaction with plant growth promoting rhizobacteria in a strain-specific manner. Journal of Plant Physiology. 243, 153057(2019).
- Gordillo, F., Chavez, F., Jerez, C. A. Motility and chemotaxis of Pseudomonas sp. B4 towards polychlorobiphenyls and chlorobenzoates. FEMS Microbiology Ecology. 60 (2), 322-328 (2007).
- Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annual Review of Plant Biology. 57, 233-266 (2006).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Badri, D. V., Weir, T. L., Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: plant-microbe interactions. Curr Opin Biotech. Current Opinion in Biotechnology. 20 (6), 642-650 (2009).
- Kamilova, F., Kravchenko, L. V., Shaposhnikov, A. I., Makarova, N., Lugtenberg, B. Effects of the tomato pathogen Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and of the biocontrol bacterium Pseudomonas fluorescens WCS365. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (10), 1121-1126 (2006).
- Kamilova, F., et al. Organic acids, sugars, and L-tryptophane in exudates of vegetables growing on stonewool and their effects on activities of rhizosphere bacteria. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (3), 250-256 (2006).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Hao, W. Y., Ren, L. X., Ran, W., Shen, Q. R. Allelopathic effects of root exudates from watermelon and rice plants on Fusarium oxysporum f.sp. Niveum. Plant and Soil. 336 (1-2), 485-497 (2010).
- Hao, Z. P., Wang, Q., Christie, P., Li, X. L. Allelopathic potential of watermelon tissues and root exudates. Scientia Horticulturae. 112 (3), 315-320 (2007).
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