方法文章

使用茜素红染色检测化学诱导的斑马鱼幼鱼骨量减少

DOI：

10.3791/63251

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2021年12月28日

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1Department of Toxicology, School of Public Health, Jiangsu Key Laboratory of Preventive and Translational Medicine for Geriatric Diseases, Medical College of Soochow University, 2Department of Occupational Disease Prevention, Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention, 3Jiangsu Preventive Medicine Association, Nanjing, China

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在此，我们采用茜素红染色法证明乙酸铅暴露可导致斑马鱼幼鱼的骨量发生变化。该染色方法可适用于研究其他有害毒物诱导的斑马鱼幼鱼骨量减少。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

铅（Pb）暴露引起的化学性骨质流失可能对人类和动物的骨骼系统造成一系列不良影响。然而，其在斑马鱼中的具体效应及作用机制尚不明确。茜素红对钙离子具有高亲和力，可用于可视化骨骼并显示骨骼矿化质量。本研究旨在通过茜素红染色法检测醋酸铅（PbAc）诱导的斑马鱼幼鱼骨质流失。斑马鱼胚胎在受精后2至120小时期间，暴露于一系列浓度的PbAc（0、5、10、20 mg/L）中。在受精后第9天对幼鱼进行整体骨骼染色，并使用ImageJ软件定量分析总染色面积。结果显示，矿化组织呈红色染色，PbAc暴露组的染色面积显著减少，且骨骼矿化程度呈现剂量依赖性变化。本文提供了一种用于研究PbAc诱导骨骼缺陷中骨骼变化的染色方案。该方法也可用于斑马鱼幼鱼中其他化学物质诱导骨质流失的检测。

引言

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近期研究表明，由糖皮质激素、芳香化酶抑制剂以及过量饮酒引起的骨质疏松较为常见1,2。铅（Pb）是一种存在于植物、土壤和水生环境中的有毒金属3。尽管铅对人體有害的影响已受到广泛关注，但其对骨骼的不可逆影响仍需进一步研究。铅中毒可导致发育中及成年骨骼发生多种病理改变，影响正常的生理活动。研究发现，长期暴露于铅环境与骨损伤之间存在关联4，包括骨结构受损5,6、骨矿物质密度降低，甚至骨质疏松风险增加7。

矿化组织对骨强度具有重要意义8，骨矿化基质的沉积是评价骨形成的关键指标9。茜素红对钙离子具有高亲和力，茜素红染色是评估骨形成的常规方法10。根据该方法，矿化组织被染成红色，而其他所有组织保持透明。随后通过数字图像分析对染色区域进行定量11。

斑马鱼是一种重要的模式生物，广泛应用于药物发现和疾病模型研究。斑马鱼与人类的遗传学研究表明，两者在骨骼形态发生分子机制方面具有相似性12。此外，与小鼠模型相比，斑马鱼的大规模繁殖特性使其更适用于高通量药物或生物分子筛选，从而促进对促成骨或成骨毒性分子的作用机制研究13。整体骨骼差异染色法in toto10常用于研究小型脊椎动物及哺乳动物胎儿的骨骼发育异常。本研究采用茜素红染色法，以检测化学物质对斑马鱼幼体骨骼发育的毒性作用。本文以铅为例，介绍一种用于检测醋酸铅诱导斑马鱼幼体骨骼缺陷的实验方案。

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方案

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本文所述所有动物实验程序均已通过苏州大学伦理委员会动物护理研究所的审查和批准。

1. 鱼类饲养与胚胎收集 14

  1. 每天喂鱼三次；确保斑马鱼在28.5 ± 0.5 °C条件下饲养，并保持14小时光照与10小时黑暗的光周期。
  2. 傍晚时，在产卵缸中使用隔离板按2:1的雄雌比例将成年雄鱼和雌鱼分开。
  3. 次日上午9:00移除隔离板，并在2小时后收集胚胎。
  4. 将胚胎置于维持在28.5 °C的生化培养箱中，等待实验开始。

2. 化学暴露

  1. 制备母液：称取乙酸铅三水合物（5 g），溶于超纯水（50 mL）中，搅拌至溶解。
    警告：乙酸铅（PbAc）具有毒性。操作时需佩戴合适的防尘口罩、防护服和手套，并在通风橱内进行实验。
  2. 选取斑马鱼胚胎，随机分配至洁净的6孔板中（每孔30个胚胎，加入3 mL斑马鱼养殖用水；其成分见表1），自受精后2小时（hpf）至120小时期间，分别暴露于不同浓度的PbAc溶液（0、5、10、20 mg/L）。
    注意：PbAc的浓度选择依据剂量预实验结果。实验结果显示，在120 hpf时，乙酸铅对斑马鱼胚胎的LC50为41.044 mg/L。因此，最高浓度设定为LC50的一半，并通过2倍梯度稀释法配制一系列浓度溶液。
  3. 从受精后第5天（dpf）开始，每日喂食幼鱼两次。将斑马鱼胚胎维持在28.5 ± 0.5 °C条件下，光照周期为14小时光照/10小时黑暗。
  4. 每隔24小时更换一次不含铅的培养基（斑马鱼养殖用水），直至9 dpf。
    ​注意：实验结束后，所有含铅溶液均需倒入指定液体废液桶，由实验管理中心统一处理。

3. 茜素红染色

注意：在整个染色过程中，请佩戴合适的防尘口罩、防护服和手套。所有溶液的组成见表1。

  1. 特定染色步骤
    注意：染色过程在24孔板中于室温下进行。每次加入溶液后，将24孔板置于低速摇床上。
    1. 在9 dpf时，从每组中随机取出10条斑马鱼幼鱼，用1 mL的2%多聚甲醛/1×磷酸盐缓冲液固定2小时。
    2. 倾去溶液，用100 mM Tris-HCl (pH 7.5)/10 mM MgCl2洗涤斑马鱼幼鱼10分钟。
    3. 倾去溶液，将幼鱼依次浸入以下溶液中各5分钟以进行脱色：无水乙醇（EtOH）溶液（80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7.5)/10 mM MgCl2）、50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7.5) 和 25% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7.5)。
    4. 倾去溶液，用含3% H2O2和0.5% KOH的溶液漂白去除色素，每10分钟观察一次，直至色素完全去除。
    5. 用25%甘油/0.1% KOH多次冲洗斑马鱼幼鱼，每次10分钟，直至无气泡产生。
      注意：必须避免产生气泡；否则，斑马鱼体内的气泡将在显微镜下呈现为黑色视野，影响观察和定量分析。
    6. 将幼鱼浸入1 mL的0.01%茜素溶液中染色50分钟。
    7. 倾去溶液，加入1 mL的50%甘油/0.1% KOH处理10分钟以清除背景。随后将鱼体保存于新鲜的50%甘油/0.1% KOH溶液中，用于后续观察。

4. 图像采集

  1. 每次将一条幼虫转移至载玻片上，使幼虫保持在液滴中央。
  2. 在体视显微镜下观察幼虫。
  3. 打开相机，启动软件（参见材料表），并保持默认设置。
  4. 点击AE，选择合适的曝光时间（本实验中为60 ms），以获得最佳图像。
  5. 在相同设置下采集所有图像。将图像保存为.tif格式，用于后续分析。

5. 图像分析

注意：有关图像分析的示例图表集，请参见补充文件。

  1. 双击 ImageJ 图标，分析在步骤 4.5 中保存的图像。
    1. 点击 文件 | 打开，以打开在步骤 4.5 中保存的图像。
    2. 点击 图像 | 类型，选择 8 位。
    3. 点击 编辑 | 反转。
    4. 点击 分析 | 校准，在弹出界面中选择 未校准的 OD，在下方界面左下角勾选 全局校准，然后点击 确定。
    5. 点击 分析 | 设置标尺 | 点击以移除标尺，在弹出界面中勾选下方的 全局，然后点击 确定。
    6. 点击 分析 | 设置测量，在弹出界面中选择 面积 项，勾选下方的 限定于阈值范围（仅测量选定范围），然后点击 确定。
    7. 点击 图像 | 调整 | 阈值，拖动弹出界面中间的滑块，设置合适的阈值（每张图像需单独调整阈值），使图像中所有待测目标均被选中，然后点击 设置。
    8. 点击 分析 | 测量，记录每组的数据。
  2. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 多重比较检验以分析差异，并将显著性水平设定为 p < 0.001（***）。

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结果

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茜素红染色是一种用于检测斑马鱼幼鱼骨骼矿化变化的灵敏且特异的方法。本研究中，我们观察到醋酸铅（PbAc）对斑马鱼幼鱼具有不良影响，包括死亡、畸形、心率降低以及体长缩短。此外，通过评估斑马鱼幼鱼的矿化骨骼区域，以检测PbAc诱导的骨量减少。在受精后9天（图1A），头部骨骼的许多结构已发生矿化，因而呈现红色染色，例如副蝶骨（PS）、鳃盖骨（OP）、角鳃骨（CB）和脊索（NC）。相比之下，耳石（OT）（非骨性结构）呈棕黑色而非红色。通过数字分析方法对每张图像中的总染色面积进行定量。与对照组相比，经10和20 mg/L PbAc处理的醋酸铅组染色面积显著减少（p < 0.001）（图1B）。骨骼矿化的变化呈剂量依赖性。

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讨论

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斑马鱼是研究骨代谢性疾病的合适模型。与啮齿类动物模型相比，斑马鱼模型的建立相对较快，且疾病严重程度的检测更为简便。在野生型斑马鱼幼体中，头骨的矿化发生在5 dpf，轴向骨骼的矿化发生在7 dpf15。因此，到9 dpf时，前额骨（PS）、顶骨（OP）、颅基骨（CB）和鼻软骨（NC）等颅骨已充分发育。在幼体完全脱色并漂白后，软组织被清除，使鱼体呈现透明外观。加入茜素红染色试剂以将斑马鱼体内的矿化骨骼染成红色并进行可视化观察。

图像分析对于获得本实验可靠的实验结论至关重要。选择姿态良好、背景干净的斑马鱼照片进行定量分析。在对单张图像的染色区域进行量化时，将计算一条鱼中所有被染成红色的矿化骨骼区域。因此，我们可以比较铅暴露组与对照组之间的骨量变化。本研究中，醋酸铅（PbAc）暴露导致斑马鱼出现发育毒性，在9天龄时，10和20 mg/L PbAc暴露组中矿化骨骼的染色面积显著减少。因此，早期胚胎阶段暴露于PbAc会减少斑马鱼幼鱼的骨量。图1展示了通过茜素红染色显示的斑马鱼幼鱼中PbA...

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作得到国家自然科学基金（81872646；81811540034；81573173）和江苏省高校优势学科建设工程项目（PAPD）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 M Tris-HCl (pH=7.5)Solarbio,北京,中国21用于固定
4% 多聚甲醛固定液BBI,上海,中国14组织固定
10x PBS 缓冲液BBI,上海,中国15用于固定
35% H2O2永华,江苏,中国8去除色素
50 mL 离心管AKX,江苏,中国4
95% 无水乙醇Enox,江苏,中国2脱色
茜素红（纯度 99.5%）Solarbio,北京,中国1染色
生化培养箱一恒,上海,中国3培养斑马鱼胚胎
电子天平Sartorius,德国5称量固体原料
甘油（纯度 99.5%）BBI,上海,中国7保存染色后的鱼
ImageJ（软件）美国9数字分析
KOH（纯度 99.9%）Sigma,美国10漂白液
三水合醋酸铅（纯度 99.5%）阿拉丁,上海,中国11
MgCl2 （纯度 99.9%）阿拉丁,上海,中国12清洗液
NIS-Elements F（软件）尼康,日本13观察和拍照
移液管AKX,江苏,中国18移除胚胎和溶液
培养板（24 孔）Corning,美国17胚胎染色容器
培养板（6 孔）Corning,美国16胚胎培养容器
摇床碧云天,中国19混匀溶液
体视显微镜尼康,日本20观察和拍照
斑马鱼苏州大学斑马鱼实验中心,苏州,中国22实验动物

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
  2. Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
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