本实验方案描述了一种利用激光损伤系统结合用于幼鱼处理的自动化微流控平台，在斑马鱼幼鱼中诱导组织特异性且高度可重复损伤的方法。
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摘要
摘要
斑马鱼幼鱼在受精后仅几天内就具有完全功能的中枢神经系统（CNS），并具备很强的再生能力。这使得该动物模型在研究脊髓损伤与再生方面非常有用。目前诱导此类损伤的标准方法是手动横断躯干的背侧部分。然而，该技术需要大量训练，且会损伤其他组织。为此，研究人员开发了一种基于激光诱导损伤的方案，以克服这些局限性。该方法可在大量个体及不同实验批次间实现高度可重复且完全的脊髓横断，即使未经训练的操作者也能完成。此外，组织损伤主要局限于脊髓本身，减少了皮肤、肌肉和中枢神经系统等其他组织受损带来的干扰效应。同时，该方法还可实现脊髓的半侧损伤。激光损伤后组织完整性的更好保留，有利于后续进行进一步解剖，以开展诸如电生理学等附加分析。因此，该方法能够对损伤程度实现精确控制，这是手动操作无法达到的。这将为这一强大模型未来的实验研究提供新的范式。
引言
与哺乳动物不同，斑马鱼（斑马鱼）能够在损伤后修复其中枢神经系统（CNS）1斑马鱼幼鱼作为脊髓再生模型的应用相对较新，但已被证明在研究修复过程中细胞与分子机制方面具有重要价值2这归因于其易于操作、实验周期短（每周均有新幼虫）、组织具有光学透明性，以及幼虫体型微小，非常适合 体内 荧光显微镜技术
在脊髓再生研究中，使用幼体的另外两个优势在于恢复速度快（数天，而成体需要数周）以及通过手动技术诱导损伤更为简便。这一方法已在多项研究中成功应用3,4,5，包括近期的研究工作6,7。总体而言，这有助于提高有意义数据的产出，增强实验方案的适应性，并降低实验成本。使用受精后5天以内的幼体还符合动物研究中的“3R原则”，减少了实验动物的使用8。
在斑马鱼幼鱼发生脊髓损伤后，会启动多种生物学过程，包括炎症反应、细胞增殖、神经发生、存活细胞或新生成细胞的迁移、功能性轴....
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方案
所有动物实验均在英国国内事务部的批准和监管下进行，并遵循其相关规定，项目许可证号为 PP8160052。该项目已获得爱丁堡大学机构动物护理与使用委员会的批准。实验分析中使用了以下可获得的转基因品系斑马鱼幼鱼，包括雄性和雌性，年龄不超过5天：Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)、Tg(Xla.Tubb:DsRed)、Tg(betaactin:utrophin-mCherry)、Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) 和 Tg(mnx1:gfp)（有关转基因斑马鱼品系的构建信息，请参见补充文件1）。图1展示了使用自动化斑马鱼幼鱼处理平台的实验流程示意图。本研究中使用的所有自定义软件、脚本及详细实验方案均可在 https://github.com/jasonjearly/micropointpy/ 获取。
1. 样品制备
- 受精后5小时，按正确的发育阶段对胚胎进行筛选21。弃去死亡的卵和发育不良或过度发育的胚胎。
- 受精后3天（dpf），在直径90 mm的培养皿中，将2 mL 0.4%氨基苯甲酸乙基甲酯加入50 mL养殖鱼类用水中，以麻醉幼鱼。若存在皮肤色素沉着问题，可使用经苯硫脲（PTU）（见材料表）培....
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结果
脊髓横断的验证
通过结构和功能研究，评估该方案是否实现了完全的脊髓横断。
首先，为了验证损伤部位荧光信号的减弱是由于神经组织损伤所致，而非激光照射引起的荧光淬灭，我们使用抗乙酰化微管蛋白抗体进行了免疫染色（见材料表和补充文件1）。结果显示损伤部位的尾侧与头侧之间轴突完全中断，证实了脊髓的完全横断（图4B）。成功的脊髓横断不应在损伤部位残留任何神经纤维投射（参见图4C以了解一次不成功的损伤示例）。采用该技术，脊髓激光损伤的成功率估计为75%（在16只动物中有4例横断不完全）。
通过钙成像技术研究了激光损伤后功能的丧失情况。在完整的斑马鱼幼鱼中，脊髓全长会自发产生协调的神经元网络活动，并形成荧光信号峰。成功的横断损伤会中断损伤部位两侧之间的神经活动传导。为评估脊髓横断的质量，在3 dpf的tg(Xla.T.......
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讨论
目前迫切需要更深入地了解斑马鱼再生过程中所涉及的机制。这一动物模型在生物医学研究中具有诸多优势，尤其适用于脊髓损伤研究1。大多数研究采用手动造伤方法，需要操作者经过良好训练，且往往导致多组织损伤。本文介绍一种激光损伤方案，可精确控制损伤特征，并减少对周围组织的损伤。此外，该技术操作简便，即使经验较少的实验人员也能成功掌握和应用。
该方案中的关键步骤是激光校准和感兴趣区域（ROI）的定义。在实际操作中，校准具有很高的稳定性（甚至可达数月），一旦确定了ROI的合适大小和位置，该技术的使用就非常简便。尽管本方案描述的是在特定设备上进行损伤操作的方法，但激光损伤的大部分优势在其他系统上同样可以获得，例如转盘显微镜。
本方案的主要局限性在于需要使用脊髓的荧光报告基因，以及完成损伤所需的时间（约5分钟/条鱼）。后一项不足可通过高重复性从而减少动物使用数量来弥补。然而，在药物筛选等需要大量损伤动物的应用中，手动损伤仍然是可行的。如本研究所示，激光损伤与手动损伤诱导的神经发生程度具有可比性。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由英国生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC，项目编号：BB/S0001778/1）资助。CR 由苏格兰公主皇家 TENOVUS 医学研究奖学金项目资助。我们感谢爱丁堡大学 CRH 的 David Greenald 和爱丁堡大学 CDBS 的 Katy Reid 慷慨提供转基因鱼（见补充文件）。我们感谢爱丁堡大学 CRH 的 Daniel Soong 慷慨提供 3i 转盘共聚焦显微镜的使用权限。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 软件 | |||
| 显微镜软件 Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | 开源 | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| 显微镜及附件 | |||
| ApoTome 显微镜 | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) 浸入式物镜 | Carl Zeiss | ||
| 双 AxioCam 506 m CCD 相机 | Carl Zeiss | ||
| 激光扫描共聚焦显微镜 LSM880 | Carl Zeiss | ||
| 转盘式共聚焦模块 CSU-X1 | Yokogawa | ||
| 正置显微镜 Axio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| 紫外激光器 | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| 实验耗材 | |||
| 90 mm 培养皿 | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96 孔板 | Corning | 3841 | |
| 化学试剂 | |||
| Click-It EdU 成像试剂盒 | Invitrogen | C10637 | |
| 氨基苯甲酸乙基甲酯（MS222） | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 苯硫脲（PTU） | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 抗体 | |||
| 驴抗鸡 Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| 驴抗小鼠 Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| 小鼠抗 GFP 抗体 | Abcam | AB13970 | |
| 小鼠抗乙酰化微管蛋白抗体 | Sigma | T6793 | |
| 转基因斑马鱼品系 | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | 由爱丁堡大学 David Greenhald 建立 | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | 首次描述于 [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | 首次描述于 [Peri 和 Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | 由爱丁堡大学 Katy Reid 建立 | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | 由爱丁堡大学 David Greenhald 建立 |
参考文献
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Ohnmacht, J., et al. Spinal motor ne....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 4/07/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.
The title was updated from:
Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
to:
Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
