本实验方案描述了一种利用激光损伤系统结合用于幼鱼处理的自动化微流控平台，在斑马鱼幼鱼中诱导组织特异性且高度可重复损伤的方法。
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摘要
摘要
斑马鱼幼鱼在受精后仅几天内就具有完全功能的中枢神经系统（CNS），并具备很强的再生能力。这使得该动物模型在研究脊髓损伤与再生方面非常有用。目前诱导此类损伤的标准方法是手动横断躯干的背侧部分。然而，该技术需要大量训练，且会损伤其他组织。为此，研究人员开发了一种基于激光诱导损伤的方案，以克服这些局限性。该方法可在大量个体及不同实验批次间实现高度可重复且完全的脊髓横断，即使未经训练的操作者也能完成。此外，组织损伤主要局限于脊髓本身，减少了皮肤、肌肉和中枢神经系统等其他组织受损带来的干扰效应。同时，该方法还可实现脊髓的半侧损伤。激光损伤后组织完整性的更好保留，有利于后续进行进一步解剖，以开展诸如电生理学等附加分析。因此，该方法能够对损伤程度实现精确控制，这是手动操作无法达到的。这将为这一强大模型未来的实验研究提供新的范式。
引言
与哺乳动物不同，斑马鱼（斑马鱼）能够在损伤后修复其中枢神经系统（CNS）1斑马鱼幼鱼作为脊髓再生模型的应用相对较新，但已被证明在研究修复过程中细胞与分子机制方面具有重要价值2这归因于其易于操作、实验周期短（每周均有新幼虫）、组织具有光学透明性，以及幼虫体型微小，非常适合 体内 荧光显微镜技术
在脊髓再生研究中，使用幼体的另外两个优势在于恢复速度快（数天，而成体需要数周）以及通过手动技术诱导损伤更为简便。这一方法已在多项研究中成功应用3,4,5，包括近期的研究工作6,7。总体而言，这有助于提高有意义数据的产出，增强实验方案的适应性，并降低实验成本。使用受精后5天以内的幼体还符合动物研究中的“3R原则”，减少了实验动物的使用8。
在斑马鱼幼鱼发生脊髓损伤后，会启动多种生物学过程，包括炎症反应、细胞增殖、神经发生、存活细胞或新生成细胞的迁移、功能性轴突的重新形成，以及神经突触回路和脊髓组织的整体重塑6,7,9,10。这些过程的成功协调依赖于多种细胞类型、细胞外基质组分以及生化信号之间精细调控的相互作用11,12。要解析脊髓这类复杂组织发生显著重组的详细机制，需要采用并发展精确且可控的实验方法。
研究斑马鱼脊髓再生的主要实验范式是通过手术手段诱导组织损伤，例如切除、穿刺或冷冻损伤3,13。这些方法的缺点是需要操作者具备显微外科技术方面的专门培训，对于任何新操作者而言都耗时较长，可能限制其在短期项目中的应用。此外，这些方法通常会对周围组织造成损伤，从而可能影响再生过程。
另一种方法是通过化学手段14或遗传操作15来诱导细胞损伤。后者可实现高度特异性的损伤。然而，该技术在开展任何实验前都需要 lengthy 的准备工作以构建新的转基因鱼，并且每次针对不同细胞类型时都需重新进行这一过程。
因此，需要一种能够实现靶向且灵活的损伤方法，以适用于各种再生研究。一种解决方案是使用激光在目标组织中诱导局部损伤16,17,18,19,20。事实上，利用激光诱导组织损伤是一种生成脊髓损伤的可靠方法，具有多种优势。配备此类激光操作模块的显微镜能够精确设定定制形状的区域以实现细胞消融，并额外提供时间控制的优势。因此，可根据具体科学问题灵活调整损伤的大小和位置。
大多数激光损伤系统所缺乏的功能是能够以高度可重复的方式对一系列幼体进行损伤诱导。本文介绍了一种原创性方案，利用紫外激光结合专为自动化幼体操作设计的微流控平台21，实现对斑马鱼幼体进行半自动、精确且可控的损伤。此外，在本系统中，幼体被置于玻璃毛细管内，可在其头尾轴方向自由旋转。用户可选择将幼体的任意一侧面向激光，同时支持荧光成像，以精确定位激光束并在损伤后评估损伤情况。
本文所述方案适用于一种半自动化的斑马鱼幼体成像系统，该系统配备带有紫外激光器的旋转盘（下文简称VAST系统）。然而，本方案的核心要点以及该技术的大部分应用声明同样适用于任何具备细胞消融能力激光器的成像系统，包括双光子激光扫描显微镜、配备紫外激光器（FRAP模块）的旋转盘显微镜，或带有激光操控模块的视频显微镜。VAST系统与传统样品处理方式之间的一个主要区别在于：后者需要将幼体固定在盖玻片或玻璃底培养皿中的低熔点琼脂糖中，而不是将其装载至96孔板中。
该方法所提供的优势为研究再生过程中的细胞与分子机制开辟了创新性研究的新机遇。此外，高质量的数据使得在多学科背景下开展定量研究成为可能。
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方案
所有动物实验均在英国国内事务部的批准和监管下进行，并遵循其相关规定，项目许可证号为 PP8160052。该项目已获得爱丁堡大学机构动物护理与使用委员会的批准。实验分析中使用了以下可获得的转基因品系斑马鱼幼鱼，包括雄性和雌性，年龄不超过5天：Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)、Tg(Xla.Tubb:DsRed)、Tg(betaactin:utrophin-mCherry)、Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) 和 Tg(mnx1:gfp)（有关转基因斑马鱼品系的构建信息，请参见补充文件1）。图1展示了使用自动化斑马鱼幼鱼处理平台的实验流程示意图。本研究中使用的所有自定义软件、脚本及详细实验方案均可在 https://github.com/jasonjearly/micropointpy/ 获取。
1. 样品制备
- 受精后5小时，按正确的发育阶段对胚胎进行筛选21。弃去死亡的卵和发育不良或过度发育的胚胎。
- 受精后3天（dpf），在直径90 mm的培养皿中，将2 mL 0.4%氨基苯甲酸乙基甲酯加入50 mL养殖鱼类用水中，以麻醉幼鱼。若存在皮肤色素沉着问题，可使用经苯硫脲（PTU）（见材料表）培养的动物以防止色素形成；但本方案所述的3 dpf幼鱼脊髓损伤实验中不存在此问题。
注：此处使用相对较高浓度的麻醉剂，以防止激光照射后幼鱼产生运动。 - 筛选具有荧光报告基因表达的胚胎（补充文件1）。
注：通常需要脊髓（或其他目标结构）的荧光报告基因以评估损伤效率。使用tg(Xla.Tubb:DsRed)有助于识别脊髓结构。 - 将筛选后的幼鱼转移至96孔板中，用于VAST系统（见材料表），每孔加入300 µL养殖鱼类用水。直接使用来自90 mm培养皿中的含麻醉剂的溶液。确保每孔仅含一条幼鱼。另准备一个额外的空96孔板，用于收集已造模的幼鱼。
注：若使用其他激光损伤系统，需将幼鱼固定于1%低熔点（LMP）琼脂糖凝胶中，并置于合适的观察室中。
2. 显微镜准备
- 开启所有系统组件（VAST、显微镜、激光器、计算机），包括用于消融的激光器。
- 硬件完全初始化后，启动显微镜软件、ImageJ/Fiji、Python 集成开发环境（IDE），以及自动斑马鱼成像系统（VAST 系统）软件（如使用该平台，请参见材料表）。
- 按照以下步骤设置 VAST 软件。
- 启动 VAST 软件后，在第一个窗口中选择Plate ，然后点击Done 按钮（图 2A）。随后会弹出一个小窗口，询问毛细管是否为空且清洁。通过观察毛细管图像，检查内部是否有气泡。若无气泡，点击Yes；若有气泡，点击No 并执行步骤 2.3.2–2.3.3（图 2B）。
- 在大颗粒（LP）采样器窗口中，点击Prime 以去除气泡（图 2C）。
- 进入主软件窗口（显示毛细管图像），在图像上右键单击，从弹出菜单中选择Record empty capillary image （图 2B）。
- 在LP Sampler窗口中，进入File 菜单并选择Open Script 选项，选择包含对应实验脚本的文件。
- 在主 VAST 软件窗口中，进入File 菜单并选择Open Experiment，选择与计划实验相对应的实验文件。
注意：请确保不要勾选“Auto unload”和“Bulk output to waste”选项。
- 设置显微镜软件以进行成像。
- 启动显微镜成像软件（参见材料表），以初始化硬件。此过程可能需要几分钟，具体时间取决于系统。
- 进入采集设置，配置显微镜以对幼虫中表达的荧光团进行成像。使用 10x NA 0.5 水浸物镜，确保沿光轴方向的焦体积足够长，以实现对脊髓或目标组织全深度的损伤。
- 设置 ImageJ/Fiji 以进行激光损伤。
- 进入File 菜单，选择New/Script 以打开脚本窗口。
- 在New 窗口中，进入File 菜单并选择Open ，加载激光损伤脚本（Manual_MP_Operation.ijm）。
- 设置 Python IDE。
- 启动 Python IDE。
- 进入File 菜单并选择Open File，加载用于控制激光器的脚本（Watch_for_ROIs_py3.py）。
- 进入Run 菜单并选择Run Without Debugging以运行脚本。运行时，请检查 TERMINAL 面板是否出现一系列消息，并伴随一些噪声，表明激光衰减器正在初始化（图 2D）。
3. 在 VAST 系统上进行激光消融
- 通过点击 VAST 软件主窗口中的箭头按钮移动载物台，使毛细管相对于显微镜物镜居中（图2B）。
- 通过目镜观察，并使用显微镜的透射光，对准毛细管顶部进行聚焦。
注意：毛细管非常脆弱，若被物镜触碰可能会破裂。聚焦时应缓慢转动显微镜旋钮。 - 将96孔板放置在VAST系统LP采样器的板架上。将含有幼虫的板放在左侧板架，收集用的板放在右侧。确保板的方向正确：A1孔应位于板架的前左角。
- 在VAST软件的LP采样器窗口中，点击板模板按钮，并选择所有含有幼虫的孔。点击确定按钮以确认并关闭窗口（图2C）。
- 在LP采样器窗口中，点击运行板按钮以开始加载一只幼虫。
注意：一段时间后，幼虫应出现在毛细管中的指定位置（在实验定义文件中预设），以便损伤脊髓。VAST托盘灯将在数次旋转后关闭，使幼虫侧面向显微镜物镜定位。 - 进入显微镜软件，点击实时成像按钮以对幼虫进行成像。
- 转动显微镜聚焦旋钮，直至可见脊髓中央管。
注意：可先使用透射光进行聚焦，再用荧光图像进行精细调整，这样可能更容易。 - 拍摄一张荧光图像快照，并将图像保存至指定文件夹。
- 在ImageJ中打开图像，并根据需要调整对比度（使用ImageJ中的图像/调整/亮度/对比度… 菜单）。
- 点击感兴趣区域（ROI）直线工具，在脊髓中心绘制一条短直线（20 µm）（图3A）。
- 将显微镜切换至100%反射镜位置。
- 加载ImageJ脚本并点击运行按钮。使用以下参数：重复次数 - 2；样本 - 1；宽度 - 40微米；衰减 - 89（全激光功率）（图3C）。
- 激光照射序列结束后，切换至成像软件的荧光成像模式，并根据需要调整焦距。
注意：由于激光照射期间尾部发生位移，通常会观察到焦平面偏移。 - 拍摄一张新快照并保存。
- 在ImageJ中打开这张新图像，并绘制一条比脊髓本身更大的直线（约80 µm），起点位于脊索上部脊髓腹侧下方，终点延伸至背侧，终止于脊髓与皮肤之间的空隙（图3B）。
- 将显微镜切换至100%反射镜位置。
- 进入ImageJ脚本窗口，点击运行按钮。使用以下参数：重复次数 - 2；样本 - 1；宽度 - 40微米；衰减 - 89（全激光功率）。
- （较长的）激光照射序列结束后，通过荧光成像和聚焦检查横断效果。确保损伤部位无完整细胞或轴突残留，该区域应呈现为暗区或微弱且均匀的荧光区（图3D，底部图）。
- 返回主VAST软件窗口，点击收集按钮，将已损伤的幼虫收集至空的96孔板中（与原始孔位置相同的对应孔）。
- 通过点击窗口左下角的复选框托盘灯，重新打开VAST系统光源。
- 对每一只需要损伤的新幼虫重复步骤3.3–3.17。
4. 损伤后处理及附加实验
- 尽快从96孔板中取出幼鱼，并将其转移至含有新鲜养殖水的干净培养皿中，以使幼鱼在损伤后恢复。将培养皿置于28 °C的培养箱中。
注意：损伤通常在损伤后第一小时内持续扩展。因此，应在约1小时延迟后通过荧光成像评估损伤的实际范围。
5. 故障排除
- 如果 VAST 系统的管路和毛细管中存在气泡，请点击 LP Sampler 窗口上的 Prime 按钮以排除气泡。
- 考虑造成不成功损伤的因素（根据损伤部位残留的荧光判断，除了预期的残余均匀背景外），可能由以下几种原因导致：
- 激光功率过低：发生此情况时，尝试使用更高的功率值。
注意：VAST 系统配备的是染料激光器。这意味着用于产生激光的染料溶液浓度会随时间变化，从而导致激光功率下降。通常更换新鲜的染料溶液即可解决该问题22。 - 校准不佳：发生此情况时，请按照步骤 5.2.2.1–5.2.2.4 验证激光系统的校准和功率。若校准不准确，激光将无法准确照射到目标位置，从而导致损伤失败或对邻近组织造成非预期损伤。
- 将镜面载玻片放置在毛细管腔室顶部。对准镀层一侧进行聚焦（镀层应朝向物镜）。可利用载玻片上先前的默认设置更方便地完成聚焦。
- 使用校准脚本执行激光消融图案。
- 评估图案质量。斑点或线条应清晰锐利，不应模糊。
- 使用功率递增的梯度测试，判断当前激光功率是否较之前有所变化。
- 损伤过程中幼体移动：幼体对麻醉的反应存在差异，因此激光损伤可能在操作过程中引发尾部运动，从而阻碍成功横断。发生此情况时，可额外重复一次激光损伤步骤，以完成横断，同时仍避免对周围组织造成损伤。
- 聚焦不良：发生此情况时，应对准中央管的中部以获得最佳效果。
- 感兴趣区域（ROI）的绘制、位置和大小：ROI 的位置和大小对成功横断至关重要。ROI 应大于脊髓，并以脊髓中心为中心。为解决此问题，建议从脊髓腹侧开始绘制 ROI，并向上延伸至背侧，以实现成功横断。这可能是由于消融过程中激光脉冲序列触发了尾部运动所致。
- 激光功率过低：发生此情况时，尝试使用更高的功率值。
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结果
脊髓横断的验证
通过结构和功能研究，评估该方案是否实现了完全的脊髓横断。
首先，为了验证损伤部位荧光信号的减弱是由于神经组织损伤所致，而非激光照射引起的荧光淬灭，我们使用抗乙酰化微管蛋白抗体进行了免疫染色（见材料表和补充文件1）。结果显示损伤部位的尾侧与头侧之间轴突完全中断，证实了脊髓的完全横断（图4B）。成功的脊髓横断不应在损伤部位残留任何神经纤维投射（参见图4C以了解一次不成功的损伤示例）。采用该技术，脊髓激光损伤的成功率估计为75%（在16只动物中有4例为不完全横断）。
通过钙成像技术研究了激光损伤后功能的丧失情况。在完整的斑马鱼幼体中，脊髓全长会自发产生协调的神经元网络活动，并形成荧光信号峰。成功的横断损伤会中断损伤部位两侧之间的神经活动传导。为评估脊髓横断的质量，在3 dpf的tg(Xla....
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讨论
目前迫切需要更深入地了解斑马鱼再生过程中所涉及的机制。这一动物模型在生物医学研究中具有诸多优势，尤其适用于脊髓损伤研究1。大多数研究采用手动造伤方法，需要操作者经过良好训练，且往往导致多组织损伤。本文介绍一种激光损伤方案，可精确控制损伤特征，并减少对周围组织的损伤。此外，该技术操作简便，即使经验较少的实验人员也能成功掌握和应用。
该方案中的关键步骤是激光校准和感兴趣区域（ROI）的定义。在实际操作中，校准具有很高的稳定性（甚至可达数月），一旦确定了ROI的合适大小和位置，该技术的使用就非常简便。尽管本方案描述的是在特定设备上进行损伤操作的方法，但激光损伤的大部分优势在其他系统上同样可以获得，例如转盘显微镜。
本方案的主要局限性在于需要使用脊髓的荧光报告基因，以及完成损伤所需的时间（约5分钟/条鱼）。后一项不足可通过高重复性从而减少动物使用数量来弥补。然而，在药物筛选等需要大量损伤动物的应用中，手动损伤仍然是可行的。如本研究所示，激光损伤与手动损伤诱导的神经发生程度具有可比性。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由英国生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC，项目编号：BB/S0001778/1）资助。CR 由苏格兰公主皇家 TENOVUS 医学研究奖学金项目资助。我们感谢爱丁堡大学 CRH 的 David Greenald 和爱丁堡大学 CDBS 的 Katy Reid 慷慨提供转基因鱼（见补充文件）。我们感谢爱丁堡大学 CRH 的 Daniel Soong 慷慨提供 3i 转盘共聚焦显微镜的使用权限。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 软件 | |||
| 显微镜软件 Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | 开源 | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| 显微镜及附件 | |||
| ApoTome 显微镜 | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) 浸入式物镜 | Carl Zeiss | ||
| 双 AxioCam 506 m CCD 相机 | Carl Zeiss | ||
| 激光扫描共聚焦显微镜 LSM880 | Carl Zeiss | ||
| 转盘式共聚焦模块 CSU-X1 | Yokogawa | ||
| 正置显微镜 Axio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| 紫外激光器 | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| 实验耗材 | |||
| 90 mm 培养皿 | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96 孔板 | Corning | 3841 | |
| 化学试剂 | |||
| Click-It EdU 成像试剂盒 | Invitrogen | C10637 | |
| 氨基苯甲酸乙基甲酯（MS222） | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 苯硫脲（PTU） | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 抗体 | |||
| 驴抗鸡 Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| 驴抗小鼠 Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| 小鼠抗 GFP 抗体 | Abcam | AB13970 | |
| 小鼠抗乙酰化微管蛋白抗体 | Sigma | T6793 | |
| 转基因斑马鱼品系 | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | 由爱丁堡大学 David Greenhald 建立 | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | 首次描述于 [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | 首次描述于 [Peri 和 Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | 由爱丁堡大学 Katy Reid 建立 | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | 由爱丁堡大学 David Greenhald 建立 |
参考文献
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勘误
Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 4/07/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.
The title was updated from:
Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
to:
Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
