利用亲和层析法进行人基质金属蛋白酶-3的细菌表达与纯化

摘要

采用 His标签纯化、透析和活化方法，以提高在细菌中表达的可溶性、有活性的基质金属蛋白酶-3 催化结构域蛋白的产量。通过 SDS-PAGE 凝胶分析蛋白组分。

摘要

基质金属蛋白酶（MMPs）属于含锌金属蛋白酶（metzincin蛋白酶）家族，在细胞外基质（ECM）的降解与重塑过程中发挥核心作用，同时也参与多种生长因子和细胞因子的相互作用。特定MMPs的过表达与多种疾病相关，例如癌症、神经退行性疾病和心血管疾病。近年来，MMPs成为研究热点，被视为开发治疗MMP过表达相关疾病药物的重要靶点。

为了研究溶液中基质金属蛋白酶（MMP）的作用机制，需要更简便且稳定的重组蛋白表达与纯化方法，以获得具有活性且可溶的MMP。然而，大多数MMP的催化结构域无法在 大肠杆菌 (E. coli由于缺乏翻译后修饰机制，可溶性表达往往难以实现，而哺乳动物表达系统通常成本较高且产量较低。基质金属蛋白酶（MMP）的包涵体必须经过繁琐且耗时的纯化与复性过程，这显著降低了具有天然构象的MMP产量。本文介绍一种利用Rosetta2(DE3)pLysS（以下简称R2DP）细胞表达基质金属蛋白酶-3催化结构域（MMP-3cd）的实验方案，该蛋白在N端带有His标签并连接前体结构域（Hisx6-pro-MMP-3cd），可用于亲和层析纯化。R2DP细胞含有一种氯霉素抗性质粒，该质粒携带在细菌表达系统中通常罕见的密码子，从而增强真核蛋白的表达水平。与传统用于重组蛋白表达的BL21(DE3)菌株相比，使用该新菌株可提高纯化的Hisx6-pro-MMP-3cd产量。经激活和脱盐处理后，前体结构域与N端His标签被切除，从而获得具有活性的MMP-3cd，可立即用于多种实验应用 体外 应用。该方法无需昂贵的设备或复杂的融合蛋白，可实现重组人源MMP在细菌中的快速生产。

引言

大多数复杂的真核蛋白在表达后会经历复杂的翻译后修饰，需要高度辅助的蛋白质折叠过程和辅因子才能具备功能¹。由于成本高昂，以及缺乏高效且稳定的表达与纯化方法，即使在小规模的实验室实验中，利用细菌宿主生产大量可溶性人源蛋白仍是一项重大挑战^2,3。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类分子量较大的人源内肽酶，在大肠杆菌（E. coli）中表达时通常形成不溶性的包涵体。提取可溶性人源MMPs往往需要繁琐且耗时的增溶与复性过程⁴。

基质金属蛋白酶（MMPs）在生理和病理过程中均发挥关键作用。人类MMP家族包含23种锌依赖性内肽酶，根据结构和底物特异性进行分类，尽管其催化结构域高度保守，但表达具有差异性^5,6。MMPs以无活性的酶原形式分泌，其活性受翻译后激活机制以及金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）等内源性抑制因子的调控^7,8,9,

方案

1. MMP 表达

1. pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 在 R2DP 细胞中的克隆与转化
   1. 消化 pET-3a 质粒（参见 材料表) 用 NdeI 和 BamHI 限制性内切酶在消化缓冲液中进行酶切（参见 材料表在总体积为 40 µL 的反应体系中，加入 4 µL 消化缓冲液、33 µL 浓度为 100 ng/µL 的质粒 DNA，以及每种限制性内切酶各 1.5 µL，于 37 °C 反应约 2 小时，直至反应完全。
   2. 对MMP-3cd序列进行PCR反应以插入N端His标签。使用25 µL PCR Mix（参见 材料表），2.5 µL 10 µM 引物（补充图 S1），以及1.25 µL的100 ng/µL插入片段序列。加入无菌水至终反应体积为50 µL。
   3. 将PCR产物和酶切后的载体在1%琼脂糖凝胶上电泳。使用凝胶回收试剂盒纯化凝胶条带（参见 材料表按照制造商的说明书进行。
   4. 将扩增的PCR产物利用DNA Assembly Mix克隆至经NdeI和BamHI限制性位点消化的载体中（参见 材料表). 使用在线工具确定插入片段和切割载体在总体积为 15 µL 的反应中所需的体积。<....

结果

进行SDS-PAGE检测样品时，由于蛋白以不溶性包涵体形式表达，裂解并超声处理后的组分中应含有极少或不含Hisx6-pro-MMP-3cd蛋白，因为此时蛋白尚未在尿素中重新溶解。图3比较了来自BL21(DE3)细胞和R2DP细胞的Hisx6-pro-MMP-3cd蛋白的His标签纯化洗脱组分。在透析前，分别将BL21(DE3)细胞和R2DP细胞的洗脱组分各自合并。各步骤的组分在蛋白脱盐后进行电泳分析（图4）。所有Hisx6-pro-MMP-3cd样品均在约30 kDa处显示一条条带，而在去除His标签和前结构域后，有活性的MMP-3cd在约20 kDa处出现条带（图4和补充图S1）。

在纯化和脱盐 BL21(DE3) 与 R2DP 菌株培养物后，测定 E. coli 培养液中每升所获得的总蛋白产量（表 1）。使用 R2D.......

讨论

大规模生产可溶性人源重组基质金属蛋白酶（MMP）仍是一项具有挑战性的任务。哺乳动物细胞能够表达具有功能的MMP，但成本高昂且耗时较长；而大肠杆菌（E. coli）虽能快速产生大量MMP包涵体，但这些包涵体必须经过纯化和复性^11,16。R2DP细胞显著提高了MMP包涵体的产量，从而实现更经济高效的MMP复性过程。然而，大肠杆菌（E. coli）缺乏折叠MMP所需的翻译后修饰机制，尽管经过基因工程改造的菌株表达水平显著提高，但在去除变性剂后，仅部分中间产物能够正确折叠⁴。因此，在复性和活化过程中仍可能出现MMP沉淀。这些结果表明，在经过复性、活化和脱盐后，纯化的Hisx6-pro-MMP-3cd产量有相当一部分会损失。

通过增加透析步骤并检测MMP-3cd和APMA的浓度，可进一步优化这些阶段。然而，每升培养物中，R2DP细胞产生的功能性MMP-3cd产量比BL21(DE3)细胞高49倍.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm 无菌滤器	Sigma Aldrich	SLGP033RS	用于在纯化前去除蛋白提取物中的部分污染物，并防止镍-NTA柱堵塞
1 L 锥形瓶	Thermo Fisher Scientific	S76106F	n/a
1 L 玻璃瓶	Thermo Fisher Scientific	06-414-1D	n/a
1.5 mL 微量离心管	Thermo Fisher Scientific	02-682-002	n/a
15 mL 圆锥形离心管	Thermo Fisher Scientific	339650	n/a
18 G，1 英寸斜面针头	Amazon	B07S7VBHM2	与透析夹板联合使用
2 mL 脱盐柱	Thermo Fisher Scientific	89890	去除激活后残留的 APMA
2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES)	Thermo Fisher Scientific	AAA1610422	n/a
250 mL 圆锥瓶缓冲垫	Thermo Fisher Scientific	05-538-53A	在大体积离心过程中稳定圆锥瓶
250 mL 圆锥瓶	Thermo Fisher Scientific	05-538-53	n/a
400 mL 搅拌式超滤池	Sigma Aldrich	UFSC40001	可浓缩比离心过滤装置更大体积的样品。Rosetta2(DE3)pLysS 细胞产生的蛋白量较高，可能超过离心过滤装置 15 mL 的容量限制
4-氨基苯基汞乙酸盐 (APMA)	Sigma Aldrich	A9563-5G	通过切割前肽激活 MMP-3
5 mL 注射器	Thermo Fisher Scientific	NC0829167	与透析夹板联合使用
50 mL 圆锥形离心管	Thermo Fisher Scientific	339650	用于多个纯化步骤中的样品储存
50 mL 再浓缩管	Sigma Aldrich	UFC901024D	用于透析后蛋白样品的再浓缩或去除污染物
琼脂	Thermo Fisher Scientific	BP1423-500	缓冲液成分，使高压灭菌后的 LB 培养基在冷却后凝固
氨苄青霉素	Thermo Fisher Scientific	BP1760-25	与 pET3a 载体联用的抗生素；在 LB 培养基中使用浓度为 100 µg/mL
BamHI	NEB	R3136S	与 pET3a 载体联用的限制性内切酶
氯化钙 (CaCl2)	Thermo Fisher Scientific	600-30-23	钙离子可稳定 MMP 的结构
涂布棒	Thermo Fisher Scientific	50-189-7544	转化后可用于将细胞均匀涂布于培养皿表面
氯霉素	Thermo Fisher Scientific	22-055-125GM	与 pET3a 载体联用的抗生素；在 LB 培养基中使用浓度为 34 µg/mL
透析缓冲液 1	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，150 mM NaCl，10 mM CaCl2，1 µM ZnCl2，4 M 尿素
透析缓冲液 2	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，150 mM NaCl，10 mM CaCl2，1 µM ZnCl2，2 M 尿素
透析缓冲液 3	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，150 mM NaCl，10 mM CaCl2，1 µM ZnCl2
透析夹	Thermo Fisher Scientific	68011	与蛇皮透析管联合使用
透析管	Thermo Fisher Scientific	88243	另一种透析方法，可容纳更大体积的样品，但样品损失风险较高
消化缓冲液	NEB	B7204S	用于消化 pET3a 载体
一次性比色皿	Thermo Fisher Scientific	21-200-257	用于测量细菌培养过程中的 OD 值以监测生长和表达情况
二硫苏糖醇 (DTT)	Thermo Fisher Scientific	D107125G	通过还原二硫键协助蛋白变性
DNA 连接反应混合液	NEB	E2621S	用于连接 Hisx6-pro-MMP-3cd PCR 产物与酶切后的 pET3a 载体
DNase I	NEB	M0303S	内切核酸酶，用于降解可能影响后续蛋白纯化的不利 DNA 污染物
乙醇	Thermo Fisher Scientific	A995-4	n/a
乙二胺四乙酸 (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	J15694-AE	用于变性过程，防止氧化及二硫键的形成
凝胶回收试剂盒	Promega	A9281	从琼脂糖凝胶中分离并纯化 DNA
甘油	Thermo Fisher Scientific	G33-500	用于制备甘油菌，于 -80 °C 冻存
重力流层析柱	BioRad	7321010	用于纯化带有重组组氨酸标签的蛋白
高效转化感受态细胞	NEB	C2987	具有高转化效率的感受态细胞，可提高将 N 端 His 标签克隆至 pET3a-pro-MMP-3cd 构建体的成功率
HT 洗脱缓冲液	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，50 mM NaCl，6 M 尿素，250 mM 咪唑。调节 pH 至 7.4
HT 平衡缓冲液	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，50 mM NaCl，6 M 尿素。调节 pH 至 7.4
HT 再生缓冲液	n/a	n/a	20 mM MES，0.1 M NaCl。调节 pH 至 5.0
HT 洗涤缓冲液	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，50 mM NaCl，6 M 尿素，25 mM 咪唑。调节 pH 至 7.4
盐酸 (HCl)	Thermo Fisher Scientific	A144C-212	用于调节缓冲液 pH
咪唑	Thermo Fisher Scientific	AAA1022122	模拟组氨酸侧链基团，用于将非特异性结合的蛋白与 His 标签目标蛋白分离
包涵体缓冲液	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA，100 mM NaCl，5 mM DTT，2% v/v Triton X-100，0.5 M 尿素。调节 pH 至 8.0
异丙基-ß-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)	Thermo Fisher Scientific	FERR0392	诱导 pET3a 载体中目标基因表达的试剂。配制 0.5 mL 1 M 分装液，过滤除菌后于 -20 °C 保存
LB Amp CamR 培养基	n/a	n/a	应倒入无菌 1 L 瓶或 1 L 锥形瓶中。配制 1 L 培养基时加入 25 g LB 肉汤，高压灭菌。冷却至 50 °C 以下后，加入氨苄青霉素至 100 µg/mL 和氯霉素至 34 µg/mL
LB Amp CamR 平板	n/a	n/a	应倒入无菌培养皿中，倒至培养皿盖完全覆盖为止。1 L 培养基可制备 40–60 个平板。配制 1 L 培养基时加入 25 g LB 肉汤和 16 g 琼脂，高压灭菌。冷却至 50 °C 以下后，加入氨苄青霉素至 100 µg/mL 和氯霉素至 34 µg/mL
LB 肉汤	Thermo Fisher Scientific	BP1426-2	预先混合了胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠
裂解缓冲液	n/a	n/a	50 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA，100 mM NaCl，0.133 g/mL 溶菌酶，0.49% v/v Triton X-100。调节 pH 至 8.0
溶菌酶	MP Biomedicals	195303	用于蛋白提取，是一种可裂解细菌细胞壁的酶
质粒小提试剂盒	Promega	A1330	若成功，可从转化子中提取 pET3a-pro-MMP-3cd 构建体
NdeI	NEB	R0111S	与 pET3a 载体联用的限制性内切酶
Ni-NTA 树脂	Thermo Fisher Scientific	PI88221	用于结合重组 His 标签蛋白。该强相互作用可通过高浓度咪唑洗脱而解除
非离子型表面活性剂	Thermo Fisher Scientific	PI28316	用于防止 MMP 聚集的储存用去垢剂。可减少 MMP 表面疏水残基与水分子之间的相互作用，同时不破坏其催化活性
PCR 反应混合液	NEB	M0492S	用于将 N 端 His 标签插入 pET3a-pro-MMP-3cd 载体的 PCR 试剂
pET 质粒	Addgene	n/a	pET3a 载体提供氨苄青霉素抗性、目标基因的可诱导表达以及使用 T7 引物进行测序的功能
培养皿	VWR	25384-342	用于在 LB 琼脂培养基上涂布转化子
R2DP 细胞	Novagen	714033	BL21 衍生菌株，可增强真核蛋白的表达，含有在大肠杆菌中稀有密码子对应的 tRNA
SOC 生长培养基	NEB	B9020S	转化过程中用于快速生长的非选择性培养基
氯化钠 (NaCl)	Thermo Fisher Scientific	BP358-1	用于缓冲液配制，并有助于维持蛋白稳定性
脱氧胆酸钠	Thermo Fisher Scientific	PI89905	用于蛋白提取的去垢剂，可裂解细胞壁
溶解缓冲液	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，50 mM NaCl，10 mM DTT，6 M 尿素。调节 pH 至 8.0
Tris 碱	Thermo Fisher Scientific	BP152-1	常用于生理 pH 范围的缓冲液，对温度敏感
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	M1122980101	用于细胞裂解的去垢剂
尿素	Thermo Fisher Scientific	AAJ75826A7	第一种破坏蛋白二级结构的变性剂
氯化锌 (ZnCl2)	Thermo Fisher Scientific	AAA162810E	稳定 MMP 结构。锌离子存在于 MMP-3 的催化位点中