采用 His标签纯化、透析和活化方法，以提高在细菌中表达的可溶性、有活性的基质金属蛋白酶-3 催化结构域蛋白的产量。通过 SDS-PAGE 凝胶分析蛋白组分。
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方法文章
利用亲和层析法进行人基质金属蛋白酶-3的细菌表达与纯化
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
基质金属蛋白酶（MMPs）属于含锌金属蛋白酶（metzincin蛋白酶）家族，在细胞外基质（ECM）的降解与重塑过程中发挥核心作用，同时也参与多种生长因子和细胞因子的相互作用。特定MMPs的过表达与多种疾病相关，例如癌症、神经退行性疾病和心血管疾病。近年来，MMPs成为研究热点，被视为开发治疗MMP过表达相关疾病药物的重要靶点。
为了研究溶液中基质金属蛋白酶（MMP）的作用机制，需要更简便且稳定的重组蛋白表达与纯化方法，以获得具有活性且可溶的MMP。然而，大多数MMP的催化结构域无法在 大肠杆菌 (E. coli由于缺乏翻译后修饰机制，可溶性表达往往难以实现，而哺乳动物表达系统通常成本较高且产量较低。基质金属蛋白酶（MMP）的包涵体必须经过繁琐且耗时的纯化与复性过程，这显著降低了具有天然构象的MMP产量。本文介绍一种利用Rosetta2(DE3)pLysS（以下简称R2DP）细胞表达基质金属蛋白酶-3催化结构域（MMP-3cd）的实验方案，该蛋白在N端带有His标签并连接前体结构域（Hisx6-pro-MMP-3cd），可用于亲和层析纯化。R2DP细胞含有一种氯霉素抗性质粒，该质粒携带在细菌表达系统中通常罕见的密码子，从而增强真核蛋白的表达水平。与传统用于重组蛋白表达的BL21(DE3)菌株相比，使用该新菌株可提高纯化的Hisx6-pro-MMP-3cd产量。经激活和脱盐处理后，前体结构域与N端His标签被切除，从而获得具有活性的MMP-3cd，可立即用于多种实验应用 体外 应用。该方法无需昂贵的设备或复杂的融合蛋白，可实现重组人源MMP在细菌中的快速生产。
引言
大多数复杂的真核蛋白在表达后会经历复杂的翻译后修饰，需要高度辅助的蛋白质折叠过程和辅因子才能具备功能1。由于成本高昂，以及缺乏高效且稳定的表达与纯化方法，即使在小规模的实验室实验中，利用细菌宿主生产大量可溶性人源蛋白仍是一项重大挑战2,3。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类分子量较大的人源内肽酶，在大肠杆菌（E. coli）中表达时通常形成不溶性的包涵体。提取可溶性人源MMPs往往需要繁琐且耗时的增溶与复性过程4。
基质金属蛋白酶（MMPs）在生理和病理过程中均发挥关键作用。人类MMP家族包含23种锌依赖性内肽酶，根据结构和底物特异性进行分类，尽管其催化结构域高度保守，但表达具有差异性5,6。MMPs以无活性的酶原形式分泌，其活性受翻译后激活机制以及金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）等内源性抑制因子的调控7,8,9,10。尽管MMPs最初因其在细胞外基质（ECM）更新中的作用而被认识，但后续研究发现其还参与发育、形态发生、组织修复与重塑等过程8。MMPs的失调显著与癌症以及神经退行性疾病、心血管疾病和纤维化疾病等多种疾病相关5,7。
建立稳定的大规模基质金属蛋白酶（MMP）生产方法，对于通过生物化学和基于细胞的检测手段成功开展未来MMP机制研究至关重要。已有多种MMP在细菌中成功表达11，包括带有Hisx6标签的MMP，且未影响MMP活性12,13,14,15。然而，这些方法包含繁琐且耗时的步骤，可能难以重复。
哺乳动物细胞还可用于表达多种不同的人类蛋白质，同时确保正确的翻译后修饰16。尽管哺乳动物表达系统是生产具有正确翻译后修饰的重组人源蛋白质的理想选择，但该方法的主要缺点包括初始产量较低、培养基和试剂成本较高、获得稳定表达细胞系所需时间较长，以及存在真菌或细菌等其他物种污染的风险2,11。此外，在哺乳动物细胞系中生产基质金属蛋白酶（MMP）时，会因细胞相关蛋白（如TIMPs或纤维连接蛋白）的存在而产生杂质11。与哺乳动物细胞生长缓慢不同，细菌表达系统可在较短时间内实现大规模蛋白质生产，且培养基成分和生长条件更为简单。然而，由于细菌表达系统缺乏其他相关细胞蛋白（如TIMPs），高浓度的活性MMP容易发生自溶降解，导致MMP产量低下17。
本文介绍了一种利用细菌表达、纯化及激活重组Hisx6-pro-MMP-3cd的详细方法 E. coli 由于其成本低廉、操作简便，且在表达基质金属蛋白酶（MMPs）时产量较高，常被用作表达宿主2,3,18。由于 E. coli 缺乏重组MMPs及其他复杂蛋白所需的蛋白质折叠机制和翻译后加工能力，许多 E. coli 菌株经过基因工程改造以克服这些局限性，使得 E. coli 更适合表达重组人MMP-3cd的宿主19,20例如，本研究中使用的 R2DP 菌株通过提供一种含有在真核生物中罕见密码子的氯霉素抗性质粒，增强了真核表达 E. coli.
如本方案所述，在R2DP细胞中过表达来自pET-3a载体的相对纯净的包涵体（图1）后，提取并变性Hisx6-pro-MMP-3催化结构域（MMP-3cd）蛋白4。利用亲和标签层析纯化Hisx6-pro-MMP-3cd3,19。经复性和透析后，前体MMP-3cd（酶原）由4-氨基苯基汞乙酸盐（APMA）激活，并通过SDS-PAGE分析评估产率及是否需要进一步纯化5,21。本方案以可溶性MMP-3cd的表达、纯化和激活为例进行描述。然而，该方案也可作为其他基质金属蛋白酶（MMPs）及具有相似表达和激活机制的人源蛋白酶表达的参考指南（图2）。对于MMP-3cd以外的其他蛋白，建议读者在尝试本方案前，先确定目标蛋白的最佳缓冲液组成及方法。
图 1：pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 质粒的质粒图谱。 pET-3a 载体包含氨苄青霉素抗性基因。将N端Hisx6标签序列克隆至基于pET-3a的载体中，并插入pro-MMP-3cd，从而构建出由BamHI和NdeI限制性酶切位点之间的T7启动子调控的pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd重组质粒。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：前体MMP-3cd的细菌表达、纯化、复性及激活。 1.1：将pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd质粒转化至BL21(DE3)或R2DP细胞中。1.2：使用IPTG诱导前体MMP-3cd蛋白的表达。1.3：通过化学裂解和超声处理提取主要不溶性的Hisx6-pro-MMP-3cd蛋白，这些蛋白存在于包涵体中。使用尿素使包涵体中的蛋白变性并溶解。2.1：通过亲和层析纯化变性的Hisx6-pro-MMP-3cd蛋白。3．将洗脱得到的Hisx6-pro-MMP-3cd在透析过程中通过缓冲液中尿素的逐步去除实现缓慢复性。4．最后，使用APMA切除N端前肽结构域以激活复性后的MMP-3cd蛋白。随后通过脱盐去除溶液中的APMA。图中数字对应描述这些步骤的实验方案部分。缩写：MMP-3cd = 基质金属蛋白酶-3催化结构域；APMA = 4-氨基苯基汞乙酸盐。请点击此处查看该图的放大版本。
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方案
1. MMP 表达
- pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 在 R2DP 细胞中的克隆与转化
- 消化 pET-3a 质粒（参见 材料表) 用 NdeI 和 BamHI 限制性内切酶在消化缓冲液中进行酶切（参见 材料表在总体积为 40 µL 的反应体系中，加入 4 µL 消化缓冲液、33 µL 浓度为 100 ng/µL 的质粒 DNA，以及每种限制性内切酶各 1.5 µL，于 37 °C 反应约 2 小时，直至反应完全。
- 对MMP-3cd序列进行PCR反应以插入N端His标签。使用25 µL PCR Mix（参见 材料表），2.5 µL 10 µM 引物（补充图 S1），以及1.25 µL的100 ng/µL插入片段序列。加入无菌水至终反应体积为50 µL。
- 将PCR产物和酶切后的载体在1%琼脂糖凝胶上电泳。使用凝胶回收试剂盒纯化凝胶条带（参见 材料表按照制造商的说明书进行。
- 将扩增的PCR产物利用DNA Assembly Mix克隆至经NdeI和BamHI限制性位点消化的载体中（参见 材料表). 使用在线工具确定插入片段和切割载体在总体积为 15 µL 的反应中所需的体积。
- 解冻50 µL高效转化感受态细胞（参见 材料表) 冰上放置直至解冻。预热 SOC 培养基（参见 材料表) 升温至 37 °C，并接种于 LB-氨苄青霉素（LB Amp）平板（参见 材料表).
- 将1-2 µL的pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd连接反应产物加入50 µL分装液中，冰上孵育30分钟。
- 将细胞在42 °C下孵育30秒以进行热激，随后在冰上孵育2分钟。
- 向每种转化混合物中加入950 µL SOC培养基，在37 °C、250 rpm条件下振荡培养1小时。
- 将100 µL转化子涂布于LB Amp平板上，37 °C过夜培养。
- 将每个分离的单菌落接种于10 mL LB Amp培养基中，于37 °C、250 rpm条件下振荡培养过夜。
- 按照质粒小提试剂盒的制造商说明书提取质粒DNA（参见 材料表）。使用 T7 正向引物和反向引物确认载体序列（补充图 S1).
注意：pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 质粒 DNA 可在 -20 °C 保存。准备就绪后，可进行 R2DP 细胞转化。 - 解冻一份20 µL的R2DP细胞等分试样（参见 材料表) 冰上孵育 2–5 分钟。将 SOC 培养基预温至室温，并准备 LB Amp CamR 将培养板置于37 °C（参见 材料表).
- 向50 µL等分试样中加入1 µL浓度为100 ng/µL且经序列确认的pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd。轻轻混匀后将试管放回冰上。
- 将试管置于冰上孵育5分钟。
- 将细胞在42 °C下准确热激30秒。切勿摇动。
- 将细胞置于冰上 2 分钟。
- 向转化混合物中加入80 µL室温SOC培养基，在37 °C、250 rpm条件下振荡培养1小时。
- 将转化子接种至 LB Amp Cam 平板上R 平板并在37 °C下孵育过夜。
- 生长与诱导
- 接种一个来自LB Amp Cam培养基的R2DP pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd转化子的单一分离菌落R 在10 mL LB Amp Cam培养基中接种R 37 °C 下培养。以 250 rpm 振荡培养过夜（约 16 小时）。保存每种培养物的等分试样，并配制 40%（v/v）甘油（参见 材料表（如需要，可保留菌种。）
- 每种过夜培养物接种于含有500 mL LB培养基（添加Amp和Cam）的1 L锥形瓶中R 600 nm 处的光密度（OD）6000.05–0.1
注意：这应使细胞恢复至对数生长期。 - 测量OD600 在多个时间点进行检测，通常持续 3-4 小时，直至其值降至 0.4 至 0.6 之间。
- 诱导前，取部分培养物分装至1.5 mL微量离心管中（参见 材料表）并标记 未诱导组分-80 °C 保存，用于凝胶分析。如不进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，则跳过此步骤，直接进入步骤 1.2.5。
- 使用1 M异丙基-ß-D-硫代半乳糖苷（IPTG）储备液将培养物诱导至终浓度为1 mM（参见 材料表). 继续在37 °C摇床中孵育3-4小时。
注意：在表达过程中，读者应确定最佳OD600 诱导时的IPTG浓度。如果纯化后产量显著下降，可能需要调整纯化缓冲液中的咪唑浓度，或对细胞沉淀进行更充分的超声处理。 - 在离心培养物之前，将部分培养液分装至另一支1.5 mL微量离心管中，并做好标记 诱导分数-80 °C 保存，用于凝胶分析。如不进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，则跳过此步骤，直接进入步骤 1.2.7。
- 将细胞培养物在250 mL锥形瓶中离心（参见 材料表在4 °C、最大转速下离心10分钟。
- 重复步骤1.2.7，直至菌体完全沉淀。
注意：细胞沉淀可在 -80 °C 冻存，后续解冻后继续处理。否则，可跳过此步骤，直接进入步骤 1.3.1。
- 包涵体提取与溶解
注意：请新鲜配制10 M尿素溶液，最好在使用前不超过一天内配制，充分搅拌至完全溶解。切勿加热或对尿素进行高压灭菌；将其在室温下保存。- 将沉淀物（来自步骤 1.2.8）重悬于裂解缓冲液中（参见 材料表每克菌体沉淀加入3 mL裂解缓冲液，通过涡旋或移液重悬。4 °C摇床孵育过夜。
- 加入1.25 mL 10% (w/v) 脱氧胆酸钠（见下文 材料表) 每升培养液。室温下以 150 rpm 振荡 30 分钟。
- 加入10 µL DNase I（参见 材料表每升培养物中加入，于室温下以150 rpm振荡30分钟。
- 13,000 × g 离心 10 分钟 g 和 4 °C。
- 留出一部分 裂解的基质金属蛋白酶 用于凝胶分析。将其保存于 -80 °C。若不进行凝胶分析，则进入步骤 1.3.6。
注意：离心后，沉淀物可能呈丝状且未紧密聚集，此时弃去上清液存在风险。若出现此情况，则跳过步骤 1.3.6，直接进行步骤 1.3.7。 - 弃去离心样品的上清液。
注意：此时可暂停实验流程，将细胞沉淀于 -80 °C 冻存，后续再行解冻。否则，可跳过此步骤，直接进行步骤 1.3.7。 - 将沉淀重悬于100 mL/L的包涵体缓冲液培养物中（参见 材料表通过上下吹打混匀。
- 超声处理过程中，将样品置于冰上以防止过热。每个样品进行6个循环的超声处理，每个循环15秒，输出功率为5，脉冲占空比50%。每两个循环之间间隔15秒以冷却样品。
注意：如有需要，将样品转移至50 mL锥形管中以进行进一步离心（参见 材料表）。在13,000 × g 和 4 °C。 - 留出一部分 超声处理的基质金属蛋白酶 用于凝胶分析。在 -80 °C 下保存。若不进行凝胶分析，则继续执行步骤 1.3.11。
- 检查沉淀物。若呈丝状，则重复步骤1.3.8-1.3.10；若沉淀物紧实，则弃去上清液，进入步骤1.3.12。
注意：可在包涵体缓冲液中重复超声处理，以从裂解的细胞碎片中回收更多蛋白。然而，过度超声会导致剪切效应，从而降低基质金属蛋白酶（MMP）的得率。本步骤可暂停，细胞沉淀可在 -80 °C 冻存，后续再行解冻使用。 - 将每份1 L培养物的沉淀重悬于5 mL溶解缓冲液中（参见 材料表用移液器吹打混匀。冰上孵育至少30分钟，使蛋白质充分溶解。
- 留出一部分 可溶性基质金属蛋白酶 用于凝胶分析。在 -80 °C 下保存。若不进行凝胶分析，则进入步骤 1.3.14。
- 将细胞在13,000 × g下离心10分钟 g 以及 4 °C。切勿丢弃上清液。
- 如果离心后有沉淀形成或仍然存在，将上清液倒入另一个50 mL锥形管中。用移液器吸取5 mL溶解缓冲液（每1 L培养物）上下吹打，重悬沉淀。
- 以 13,000 × g 离心 10 分钟 g 以及 4 °C。切勿丢弃上清液。
- 重复步骤 1.3.13 和 1.3.14，直至离心后几乎无沉淀形成，或仅剩灰色沉淀物。收集上清液。将沉淀物弃去或于 -80 °C 保存，以备进一步超声处理。
2. MMP 的纯化与复性
- His标签（HT）亲和纯化
- 根据制造商的说明书，将充分混匀的Ni-NTA树脂（见材料表）填充至重力流层析柱（见材料表）中。让树脂自然沉降并与保存缓冲液分离，形成清晰的两相界面。
注意：切勿让树脂干燥，否则空气会进入树脂内部，影响蛋白得率。在两次使用之间，需执行第2.2节所述的树脂再生步骤。 - 排尽保存缓冲液。用两倍树脂床体积的HT平衡缓冲液填充层析柱。
- 排尽HT平衡缓冲液并弃去。在排液的同时，将蛋白提取物在13,000 × g条件下离心1分钟，并使用0.22 µm滤器（见材料表）进行过滤除菌。
- 将废液收集容器更换为标记为HT流穿液的50 mL离心管。将制备好的蛋白提取物加入层析柱中。
- 将流穿液重新上样以最大化结合效率。
- 保留一部分流穿组分用于凝胶分析。将其在-80 °C保存。若不进行凝胶分析，可直接进入步骤2.1.7。
- 立即用15 mL HT洗涤缓冲液（见材料表）洗涤树脂。将流穿液收集至标记为HT洗涤的15 mL离心管（见材料表）中。
注意：280 nm处的吸光度值（A280）通过分光光度法测定，并结合分子量和消光系数ε用于估算蛋白浓度。对于变性的Hisx6-pro-MMP-3cd，其分子量为29.86 kDa，ε为34.38 M-1 cm-1。 - 以HT洗涤缓冲液为空白对照，测定并记录A280值。重复步骤2.1.7和2.1.8，对后续洗涤组分进行检测。当A280接近基线且杂质基本去除后，进入步骤2.1.9。
- 保留一部分洗涤组分用于凝胶分析。对多个洗涤组分重复此操作。将各组分在-80 °C保存。若不进行凝胶分析，可直接进入步骤2.1.10。
- 立即加入5 mL HT洗脱缓冲液（见材料表）洗脱His标签蛋白。将洗脱液以0.5–1 mL为一份收集至标记为HT洗脱的微量离心管中。
- 保留一部分洗脱组分用于凝胶分析。对多个洗脱组分重复此操作。将各组分在-80 °C保存。若不进行凝胶分析，可直接进入步骤2.1.12。
- 若A280值>0.3 mg/mL，则用HT平衡缓冲液（见材料表）稀释该组分。
注意：洗脱组分必须稀释至A280 ≤ 0.3 mg/mL，以防止透析过程中发生沉淀。本步骤可暂停，将合并的组分在-80 °C冷冻保存，后续再解冻使用。否则，跳过此步骤，直接进入步骤2.2.1。
- 根据制造商的说明书，将充分混匀的Ni-NTA树脂（见材料表）填充至重力流层析柱（见材料表）中。让树脂自然沉降并与保存缓冲液分离，形成清晰的两相界面。
- 树脂再生
- 用十倍树脂床体积的HT再生缓冲液（见材料表）和十倍树脂床体积的无菌水洗涤树脂。
- 将树脂以50%悬浮液形式保存于含20%（v/v）乙醇的水中。
3. 蛋白质复性
注意：对于较小体积的样品，可使用透析盒以降低样品损失的风险。若使用较大体积，则需要透析管（参见材料表）。
- 透析
注意：透析的最佳蛋白浓度约为 0.3 mg/mL。如果在透析过程中出现明显沉淀，请采用逐步透析法，减小每次透析之间的尿素浓度梯度，并增加中间步骤（例如，从 6 M 降至 5 M，再从 5 M 降至 4 M，而不是跳过 5 M 阶段）。由于冻融循环会破坏细胞和蛋白质结构，因此必须尽量减少实验流程中的暂停。- 根据洗脱组分样品的体积，按照制造商说明书使用适量的透析袋。
- 将洗脱的 MMP 组分置于透析袋中，浸入 1 L 透析缓冲液 1（见材料表）中。在 4 °C 下，使用磁力搅拌器搅拌透析袋及其内容物至少 8 小时。
- 转移至 1 L 透析缓冲液 2（见材料表）。在 4 °C 下，使用磁力搅拌器搅拌透析袋及其内容物至少 8 小时。
- 转移至 1 L 透析缓冲液 3（见材料表）。在 4 °C 下，使用磁力搅拌器搅拌透析袋及其内容物至少 8 小时。
- 将样品转移至新的 50 mL 锥形管中，并标记为透析后 MMP。
- 检查管内是否有沉淀。若形成沉淀，则在 4 °C 下以 13,000 × g 离心 1 分钟。
- 将上清液转移至新的 15 mL 锥形管中，并标记为复性 MMP。
- 留取一部分样品用于凝胶分析，并标记为复性 MMP。将其在 -80 °C 下保存。若不进行凝胶分析，则继续进行步骤 3.1.9。
注意：若得率较低，可将沉淀溶解于 HT 平衡缓冲液中，并使用透析袋重复第 3.1 节的步骤。若不进行凝胶分析或需在此暂停实验流程，可将样品在 -80 °C 冻存，后续再解冻使用。若得率处于理想范围，则进入步骤 3.2.1。
- 再浓缩
注意：复性态与变性态 Hisx6-pro-MMP-3cd 的消光系数应相同，因此 A280 计算不受影响。- 将样品浓缩至最高 0.5 mg/mL。使用 400 mL 搅拌式浓缩池（见材料表）将样品浓缩至 15 mL。为防止起泡，如需进一步浓缩，可使用 50 mL 浓缩管。
注意：若出现沉淀，可将其离心收集并溶解于 HT 平衡缓冲液中，然后重复第 3.1 节及步骤 3.2.1。否则，继续进行步骤 3.2.2。 - 留取一部分样品用于凝胶分析，并标记为浓缩 MMP。
注意：实验流程可在此暂停，样品可在 -80 °C 冻存，后续再解冻使用。
- 将样品浓缩至最高 0.5 mg/mL。使用 400 mL 搅拌式浓缩池（见材料表）将样品浓缩至 15 mL。为防止起泡，如需进一步浓缩，可使用 50 mL 浓缩管。
4. 活化
- 4-氨基苯基汞乙酸盐（APMA）活化
注意：APMA 具有高毒性。在活化前需新鲜配制 20 mM 的 APMA 储存液，使用时务必在通风橱中操作。含 APMA 的废液应弃置于专用容器中。- 每 1 mL MMP 样品（1 mg/mL），加入 50 µL 的 20 mM APMA（参见材料表），使终浓度达到 1 mM。于 37 °C 下孵育过夜。
- 若出现沉淀，于 4 °C 下以最大转速离心 10 分钟。将上清液收集至标记为活化 MMP的 1.5 mL 微量离心管中。沉淀物应弃入标有 APMA 废液的容器中。
- 保留一部分样品用于凝胶分析，并标记为活化 MMP。
注意：本步骤可暂停，样品可在 -80 °C 冻存，后续再解冻使用。若不进行凝胶分析，可直接进入步骤 4.2.1。活化后，MMP-3cd 的分子量和消光系数分别为 19.40 kDa 和 28.42 M-1 cm-1。
- 脱盐
- 使用 2 mL 脱盐柱（参见材料表）按照制造商说明书从活化的 MMP-3cd 样品中去除 APMA。
- 保留一部分样品用于凝胶分析，并标记为脱盐 MMP，于 -80 °C 保存。若不进行凝胶分析，其余样品可直接进入第 4.3 节。
注意：本步骤可暂停，样品可在 -80 °C 冻存，后续再解冻使用。
- SDS-PAGE 凝胶电泳
- 将所有蛋白组分在 SDS-PAGE 凝胶上进行电泳分析：未诱导组分、诱导组分、裂解 MMP、超声处理 MMP、溶解 MMP、穿流组分、洗涤组分、洗脱组分、复性 MMP、浓缩 MMP、活化 MMP 和脱盐 MMP。
- MMP-3 的长期保存
- 向脱盐后的 MMP-3cd 样品中加入 0.05%（v/v）非离子型表面活性剂（参见材料表），于 -80 °C 保存。
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结果
进行SDS-PAGE检测样品时，由于蛋白以不溶性包涵体形式表达，裂解并超声处理后的组分中应含有极少或不含Hisx6-pro-MMP-3cd蛋白，因为此时蛋白尚未在尿素中重新溶解。图3比较了来自BL21(DE3)细胞和R2DP细胞的Hisx6-pro-MMP-3cd蛋白的His标签纯化洗脱组分。在透析前，分别将BL21(DE3)细胞和R2DP细胞的洗脱组分各自合并。各步骤的组分在蛋白脱盐后进行电泳分析（图4）。所有Hisx6-pro-MMP-3cd样品均在约30 kDa处显示一条条带，而在去除His标签和前结构域后，有活性的MMP-3cd在约20 kDa处出现条带（图4和补充图S1）。
在纯化和脱盐 BL21(DE3) 与 R2DP 菌株培养物后，测定 E. coli 培养液中每升所获得的总蛋白产量（表 1）。使用 R2D...
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讨论
大规模生产可溶性人源重组基质金属蛋白酶（MMP）仍是一项具有挑战性的任务。哺乳动物细胞能够表达具有功能的MMP，但成本高昂且耗时较长；而大肠杆菌（E. coli）虽能快速产生大量MMP包涵体，但这些包涵体必须经过纯化和复性11,16。R2DP细胞显著提高了MMP包涵体的产量，从而实现更经济高效的MMP复性过程。然而，大肠杆菌（E. coli）缺乏折叠MMP所需的翻译后修饰机制，尽管经过基因工程改造的菌株表达水平显著提高，但在去除变性剂后，仅部分中间产物能够正确折叠4。因此，在复性和活化过程中仍可能出现MMP沉淀。这些结果表明，在经过复性、活化和脱盐后，纯化的Hisx6-pro-MMP-3cd产量有相当一部分会损失。
通过增加透析步骤并检测MMP-3cd和APMA的浓度，可进一步优化这些阶段。然而，每升培养物中，R2DP细胞产生的功能性MMP-3cd产量比BL21(DE3)细胞高49倍...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者谨此感谢佛罗里达州杰克逊维尔梅奥诊所（Mayo Clinic in Jacksonville, Florida）的 Evette Radisky 博士和 Alexandra Hockla，她们提供了 pET-3a-pro-MMP-3cd 质粒作为克隆 Hisx6pro-MMP-3cd 基因的模板，并提出了宝贵意见；同时感谢内华达大学里诺分校内华达基因组中心（Nevada Genomics Center at the University of Nevada, Reno）的 Paul Hartley 博士提供 DNA 测序服务。作者还感谢 Cassandra Hergenrader 在部分蛋白质表达实验中的协助。M.R.-S. 谨此感谢 NIH-P20 GM103650-COBRE 神经科学整合研究资助项目及内华达大学里诺分校研究发展计划（UNR R&D 显微种子基金奖
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 无菌滤器 | Sigma Aldrich | SLGP033RS | 用于在纯化前去除蛋白提取物中的部分污染物，并防止镍-NTA柱堵塞 |
| 1 L 锥形瓶 | Thermo Fisher Scientific | S76106F | n/a |
| 1 L 玻璃瓶 | Thermo Fisher Scientific | 06-414-1D | n/a |
| 1.5 mL 微量离心管 | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | n/a |
| 15 mL 圆锥形离心管 | Thermo Fisher Scientific | 339650 | n/a |
| 18 G，1 英寸斜面针头 | Amazon | B07S7VBHM2 | 与透析夹板联合使用 |
| 2 mL 脱盐柱 | Thermo Fisher Scientific | 89890 | 去除激活后残留的 APMA |
| 2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES) | Thermo Fisher Scientific | AAA1610422 | n/a |
| 250 mL 圆锥瓶缓冲垫 | Thermo Fisher Scientific | 05-538-53A | 在大体积离心过程中稳定圆锥瓶 |
| 250 mL 圆锥瓶 | Thermo Fisher Scientific | 05-538-53 | n/a |
| 400 mL 搅拌式超滤池 | Sigma Aldrich | UFSC40001 | 可浓缩比离心过滤装置更大体积的样品。Rosetta2(DE3)pLysS 细胞产生的蛋白量较高，可能超过离心过滤装置 15 mL 的容量限制 |
| 4-氨基苯基汞乙酸盐 (APMA) | Sigma Aldrich | A9563-5G | 通过切割前肽激活 MMP-3 |
| 5 mL 注射器 | Thermo Fisher Scientific | NC0829167 | 与透析夹板联合使用 |
| 50 mL 圆锥形离心管 | Thermo Fisher Scientific | 339650 | 用于多个纯化步骤中的样品储存 |
| 50 mL 再浓缩管 | Sigma Aldrich | UFC901024D | 用于透析后蛋白样品的再浓缩或去除污染物 |
| 琼脂 | Thermo Fisher Scientific | BP1423-500 | 缓冲液成分，使高压灭菌后的 LB 培养基在冷却后凝固 |
| 氨苄青霉素 | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | 与 pET3a 载体联用的抗生素；在 LB 培养基中使用浓度为 100 µg/mL |
| BamHI | NEB | R3136S | 与 pET3a 载体联用的限制性内切酶 |
| 氯化钙 (CaCl2) | Thermo Fisher Scientific | 600-30-23 | 钙离子可稳定 MMP 的结构 |
| 涂布棒 | Thermo Fisher Scientific | 50-189-7544 | 转化后可用于将细胞均匀涂布于培养皿表面 |
| 氯霉素 | Thermo Fisher Scientific | 22-055-125GM | 与 pET3a 载体联用的抗生素；在 LB 培养基中使用浓度为 34 µg/mL |
| 透析缓冲液 1 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，150 mM NaCl，10 mM CaCl2，1 µM ZnCl2，4 M 尿素 |
| 透析缓冲液 2 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，150 mM NaCl，10 mM CaCl2，1 µM ZnCl2，2 M 尿素 |
| 透析缓冲液 3 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，150 mM NaCl，10 mM CaCl2，1 µM ZnCl2 |
| 透析夹 | Thermo Fisher Scientific | 68011 | 与蛇皮透析管联合使用 |
| 透析管 | Thermo Fisher Scientific | 88243 | 另一种透析方法，可容纳更大体积的样品，但样品损失风险较高 |
| 消化缓冲液 | NEB | B7204S | 用于消化 pET3a 载体 |
| 一次性比色皿 | Thermo Fisher Scientific | 21-200-257 | 用于测量细菌培养过程中的 OD 值以监测生长和表达情况 |
| 二硫苏糖醇 (DTT) | Thermo Fisher Scientific | D107125G | 通过还原二硫键协助蛋白变性 |
| DNA 连接反应混合液 | NEB | E2621S | 用于连接 Hisx6-pro-MMP-3cd PCR 产物与酶切后的 pET3a 载体 |
| DNase I | NEB | M0303S | 内切核酸酶，用于降解可能影响后续蛋白纯化的不利 DNA 污染物 |
| 乙醇 | Thermo Fisher Scientific | A995-4 | n/a |
| 乙二胺四乙酸 (EDTA) | Thermo Fisher Scientific | J15694-AE | 用于变性过程，防止氧化及二硫键的形成 |
| 凝胶回收试剂盒 | Promega | A9281 | 从琼脂糖凝胶中分离并纯化 DNA |
| 甘油 | Thermo Fisher Scientific | G33-500 | 用于制备甘油菌，于 -80 °C 冻存 |
| 重力流层析柱 | BioRad | 7321010 | 用于纯化带有重组组氨酸标签的蛋白 |
| 高效转化感受态细胞 | NEB | C2987 | 具有高转化效率的感受态细胞，可提高将 N 端 His 标签克隆至 pET3a-pro-MMP-3cd 构建体的成功率 |
| HT 洗脱缓冲液 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，50 mM NaCl，6 M 尿素，250 mM 咪唑。调节 pH 至 7.4 |
| HT 平衡缓冲液 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，50 mM NaCl，6 M 尿素。调节 pH 至 7.4 |
| HT 再生缓冲液 | n/a | n/a | 20 mM MES，0.1 M NaCl。调节 pH 至 5.0 |
| HT 洗涤缓冲液 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，50 mM NaCl，6 M 尿素，25 mM 咪唑。调节 pH 至 7.4 |
| 盐酸 (HCl) | Thermo Fisher Scientific | A144C-212 | 用于调节缓冲液 pH |
| 咪唑 | Thermo Fisher Scientific | AAA1022122 | 模拟组氨酸侧链基团，用于将非特异性结合的蛋白与 His 标签目标蛋白分离 |
| 包涵体缓冲液 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA，100 mM NaCl，5 mM DTT，2% v/v Triton X-100，0.5 M 尿素。调节 pH 至 8.0 |
| 异丙基-ß-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | FERR0392 | 诱导 pET3a 载体中目标基因表达的试剂。配制 0.5 mL 1 M 分装液，过滤除菌后于 -20 °C 保存 |
| LB Amp CamR 培养基 | n/a | n/a | 应倒入无菌 1 L 瓶或 1 L 锥形瓶中。配制 1 L 培养基时加入 25 g LB 肉汤，高压灭菌。冷却至 50 °C 以下后，加入氨苄青霉素至 100 µg/mL 和氯霉素至 34 µg/mL |
| LB Amp CamR 平板 | n/a | n/a | 应倒入无菌培养皿中，倒至培养皿盖完全覆盖为止。1 L 培养基可制备 40–60 个平板。配制 1 L 培养基时加入 25 g LB 肉汤和 16 g 琼脂，高压灭菌。冷却至 50 °C 以下后，加入氨苄青霉素至 100 µg/mL 和氯霉素至 34 µg/mL |
| LB 肉汤 | Thermo Fisher Scientific | BP1426-2 | 预先混合了胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠 |
| 裂解缓冲液 | n/a | n/a | 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA，100 mM NaCl，0.133 g/mL 溶菌酶，0.49% v/v Triton X-100。调节 pH 至 8.0 |
| 溶菌酶 | MP Biomedicals | 195303 | 用于蛋白提取，是一种可裂解细菌细胞壁的酶 |
| 质粒小提试剂盒 | Promega | A1330 | 若成功，可从转化子中提取 pET3a-pro-MMP-3cd 构建体 |
| NdeI | NEB | R0111S | 与 pET3a 载体联用的限制性内切酶 |
| Ni-NTA 树脂 | Thermo Fisher Scientific | PI88221 | 用于结合重组 His 标签蛋白。该强相互作用可通过高浓度咪唑洗脱而解除 |
| 非离子型表面活性剂 | Thermo Fisher Scientific | PI28316 | 用于防止 MMP 聚集的储存用去垢剂。可减少 MMP 表面疏水残基与水分子之间的相互作用，同时不破坏其催化活性 |
| PCR 反应混合液 | NEB | M0492S | 用于将 N 端 His 标签插入 pET3a-pro-MMP-3cd 载体的 PCR 试剂 |
| pET 质粒 | Addgene | n/a | pET3a 载体提供氨苄青霉素抗性、目标基因的可诱导表达以及使用 T7 引物进行测序的功能 |
| 培养皿 | VWR | 25384-342 | 用于在 LB 琼脂培养基上涂布转化子 |
| R2DP 细胞 | Novagen | 714033 | BL21 衍生菌株，可增强真核蛋白的表达，含有在大肠杆菌中稀有密码子对应的 tRNA |
| SOC 生长培养基 | NEB | B9020S | 转化过程中用于快速生长的非选择性培养基 |
| 氯化钠 (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | 用于缓冲液配制，并有助于维持蛋白稳定性 |
| 脱氧胆酸钠 | Thermo Fisher Scientific | PI89905 | 用于蛋白提取的去垢剂，可裂解细胞壁 |
| 溶解缓冲液 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，50 mM NaCl，10 mM DTT，6 M 尿素。调节 pH 至 8.0 |
| Tris 碱 | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | 常用于生理 pH 范围的缓冲液，对温度敏感 |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | M1122980101 | 用于细胞裂解的去垢剂 |
| 尿素 | Thermo Fisher Scientific | AAJ75826A7 | 第一种破坏蛋白二级结构的变性剂 |
| 氯化锌 (ZnCl2) | Thermo Fisher Scientific | AAA162810E | 稳定 MMP 结构。锌离子存在于 MMP-3 的催化位点中 |
参考文献
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