Method Article

使用相干拉曼散射成像对皮肤内的药物化合物进行可视化和定量

DOI:

10.3791/63264

⸱

November 24th, 2021

 ,  ,  , 
1Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种相干拉曼散射成像方法，用于可视化和量化皮肤内的药物化合物。本文介绍了皮肤组织制剂（人和小鼠）和局部制剂的应用，用于量化时空浓度曲线的图像采集，以及用于评估局部药物递送的初步药代动力学分析。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

局部制剂应用后的皮肤药代动力学（cPK）一直是监管和药物开发科学家特别感兴趣的研究领域，以机械方式了解局部生物利用度（BA）。半侵入性技术，如胶带剥离、真皮微透析或真皮开流微灌注，均可量化大尺度 cPK。虽然这些技术提供了大量的cPK知识，但社区缺乏对细胞水平的活性药物成分（API）渗透和渗透的机制理解。

解决微尺度cPK的一种非侵入性方法是相干拉曼散射成像（CRI），其选择性地靶向内在分子振动，而无需外在标记或化学修饰。CRI有两种主要方法 - 相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和刺激拉曼散射（SRS） - 能够对API或非活性成分进行灵敏和选择性定量。CARS通常用于获取结构皮肤信息或可视化化学对比度。相比之下，SRS信号与分子浓度呈线性关系，用于量化皮肤分层中的API或非活性成分。

虽然小鼠组织通常用于CPK与CRI，但在监管批准之前，最终必须在人体组织中评估局部BA和生物等效性（BE）。本文提出了一种制备和成像 离体 皮肤的方法，用于定量药代动力学CRI研究，以评估局部BA和BE。随着时间的推移，该方法可在人类和小鼠皮肤内实现可靠且可重复的API定量。定量富脂区和贫脂区室内的浓度，以及随时间推移的总API浓度;这些用于估计微观和宏观尺度的BA，以及潜在的BE。

Introduction

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局部药物产品应用后评估cPK的方法已从经典的体外渗透试验（IVPT）研究1，2，3，4，5和胶带剥离6，7，8扩展到其他方法，如开流微灌注或真皮微透析9，10，11，12，13，14.根据感兴趣的疾病，可能存在各种治疗作用的局部部位。因此，可能有相应数量的方法来评估 API 到达预期本地操作站点的速率和程度。虽然上述每种方法都有其优点，但主要缺点是缺乏微尺度的cPK信息（即无法可视化API的去向及其....

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Protocol

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裸鼠耳组织的使用得到了马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，而人体皮肤组织的使用则得到了马萨诸塞州总医院机构审查委员会（IRB）的批准。根据IACUC协议，新鲜安乐死的小鼠是从具有裸鼠菌落的合作者那里获得的。人体组织是通过批准的协议从马萨诸塞州总医院的选择性腹部整形手术中采购的。此外，腹部皮肤以外的特定组织类型是通过身体捐赠机构获得的，也是通过IRB批准的协议获得的。

1. 组织制剂

  1. 裸鼠耳皮肤组织的制备
    1. 获得新鲜收获的裸鼠身体后，使用镊子和显微外科剪刀去除耳朵。将一只耳朵放在一个小培养皿中（即35毫米x 10毫米）。将裸鼠身体放入生物危害袋中，按照当地的IACUC协议进行处理。
    2. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗每个小鼠耳朵，并用任务刮水器轻轻拍干。重复两次以清除耳朵上可能影响成像质量的任何残留污垢或碎屑（见 图1）。
    3. 如果要在24小时内使用耳朵，请将其放入冰箱（2-8°C）中带有新鲜PBS的小培养皿（即 35 mm x 10 mm）。如果在收获24小时后将使用耳朵，请将其置于没有PBS的培养皿（35 mm x 10 mm）中，用parafilm覆盖培养皿，并将其置于-20°C冰箱中。
  2. 人体皮肤组织的制备
    1. 采购人体组织后，将其放置....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

如果组织在实验完成后没有在轴向（<10μm）或横向方向上显着移动，则认为成像成功（图4）。如果目标 API 的 SRS 测量值不代表初始深度，则立即表明初始深度的定量是层特异性的。通过对每个感兴趣的 XY 位置进行 z 轴成像来缓解这种情况，权衡是时间分辨率。如果在这些研究中使用冷冻皮肤，则与新鲜皮肤相比，API的渗透和渗透速度很快，并且从配方应用到开始成像之间的最短时间至关重要。另一个考虑因素是用于实验的物镜。如果使用60倍物镜，则在单个视场（FOV）内选择平坦表面相对容易;然而，对于20倍物镜，视野要大得多，因此，组织制备的关键步骤是确保皮肤与玻璃底成像皿的均匀接触。与 FOV 内的原始深度相比，平坦的 FOV 和相似的深度是获得积极结果的两个关键因素。

除了图像的动态范围外，激光的对准也必须非常小心地解决。激光脉冲序列与显微镜的错位会导致一系列问题，包括低信号电平或不均匀激发的FOV，这可能会导致低对比度图像。另一个考虑因素是确保在采集图像时利用强度值的整个动态范围;否则，成像数据被压缩，并且可能难以检测浓度差.......

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Discussion

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局部BA / BE的评估是一个研究领域，需要多方面的方法，因为没有一种方法可以完全表征 体内 cPK。该协议提出了一种基于相干拉曼成像的局部药物产品BA / BE评估方法。可能被忽视的第一点是皮肤样品必须有多薄，特别是对于定量传输SRS成像。如果皮肤太厚（即光 不能轻易通过），SRS检测器测量的信号很少甚至没有，因此它将提供较差的浓度数据。必须注意正确制备这些组织样本，因为这可以成就或破坏实验。就裸鼠耳朵而言，除了用PBS冲洗并拍干以去除耳朵上残留的污垢外，几乎不需要准备。

小鼠耳朵的厚度通常为几百μm，这是传输SRS的最佳选择。人体皮肤样本通常为几毫米厚，包括皮下脂肪，尽管厚度高度可变，具体取决于皮肤组织的解剖来源和供体的年龄。因此，必须尽可能多地去除多余的组织，以准确量化表皮和真皮中随着时间的推移的脂质结构和API浓度。如果忽略了组织制备步骤，则实验设置的其余步骤将在很大程度上不合适，因为起始条件不是最佳的。

激光/显微镜设置是下一个挑战或潜在的绊脚石。激光在光束路径中未对准并最终进入显.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CLE是CARS显微镜专利的发明人，这些专利已授权给多家显微镜制造商。所有其他作者没有利益冲突需要披露。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者要感谢埃文斯小组的Fotis Iliopoulos博士和Daniel Greenfield博士对本手稿的讨论和校对。此外，作者还希望得到LEO Pharma的支持。 图 2 是使用 BioRender.com 创建的。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
组织制剂
可高压灭菌的生物危害袋FisherBrand22-044562如文所述：生物危害袋
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&搜索类型=RAPID&matchedCatNo=22044562
细胞培养缓冲液：Dulbecco 磷酸盐缓冲盐溶液 1x康宁MT21030CV文中所述：PBS
https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&搜索类型= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv
一次性手术刀Exel International14-840-00如文所述： 手术刀
https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true
高精度 45°角广尖镊子/镊子Fisherbrand12-000-132如文中所述： 镊子
https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=
Kimwipes Delicate Task 擦拭器，1 层Kimberly-Clark Professional Kimtech Science06-666文中提及： task wiper
https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666
Parafilm M 实验室包装膜Bemis13-374-12文中提及： parafilm
https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412
培养皿 （35 mm x 10 mm）FisherbrandFB0875711YZ文中提及： 小培养皿
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true
培养皿 （60 mm x 15 mm）FisherbrandFB0875713A文中提及： 大培养皿
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true
手术剪刀RobozNC9411473如文所述：剪刀
https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&搜索类型=RAPID&matchedCatNo=RS-5915SC
strong>激光器/显微镜
650/60 nm BrightLine 单波段带通滤光片Semrock如文所述： CARS 滤光片 - CH2 振动（645nm/60nm 滤光片）
控制盒 IX2-UCBOlympus如文所述： 控制盒
D700/30mChroma文中提到的： CARS 过滤器 - 氘
https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m
DeepSee InsightSpectra-Physics文中提到的： Laser
https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser
数字手持式光功率和能量计控制台ThorLabsPM100D文中提及： 功率计
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Fluoview 软件奥林巴斯文中提及： 显微镜控制软件
磨砂显微镜载玻片FisherBrand文中提及： 显微镜载玻片
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446
FV1000奥林巴斯文中提到的： 显微镜
孵育室Tokai HitGM-800文中提到的： 孵育室
积分球 光电二极管 功率传感器ThorLabsS142C文中提到的： 光电二极管
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
电源 FV31-PSU奥林巴斯如文所述： 电源
Precision 4063,80MHz 双通道函数发生器BK Precision如文所述： 函数发生器
ProScan –精密显微镜自动化Prior Scientific Instruments文中提到的： 载物台控制器
https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation
SecureSeal 成像垫片Grace Biolabs654004文中提到的： spacer
https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/
SRS 检测试剂盒APE文中提到的： SRS 检测器
UPLSAPO 20X NA：0.75奥林巴斯文中提到的： 20X 物镜
https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/
脂质/药物成像
 35 mm 培养皿，0 号无涂层盖玻片，14 mm 玻璃直径MatTek CorporationNC9711297文中提及： 玻璃底培养皿
https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297
棉签贴标机FisherBrand如文中所示： 棉签贴标机
Distriman 后置活塞式移液器Gilson文中提到的： 正置活塞式移液器
https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=
Distriman 正置活塞式移液器吸头Gilson文中提到的： 移液器吸头
https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true
数据分析
斐济开源如文中提及： FIJI/ImageJ
https://imagej.net/software/fiji/
Jupyter-Lab开源如文中提及： JupyterLab
https://jupyter.org/
Rstudio开源如文中提及： Rstudio
https://www.rstudio.com/
如<

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. Transdermal and topical drug delivery: principles and practice. Benson, H. E., Watkinson, A. C. , John Wiley & Sons. Hoboken NJ USA. 85-108 (2012).
  2. Shin, S. H., et al.

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