本文介绍了一种相干拉曼散射成像方法，用于可视化并定量皮肤中的药物化合物。文中描述了皮肤组织（人和小鼠）的制备及外用制剂的应用，图像采集以定量分析药物在空间和时间上的浓度分布，以及初步的药代动力学分析，以评估外用药物的递送效果。
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本文内容
摘要
摘要
局部用药后皮肤药代动力学（cPK）一直是监管和药物研发科学家特别关注的研究领域，旨在从机制上理解局部生物利用度（BA）。半侵入性技术如胶带剥离法、皮肤微透析或皮肤开放流动微灌注，均可定量测定宏观尺度的cPK。尽管这些技术已提供了大量cPK知识，但学界仍缺乏对活性药物成分（API）在细胞水平上渗透与透过过程的机制性理解。
一种用于研究微尺度化学成分分布（cPK）的非侵入性方法是相干拉曼散射成像（CRI），该方法可选择性地靶向内源性分子振动，无需使用外源性标记物或化学修饰。CRI主要有两种技术——相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS），可用于对活性药物成分（APIs）或非活性辅料进行高灵敏度和选择性的定量分析。CARS通常用于获取皮肤结构信息或可视化化学对比。相比之下，SRS信号与分子浓度呈线性关系，因此可用于定量分析皮肤各层中的活性药物成分或非活性辅料。
尽管小鼠组织已常用于通过CRI进行cPK研究，但在获得监管批准之前，局部BA和生物等效性（BE）最终必须在人体组织中进行评估。本文介绍了一种制备和成像人体组织样本的方法学 离体 用于定量药代动力学CRI研究，以评估局部用药的生物利用度（BA）和生物等效性（BE）。该方法可实现对人和小鼠皮肤中活性药物成分（API）随时间变化的可靠且可重复的定量。可分别量化脂质富集区和脂质贫乏区中的API浓度，以及随时间变化的总API浓度；这些数据可用于估算微观和宏观尺度的BA，并可能用于BE评估。
引言
在局部药物制剂应用后，评估局部药代动力学（cPK）的方法已从传统的体外透皮试验（IVPT）1,2,3,4,5和胶带剥离法6,7,8，扩展到其他方法，如开放流动微透析或皮肤微透析9,10,11,12,13,14。根据所关注疾病的差异，治疗作用的局部靶点可能各不相同。因此，可能需要相应数量的不同方法来评估活性药物成分（API）到达预期局部作用部位的速率和程度。尽管上述每种方法都有其优势，但主要缺点是缺乏微尺度cPK信息（....
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方案
使用裸鼠耳部组织的研究已获得麻省总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，而使用人皮肤组织的研究已获得麻省总医院机构审查委员会（IRB）的批准。根据IACUC的规定， freshly euthanized的小鼠由拥有裸鼠品系的合作研究人员提供。人组织通过经批准的方案，从麻省总医院进行的选择性腹部成形术中获取。此外，除腹部皮肤外的特定组织类型通过遗体捐赠机构获得，该过程同样遵循经IRB批准的方案。
1. 组织制备
- 裸鼠耳部皮肤组织的制备
- 获取新鲜收获的裸鼠尸体后，使用镊子和显微外科剪刀取下耳朵。将一只耳朵放入小型培养皿（例如 35 mm × 10 mm）中。将裸鼠尸体置于生物危害废物袋中，按照当地实验动物管理与使用委员会（IACUC）的规定进行处理。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗每只小鼠耳部，并用实验擦拭纸轻轻吸干。重复两次，以去除耳部残留的污物或碎屑，这些物质可能影响成像质量（参见 图1).
- 如果耳朵将在24小时内使用，将其置于一个小培养皿中（例如, 在冰箱（2-8 °C）中，将耳组织置于含有新鲜PBS的培养皿（35 mm × 10 mm）内。若耳组织在采集后24小时以上使用，则将其放入无PBS的培养皿（35 mm × 10 mm）中，用封口膜封住皿口，并置于-20 °C冰箱中保存。
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结果
如果实验结束时组织在轴向（<10 μm）或横向方向上未发生显著移动，则认为成像成功（图4）。这可以立即提示所测得的目标活性药物成分（API）的受激拉曼散射（SRS）信号是否能代表初始深度处的情况，因为定量分析是分层特异性的。为缓解此问题，可对每个感兴趣的XY位置采集z轴层扫图像，但代价是时间分辨率降低。若在研究中使用冷冻皮肤，其API的渗透和透过速度相比新鲜皮肤更快，因此制剂施加后应尽快开始成像。另一个需考虑的因素是实验所用物镜。若使用60倍物镜，在单个视野（FOV）内选择一个平坦区域相对容易；然而，若使用20倍物镜，其视野范围更大，因此组织制备中的关键步骤是确保皮肤与玻璃底成像皿之间接触均匀。获得平坦的视野以及视野内各点的深度与原始深度相近，是获得理想结果的两个关键因素。
激光的准直以及图像的动态范围必须得到极为细致的处理。若激光脉冲序列在显微镜中的准直不良，可能导致一系列问题，包括信号水平过低或视野（FOV）激发不均，从而产生对比度低的图像。另一个需要考虑的因素是在采集图像时应充分利用整个强度值的动态范围；否则，.......
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讨论
局部生物利用度/生物等效性（BA/BE）的评估是一个需要多维度方法的研究领域，因为单一技术无法全面表征 在体 cPK。本方案介绍了一种基于相干拉曼成像评估局部药物产品生物利用度（BA）/生物等效性（BE）的方法学。其中，一个容易被忽视的关键点是皮肤样本必须足够薄，尤其是对于定量透射式SRS成像而言。若皮肤过厚（即， 由于光线难以穿透，受激拉曼散射（SRS）探测器测得的信号极弱或几乎没有，因此将无法提供可靠的浓度数据。必须谨慎妥善地制备这些组织样本，因为样本制备的质量可能直接决定实验的成败。对于裸鼠耳部组织，除用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗并轻轻拍干以去除耳部残留污物外，基本无需其他预处理步骤。
小鼠耳朵的厚度通常为几百微米（µm），适合透射式SRS检测。人皮肤样本通常包含皮下脂肪，厚度可达几毫米（mm），但具体厚度因皮肤组织的解剖来源及供体年龄而有显著差异。因此，必须尽可能去除多余的组织，以准确量化随时间变化的表皮和真皮中脂质结构及活性药物成分（API）的浓度。若忽略组织制备步骤，则后续实验设置的大部分操作将因起始条件非最优而变得极不适用。
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披露
CLE 是已授权给多家显微镜制造商的 CARS 显微技术相关专利的发明人。其余所有作者均无利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Evans 研究组的 Fotis Iliopoulos 博士和 Daniel Greenfield 对本文手稿的讨论与校对。此外，作者感谢 LEO Pharma 提供的支持。图 2 使用 BioRender.com 制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 组织制备 | |||
| 可高压灭菌的生物危害袋 | FisherBrand | 22-044562 | 文中提及：生物危害袋 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
| 细胞培养缓冲液：杜氏磷酸盐缓冲盐溶液 1x | Corning | MT21030CV | 文中提及：PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv |
| 一次性手术刀 | Exel International | 14-840-00 | 文中提及：手术刀 https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
| 高精度 45° 角宽头镊子/持针钳 | Fisherbrand | 12-000-132 | 文中提及：持针钳 https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
| Kimwipes 精细任务擦拭纸，单层 | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | 文中提及：任务擦拭纸 https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
| Parafilm M 实验室包裹膜 | Bemis | 13-374-12 | 文中提及：Parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
| 培养皿（35 mm × 10 mm） | Fisherbrand | FB0875711YZ | 文中提及：小型培养皿 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
| 培养皿（60 mm × 15 mm） | Fisherbrand | FB0875713A | 文中提及：大型培养皿 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
| 手术剪 | Roboz | NC9411473 | 文中提及：剪刀 https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC |
| 激光器/显微镜 | |||
| 650/60 nm BrightLine 单通带带通滤光片 | Semrock | 文中提及：CARS 滤光片 - CH2 振动（645 nm/60 nm 滤光片） | |
| 控制箱 IX2-UCB | Olympus | 文中提及：控制箱 | |
| D700/30m | Chroma | 文中提及：CARS 滤光片 - 氘化带 https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m | |
| DeepSee Insight | Spectra-Physics | 文中提及：激光器 https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser | |
| 数字手持式光学功率和能量计主机 | ThorLabs | PM100D | 文中提及：功率计 https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Fluoview 软件 | Olympus | 文中提及：显微镜控制软件 | |
| 磨砂显微镜载玻片 | FisherBrand | 文中提及：显微镜载玻片 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 | |
| FV1000 | Olympus | 文中提及：显微镜 | |
| 孵育腔 | Tokai Hit | GM-800 | 文中提及：孵育腔 |
| 积分球光电二极管功率传感器 | ThorLabs | S142C | 文中提及：光电二极管 https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| 电源 FV31-PSU | Olympus | 文中提及：电源 | |
| Precision 4063，80 MHz 双通道函数发生器 | BK Precision | 文中提及：函数发生器 | |
| ProScan – 精密显微镜自动化系统 | Prior Scientific Instruments | 文中提及：载物台控制器 https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation | |
| SecureSeal 成像间隔垫 | Grace Biolabs | 654004 | 文中提及：间隔垫 https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
| SRS 检测套件 | APE | 文中提及：SRS 检测器 | |
| UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | 文中提及：20X 物镜 https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ | |
| 脂质/药物成像 | |||
| 35 mm 培养皿，未包被盖玻片，14 mm 玻璃直径 | MatTek Corporation | NC9711297 | 文中提及：玻璃底培养皿 https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
| 棉签 | FisherBrand | 文中提及：棉签 | |
| Distriman 正向置换移液器 | Gilson | 文中提及：正向置换移液器 https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= | |
| Distriman 正向置换移液器吸头 | Gilson | 文中提及：移液器吸头 https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true | |
| 数据分析 | |||
| FIJI | 开源 | 文中提及：FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ | |
| Jupyter-Lab | 开源 | 文中提及：JupyterLab https://jupyter.org/ | |
| Rstudio | 开源 | 文中提及：Rstudio https://www.rstudio.com/ |
参考文献
- Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. Transdermal and topical drug delivery: principles and practice. Benson, H. E., Watkinson, A. C. , John Wiley & Sons. Hoboken NJ USA. 85-108 (2012).
- Shin, S. H., et al.
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重印与许可
