本文介绍了一种相干拉曼散射成像方法，用于可视化并定量皮肤中的药物化合物。文中描述了皮肤组织（人和小鼠）的制备及外用制剂的应用，图像采集以定量分析药物在空间和时间上的浓度分布，以及初步的药代动力学分析，以评估外用药物的递送效果。
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摘要
摘要
局部用药后皮肤药代动力学（cPK）一直是监管和药物研发科学家特别关注的研究领域，旨在从机制上理解局部生物利用度（BA）。半侵入性技术如胶带剥离法、皮肤微透析或皮肤开放流动微灌注，均可定量测定宏观尺度的cPK。尽管这些技术已提供了大量cPK知识，但学界仍缺乏对活性药物成分（API）在细胞水平上渗透与透过过程的机制性理解。
一种用于研究微尺度化学成分分布（cPK）的非侵入性方法是相干拉曼散射成像（CRI），该方法可选择性地靶向内源性分子振动，无需使用外源性标记物或化学修饰。CRI主要有两种技术——相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS），可用于对活性药物成分（APIs）或非活性辅料进行高灵敏度和选择性的定量分析。CARS通常用于获取皮肤结构信息或可视化化学对比。相比之下，SRS信号与分子浓度呈线性关系，因此可用于定量分析皮肤各层中的活性药物成分或非活性辅料。
尽管小鼠组织已常用于通过CRI进行cPK研究，但在获得监管批准之前，局部BA和生物等效性（BE）最终必须在人体组织中进行评估。本文介绍了一种制备和成像人体组织样本的方法学 离体 用于定量药代动力学CRI研究，以评估局部用药的生物利用度（BA）和生物等效性（BE）。该方法可实现对人和小鼠皮肤中活性药物成分（API）随时间变化的可靠且可重复的定量。可分别量化脂质富集区和脂质贫乏区中的API浓度，以及随时间变化的总API浓度；这些数据可用于估算微观和宏观尺度的BA，并可能用于BE评估。
引言
在局部药物制剂应用后，评估局部药代动力学（cPK）的方法已从传统的体外透皮试验（IVPT）1,2,3,4,5和胶带剥离法6,7,8，扩展到其他方法，如开放流动微透析或皮肤微透析9,10,11,12,13,14。根据所关注疾病的差异，治疗作用的局部靶点可能各不相同。因此，可能需要相应数量的不同方法来评估活性药物成分（API）到达预期局部作用部位的速率和程度。尽管上述每种方法都有其优势，但主要缺点是缺乏微尺度cPK信息（即无法可视化API的分布路径及其渗透方式）。
一种用于估算局部生物利用度（BA）和生物等效性（BE）的非侵入性方法是相干拉曼成像（CRI），该方法可分为两种成像模式：受激拉曼散射（CARS）和同步拉曼散射（SRS）显微技术。这些相干拉曼方法通过非线性拉曼效应，实现对分子的化学特异性成像。在CRI中，两束激光脉冲序列被聚焦并扫描样品内部，激光频率之间的能量差被设定为针对目标化学结构特有的振动模式。由于CRI过程具有非线性特性，信号仅在显微镜焦点处产生，从而实现组织三维药代动力学断层成像。在体外药代动力学（cPK）研究中，CARS已被用于获取组织结构信息，例如富含脂质的皮肤结构的位置15。相比之下，SRS因其信号与分子浓度呈线性关系，已被用于定量分析分子浓度。对于离体（ex vivo）皮肤样本，通常建议在反射方向（epi-direction）进行CARS成像16，而在透射模式下进行SRS成像17。因此，较薄的组织样本更有利于SRS信号的检测与定量。
作为一种模型组织，裸鼠耳朵具有多种优势且缺点较少。其优势之一在于组织本身厚度已约为 200–300 µm，无需进一步的样品制备。此外，通过轴向聚焦单个视野即可观察到多种皮肤分层结构（例如，角质层、皮脂腺（SGs）、脂肪细胞和皮下脂肪）16,18。这使得在转向人皮肤样本之前，可对经皮渗透途径和局部生物利用度（BA）进行初步的临床前评估。然而，裸鼠模型也存在局限性，例如由于皮肤结构的差异，难以外推至体内实际情况19。尽管裸鼠耳朵是获取初步结果的优良模型，人皮肤模型仍是金标准。尽管目前已有多种关于冷冻人皮肤是否适合准确重现体内渗透动力学的讨论20,21,22，使用冷冻人皮肤已被广泛接受为评估体外 活性药物成分（API）渗透动力学的方法23,24,25。本方案在可视化小鼠和人皮肤中多种皮肤层的同时，定量分析脂质富集和脂质贫乏结构中的 API 浓度。
尽管化学成像（CRI）已广泛应用于多个领域，以特异性可视化组织中的化合物，但针对外用药物产品的局部药代动力学（cPK）研究仍较为有限。若要利用CRI评估外用制剂的局部生物利用度（BA）和生物等效性（BE），首先必须建立标准化的操作流程，以实现准确比较。以往使用CRI研究药物经皮递送的研究中，数据存在一定的变异性。由于CRI在该领域的应用相对较新，建立统一的实验方案对于获得可靠结果至关重要18,26,27。该方法仅针对拉曼光谱中生物静默区（silent region）的某一特定波数进行检测。然而，大多数活性药物成分（API）和非活性辅料的拉曼位移均位于指纹区（fingerprint region）。此前，由于组织在指纹区本身会产生固有的拉曼信号，这给检测带来了挑战。近年来激光技术与计算方法的进步已克服了这一障碍，且这些技术可与本文所述方法结合使用28。本文提出的方法能够对外部药物中拉曼位移位于静默区（2,000–2,300 cm-1）的活性成分进行定量分析。该方法不受药物理化性质的限制，而某些先前报道的cPK监测方法可能存在此类限制29。
该方案必须降低不同制备样品间皮肤厚度的差异性，因为较厚的人类皮肤样品在施用药物产品后会因样品本身对光的散射而产生微弱信号。本文的目标之一是介绍一种组织制备方法，以确保成像标准的可重复性。此外，CRI 系统的设置如文中所述，旨在减少潜在的误差来源，并最大限度地提高信噪比。 然而，本文将不讨论 CRI 显微镜的设计原理与技术优势，相关内容此前已有阐述30。最后，本文将探讨详尽的数据分析流程，以便解读实验结果，判断实验的成功与否。
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方案
使用裸鼠耳部组织的研究已获得麻省总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，而使用人皮肤组织的研究已获得麻省总医院机构审查委员会（IRB）的批准。根据IACUC的规定， freshly euthanized的小鼠由拥有裸鼠品系的合作研究人员提供。人组织通过经批准的方案，从麻省总医院进行的选择性腹部成形术中获取。此外，除腹部皮肤外的特定组织类型通过遗体捐赠机构获得，该过程同样遵循经IRB批准的方案。
1. 组织制备
- 裸鼠耳部皮肤组织的制备
- 获取新鲜收获的裸鼠尸体后，使用镊子和显微外科剪刀取下耳朵。将一只耳朵放入小型培养皿（例如 35 mm × 10 mm）中。将裸鼠尸体置于生物危害废物袋中，按照当地实验动物管理与使用委员会（IACUC）的规定进行处理。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗每只小鼠耳部，并用实验擦拭纸轻轻吸干。重复两次，以去除耳部残留的污物或碎屑，这些物质可能影响成像质量（参见 图1).
- 如果耳朵将在24小时内使用，将其置于一个小培养皿中（例如, 在冰箱（2-8 °C）中，将耳组织置于含有新鲜PBS的培养皿（35 mm × 10 mm）内。若耳组织在采集后24小时以上使用，则将其放入无PBS的培养皿（35 mm × 10 mm）中，用封口膜封住皿口，并置于-20 °C冰箱中保存。
- 人体皮肤组织的制备
- 获取人体组织后，将其置于生物安全柜内的大号培养皿（即 60 mm × 15 mm）中，以留出足够的空间进行样本制备。
- 将角质层朝下放置，以便接触皮下脂肪。
- 使用镊子和显微外科剪刀，开始小心地去除皮下脂肪。当剪刀无法继续去除皮下脂肪时，改用10号一次性手术刀片（或同等工具）去除剩余的皮下脂肪。用镊子固定皮肤，同时以45°角持手术刀进行操作（参见 图1).
注意：为了获得高质量的透射SRS图像，样品应尽可能薄，但不能穿孔。
图1：适用于成像的小鼠和人类皮肤的理想厚度示意图。（A）将小鼠耳部皮肤置于光线下，可见光线可穿透皮肤。（B）制备后的人类皮肤在光线下观察，达到理想厚度的状态。请点击此处查看该图的放大版本。
- 将人皮肤切成 1 cm × 1 cm 的小片。
注意：新鲜皮肤可在不使用琼脂糖凝胶床的情况下使用长达 24 小时，具体方法如前所述31。然而，若将皮肤置于琼脂糖凝胶床上，则可延长其使用时间。若需后续使用皮肤，应将其放入标本转运袋中，然后置于 -20 °C 冰箱冷冻保存。冷冻皮肤需按以下步骤进行解冻，以获得最佳效果（见步骤 3.1.2）。
2. 激光与显微镜设置
- 成像前约30分钟，打开宽调谐超快激光器（以下简称激光器），并使其预热。启用激光警示标志/锁定系统，以便在人员进入时提醒外部人员注意潜在危险。
注意：使用四类激光器时，必须始终佩戴适当的护目镜。针对本实验所用的特定激光器，建议在激光工作波长范围800–1,300 nm内，使用光密度OD ≥ 6的护目镜。 - 在激光器预热的同时，启动显微镜控制、CARS检测和SRS检测所需的其余硬件。
- 正确调整显微镜以确保最佳成像效果。在 图像采集控制 显微镜控制软件（以下简称MC软件）窗口中，单击 透射光源 以便光线从显微镜的透射光源灯中射出。
- 确保正确调整科勒照明以使显微镜沿垂直轴对齐：缩小光圈，使通过目镜观察到的光线量最少32.
- 通过目镜观察时，打开虹彩光圈，查看多边形是否同时接触所有边。若在打开虹彩光圈前无法看到多边形形状，应调整聚光镜高度。
- 如果多边形形状未能同时接触所有边，则使用调节旋钮调整光圈对准位置。
注：参见 Sanderson 等人。33 用于深入的显微镜设置。 - 放置一个带有盖玻片和双面粘合垫片（内含油样）的显微镜载玻片（例如，橄榄油，因为其中含有大量-CH2- 油类内部的化学键）置于显微镜载物台夹持器上。
- 在 采集参数设置 MC 软件窗口中，找到 显微镜 下拉菜单并设置 显微镜物镜 到 20x.
- 确认CARS检测滤光片（645 nm/50 nm）已到位，以便通过显微镜侧端口的光电倍增管观察和测量反向CARS信号。
注意：选择此特定滤光片用于成像脂质，因为当泵浦光波长为803 nm、斯托克斯光波长为1,040 nm时，会在652 nm处产生反斯托克斯CARS信号（见公式(1)).
(1)
其中，λ 变量的单位为 nm；λ泵 是泵浦光波长；以及 λ斯托克斯 是斯托克斯光束的波长。 - 通过目镜观察，找到油样边缘，用于验证系统的对准情况。
- 使用显微镜的调焦旋钮确保边缘处于Z轴焦平面，并调节载物台控制器以获得XY轴焦平面。
- 激光器预热后，将泵浦光束设置为 803 nm 微调电机设置为 50.0 在激光器的图形用户界面中。所使用的精确电机微调可能因不同装置而异。
注意：该激光器中，泵浦光束是唯一可调波长的光束，斯托克斯光束的波长固定在1,040 nm。此配置针对的是2850 cm⁻¹处的CH振动-1 （见公式 (2）以计算针对特定波数的泵浦波长。
(2)
何处
具有相对波数单位（cm⁻¹）−1），以及 λ 变量的单位为 cm。 - 成像前检查激光进入显微镜的光路对准情况；参见 图2 用于描绘激光光路。在显微镜初始调试过程中，应在光路中安装两个可调光阑作为引导，以确保激光正确对准显微镜。由于激光的光学路径可能随时间发生漂移，需确保激光光束始终穿过两个光阑的中心，从而准确进入显微镜。
- 使用红外观察仪，完全关闭所有光圈，并确保光束在两个位置均居中：首先是靠近激光器的光圈，最后是显微镜入口处。
- 首先，检查泵浦光束，确保光束笔直地进入显微镜。泵浦光束对准后，再检查斯托克斯光束是否也正确地进入显微镜。
- 如果光束未通过光阑对准，请使用泵浦光和斯托克斯光路的两个反射镜架上的x和y调节旋钮，逐步迭代调整光束，使其通过各光阑。
- 当光束光斑在进入显微镜之前已重叠时，需检查并确保其在显微镜中的传播路径正确。
- 在 图像采集控制 MC 软件窗口中，单击 TD 用于传输的通道， ALG1 （模拟通道1）用于相干反斯托克斯拉曼通道，以及 ALG2 （模拟通道2）用于受激拉曼散射通道。采用以下设置（如本方案所述）：ALG1 的增益为 1，偏移为 -1；ALG2 的增益为 1.25，偏移为 -2。
注意：根据系统配置的不同，模拟通道的各个成像通道编号可能有所差异。如果已安装SRS探测器，则不会有透射信号，因为光线无法通过即在此设置中，无法同时对TD和ALG2进行成像观察。
- 在 图像采集控制 MC 软件窗口中，单击 TD 用于传输的通道， ALG1 （模拟通道1）用于相干反斯托克斯拉曼通道，以及 ALG2 （模拟通道2）用于受激拉曼散射通道。采用以下设置（如本方案所述）：ALG1 的增益为 1，偏移为 -1；ALG2 的增益为 1.25，偏移为 -2。
图 2：相干拉曼激光成像光路示意图。 光束经过独立调节以控制光斑尺寸，并通过时间延迟装置进行匹配，从而在样品中产生特定调谐频率的相干拉曼散射。请点击此处查看此图的放大版本。
- 打开功率计，并使用高功率热功率传感器分别测量实验中泵浦光束和斯托克斯光束的功率。
注意：在此特定示例中，泵浦光束功率为 80 mW，斯托克斯光束功率为 180 mW（进入显微镜之前）。 - 在 图像采集控制 窗口中，点击 Focus x2 按钮以在 MC 软件中查看图像。
- 在 采集设置 窗口中，确保像素比和驻留时间已设置为实验所需的参数。
注意：本方案中采用的参数为 1,024 × 1,024 像素比和 2 µs/像素的驻留时间。 - 通过解除泵浦光束的遮挡并查看 TD 通道，确认激光相对于显微镜的对准情况。
注意：若在正确探测器设置下，光束在图像中央清晰可见，则表明激光已正确对准。 - 否则，请使用潜望镜上的 X 和 Y 调节旋钮，将光束重新定位至图像中心。
- 通过在 CARS 和 SRS 两个通道中观察到相同的图像，确认激光与显微镜的对准。
- 为获取对准图像，在 图像采集控制 窗口中点击 XY 扫描 按钮，并设置适当的滤波模式（例如，Kalman Line 3）。
- 将这组图像以具有描述性的文件名保存，以便随时间比较并确认系统性能/对准状态。
3. 脂质成像
- 小鼠耳朵和人类组织
- 若使用新鲜组织，跳过步骤 3.1.2。
- 从 -20 °C 冰箱中取出小鼠耳部皮肤，置于 32 °C 培养箱中孵育 10 分钟。将小鼠耳朵从培养箱中取出。
注意：小鼠耳部皮肤制备参见步骤 1.1.2。粗暴操作或刮擦组织可能导致组织发生机械性损伤、破坏或结构紊乱，尤其是角质层。 - 若使用裸鼠耳朵，将耳部前侧朝向35 mm、No. 0规格培养皿的玻璃底面。若使用人皮肤，应将角质层面向下放置，以便实现药物从浅层至深层的定量分析图1).
注意：裸鼠耳朵的后部更容易因饲养条件而出现瑕疵。若将人皮肤放置于倒置显微镜上时，角质层未朝下，则由于存在较明显的光散射，无法观察到真皮层以下的结构，且药物渗透进入角质层的过程也无法被观察到。 - 将组织置于玻璃底培养皿的中央后，使用棉签轻轻按压，确保皮肤平整并与玻璃底表面完全接触。
注意：如果皮肤未完全平整，此步骤在成像过程中可能会造成困难。 - 在皮肤上方放置一个垫圈，以防止成像过程中发生移动。确保组织通过垫圈的中心孔可见，以便进行SRS透射信号检测。
- 移去载物台插件，换上带有单皿插件的培养室。
- 将带有皮肤组织的玻璃底培养皿放入培养箱的单皿附件中。
注意：也可使用6孔板同时对多个皮肤样本和配方进行成像。 - 降低像素比 采集参数设置 MC 软件的窗口（例如，从 1,024 × 1,024 调整为 512 × 512）以提高振镜扫描速度，同时改变 Z 轴深度以定位角质层（参见 图3A 用于小鼠或 图3E 用于人类。
- 找到角质层后，将该轴向位置记录为零位置 采集参数设置 窗口并针对每个特定实验更改像素比率（例如，1,024 × 1,024。
图 3：使用受激拉曼散射（SRS）获得的皮肤深度示例。 上排图像来自裸鼠耳部皮肤，显示如下结构：（A）角质层，（B）皮脂腺，（C）脂肪细胞，（D）皮下脂肪。下排图像来自人体皮肤，显示如下结构：（E）角质层，（F）乳头层真皮，以及（G）一个皮脂腺。比例尺 = 100 µm。小鼠和人皮肤图像均使用 20 倍物镜以 1024 像素 × 1024 像素采集；人皮脂腺图像以 512 × 512 像素采集。缩写：SRS = 受激拉曼散射；SG = 皮脂腺。 请点击此处查看该图的放大版本。
4. 局部制剂的应用
- 将预定剂量的制剂用移液器滴加到皮肤上（例如，10 µL/cm2).
注意：制剂的黏度会影响移液器的选择。建议对乳膏或凝胶等黏稠制剂使用正置换移液器，对溶液使用空气置换移液器。本实验中，芦可替尼以丙二醇（丙烷-1,2-二醇）简单溶液作为模型化合物。 - 使用注射器的推杆末端或戴手套的手指，顺时针揉搓制剂30秒。记录制剂涂抹的时间，用于后续cPK分析（见下文步骤6.15–6.17）。
注意：应用时长取决于具体实验，不同实验可能有所差异。 - 在规定时间的制剂渗透结束后，去除多余的制剂，将带有制剂的一侧朝向玻璃底培养皿放置皮肤。
注意：使用精细任务擦拭纸或小型（约1英寸）3D打印刮刀，沿单一方向去除配方成分例如，从北到南。
5. 药物定量的实验设置
- 将泵浦光束设置为 803 nm。使用光电二极管检测泵浦光束和斯托克斯光束的功率，以确保其达到实验所需的功率。依次单独解除每束光的遮挡以测量其功率，随后重新遮挡光束。
注意：在此特定示例中，泵浦光束功率为100 mW，而斯托克斯光束功率为180 mW。 - 将玻璃底培养皿放入带有单个玻璃底培养皿插槽的孵育 chamber 中，并用夹子固定培养皿，以防止成像过程中发生移动。
- 打开MC软件中的透射光源。通过目镜观察，使用调焦旋钮调节轴向焦距，确保组织处于焦点范围内。
- 同时解封泵浦光束和斯托克斯光束。确保ALG1和ALG2通道已启用，然后单击 聚焦 x2 在MC软件中查看CARS和SRS通道中的皮肤图像。确保SRS光电二极管位于聚光镜上方的正确位置。
- 在“设备”下拉菜单中，单击 多区域时间序列 (MATL）。寻找一个 XY 平台警告 出现时；当载物台移动以寻找其机械原点时，单击 好的.
- 在 MATL 模块，前往 查看 然后点击 注册点列表 在MC软件内，开始添加皮肤内的特定深度（即， 角质层、板层颗粒、脂肪细胞、皮下脂肪（通过脂质调谐对比的活体成像确定）或 2）若需采集完整的深度堆栈图像，则记录 XY 位置。参见 图3 例如。
- 一旦识别出角质层，通过轴向聚焦（或z轴聚焦）逐层观察，以辨认上述特定的组织分层结构。参见 图3 例如人类和小鼠皮肤中的情况。
- 对于特定深度的成像（而非完整的Z轴深度堆栈），针对每种皮肤分层，点击 注册点 将其添加到 MATL 队列中。对于全深度堆栈，请单击 注册点 每个XY位置 深度 筛选在 采集参数 窗口
- 在MATL软件中注册完所有目标XY（全Z轴深度图像序列）或XYZ（特定皮肤分层）位置后，以在实验过程中保持图像和cPK分析一致的方式，更改文件目录和文件名（见步骤6.15–6.17）。
- 设置重复次数为 1 在 MATL 模块中点击 准备就绪. 等待 播放 从灰色箭头变为黑色箭头，表示软件已准备就绪。按下 播放 开始成像初步的脂质层（以下简称 脂质图像).
注意：这将在分析过程中用于分离各个组织分层中富含脂质和贫含脂质的区域。循环次数和总时间显示在已注册点列表的右下角。 - 循环完成后，同时阻断泵浦光束和斯托克斯光束。根据目标波数或拉曼振动，在激光器图形用户界面中将波长调整至所需波长。
注意：例如，泵浦光束使用 843 nm 可针对 2,250 cm⁻¹-1 使用公式 (2），并将电机微调设为50.1。本文展示的示例药物鲁索利替尼（ruxolitinib）含有一个腈基，可在2,250 cm⁻¹处进行靶向检测。-1。针对皮肤结构的目标波数将始终保持不变（2,850 cm⁻¹）。-1）；然而，活性药物成分（API）的波数可以是任意波数，但必须已知或经过计算得出 先验的 - 调节手动时间延迟装置（图2）以确保新波长与泵浦光束功率在时间上重叠。在脂质和活性药物成分（API）成像中应使用相同的功率，该功率需预先确定 先验的.
- 利用每个循环的持续时间来计算每次实验所需的总重复次数。只需将实验所需的总时间进程除以单个循环的持续时间即可。
注意：循环周期的时长取决于图像尺寸、像素驻留时间、卡尔曼平均次数以及每个循环中的图像数量。优化这些参数可缩短循环周期，从而提高时间分辨率。 - 选择好总的循环次数后，解除泵浦光束的遮挡，使用光电二极管检查功率，并确保其达到预期功率值。最后，解除斯托克斯光束的遮挡，开始成像。
- 按压 播放 开始对设定点进行自动成像。
- MATL 成像完成后，将泵浦光重新切换回 803 nm，并将功率调整至步骤 5.1 中用于脂质成像的原始功率。
- 与之前步骤相同，将文件名更改为在整个研究过程中保持一致的格式，以便于实验后图像的管理。
- 设置重复次数为 1.
- 点击 准备就绪 | 播放 按钮以获取时间序列脂质图像堆栈，并确保成像过程中无组织移动（图4).
图4：通过可视化皮脂腺显示裸鼠耳部皮肤中的组织移动。 图A和B展示了有限的组织移动，而图C和D展示了显著的组织移动。A显示给药时的皮脂腺，B显示给药后120分钟同一深度的图像。C为给药时的小鼠皮脂腺，D为给药后120分钟的图像；此时皮脂腺几乎不可见，表明本实验在整个实验期间并未持续检测皮脂腺的摄取情况。比例尺 = 100 µm。图像尺寸为1024像素 × 1024像素。请点击此处查看该图的放大版本。
6. 数据分析
- 采集图像作为 .OIB 或 氧诱导视网膜病变 根据显微镜和MC软件的不同），每种文件类型在每个XYZ位置都有独立的子文件夹。
- 通过将脂质图像重命名为以下后缀，将其与API通道图像合并 _lipid.oib.
- 对每种皮肤分层执行以下步骤（此处为简化起见仅以颗粒层（SG）分层为例；参见 图3B).
- 将SG脂质图像导入ImageJ（或Fiji）34 并勾选标有 拆分通道 将文件拆分为CARS和SRS通道。
注意：Fiji 将根据实验过程中获取的通道数量，将文件拆分为相应数量的图像。 - 打开感兴趣区域（ROI 管理器 通过点击 分析 | 工具 | 感兴趣区域管理器.
- 使用SRS通道（例如, C = 1），在图像中标记一个应激颗粒（SG）。
注意：由于靶向-CH，应激颗粒（SGs）呈现为明亮的区域2- 振动。 - 通过点击将其添加到 ROI 管理器中 添加 [t] 在 ROI 管理器中或按下键盘上的 t 键。对图像中的每个 SG 重复此过程。
- 为了屏蔽富含脂质的区域，选择每个 ROI 并点击 更多 标签 | 或（组合） | 添加 到 ROI 管理器。
- 为了屏蔽脂质贫乏区域，使用 矩形 使用 FIJI 菜单中的工具，在整幅图像周围绘制一个方形。将此区域添加到 ROI 管理器中。
- 在 ROI 管理器中，单击新添加的方形 ROI，同时保留用于选择所有富脂区域的 ROI。在 更多，选择 XOR 生成脂质贫乏区域的掩膜，并将其添加到ROI管理器中。
- 将SG脂质图像导入ImageJ（或Fiji）34 并勾选标有 拆分通道 将文件拆分为CARS和SRS通道。
- 将API图像加载到Fiji中。
- 按数字顺序拼接图像（即，Image0001，Image0002，Image0003等）的步骤如下： 图像 | 图像序列 | 工具 | 拼接.
- 或者，通过将其中一张图像导入 Fiji，然后选择一个名为 将名称相似的文件进行分组 在 设置 页
注意：此功能可导入所有具有相似文件名的图像，并自动将它们拼接起来。
- 或者，通过将其中一张图像导入 Fiji，然后选择一个名为 将名称相似的文件进行分组 在 设置 页
- 在拼接图像处于激活状态时，转到 ROI 管理器，选择富含脂质的区域（即， 的 SG），点击 更多，并选择 多指标测量. 等待 结果 窗口出现。
- 寻找 面积，平均值，最小值，最大值 和 中位数 在 默认测量设置. 如果需要其他指标进行分析，可通过勾选相应复选框来启用这些选项 设置测量 窗口分析 | 设置测量...).
- 从 结果 窗口到电子表格并添加一列，标题为 区域.
- 添加 富含脂质 为脂质富集区域的每一行数据添加 脂质贫乏 到脂质区域以外的区域。
- 添加一列，标题为 层 并添加所分析的相应层（补充表 S1).
- 在选定适当的 ROI 后，对脂质贫乏区域重复执行步骤 6.5 - 6.7。
- 为可视化数据，保存电子表格并将其导入 JupyterLab（包 matplotlib）35 或在 R（ggplot2 程序包）中36. 将数据以图像编号对平均强度作图，以估算浓度-时间数据。图5).
- 将电子表格导入 RStudio，以对持续输注（CRI）数据进行药代动力学分析中的非房室分析（NCA）。
- 添加一列，标题为 时间.
- 对于图像0001，计算从制剂施用到第一张图像采集之间的时间间隔。
注意：这是第一个时间点。循环周期用于计算随时间递增的后续图像（即时间点）。例如，若施加处理后的时间为30分钟，则Image0001的时间点为30分钟；当循环周期为8分钟时，Image0002的时间点为38分钟，Image0003的时间点为46分钟，依此类推。 - 在 RStudio 中运行 NCA（使用 NonCompart 软件包）37 基于从电子表格导入的强度-时间数据，对单一层/区域的调用如下：
sNCA(x = 时间, y = 均值, dose = 1, timeUnit = "s", doseUnit = "mg")
其中，x 表示时间点，y 表示强度，剂量可设为1，或按配方中药物的毫摩尔（mM）剂量或产品剂量计算。
注意：NCA 输出将提供诸如 C 等参数最大 和 AUC全部。然而，由于这是 离体 皮肤，这些参数实际上是 J最大值 以及 AUC通量-全部. - 比较 J最大 和 AUC通量-全部 通过绘图直观地展示指标图6）以及不同实验条件间的统计学比较。参见 图6 用于分析示例的 离体 CRI 研究。
注意：适当的统计学检验方法取决于每个特定的数据集。还需注意，所有药代动力学参数均呈对数正态分布，任何比较均必须使用对数转换后（自然对数或以10为底的对数）的数据。
图5强度随时间变化曲线。 (A) 一个已达到饱和的通量分布示例，因此仅观察到强度的下降。每个感兴趣区域（ROI）具有不同的通量分布，以展示实际获取数据中可能存在的异质性。B) 成像开始后浓度升高的一个示例。每个ROI代表同一实验中同一样本内不同的视野区域（由不同颜色的曲线表示）。除了整体浓度变化外，还可阐明活性药物成分/制剂更倾向于分布于富含脂质或贫脂质的局部微环境。图中所示的曲线轮廓表明 A 表明药物未被组织吸收，因为活性药物成分（API）在成像开始时已经渗透进入并开始从组织中释放。然而，在 B，组织尚未达到饱和，活性药物成分（API）仍在被吸收并随之发生消除。将图像分割为富脂区域和贫脂区域，有助于阐明API（或非活性成分）的定位及其经皮渗透途径即，角质层）。在富含脂质的区域中浓度较高，表明活性药物成分定位于所研究层次的脂质结构内，有助于提供靶向药物递送信息。缩写：ROI = 感兴趣区域；API = 活性药物成分。 请点击此处以查看此图的放大版本。
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结果
如果实验结束时组织在轴向（<10 μm）或横向方向上未发生显著移动，则认为成像成功（图4）。这可以立即提示所测得的目标活性药物成分（API）的受激拉曼散射（SRS）信号是否能代表初始深度处的情况，因为定量分析是分层特异性的。为缓解此问题，可对每个感兴趣的XY位置采集z轴层扫图像，但代价是时间分辨率降低。若在研究中使用冷冻皮肤，其API的渗透和透过速度相比新鲜皮肤更快，因此制剂施加后应尽快开始成像。另一个需考虑的因素是实验所用物镜。若使用60倍物镜，在单个视野（FOV）内选择一个平坦区域相对容易；然而，若使用20倍物镜，其视野范围更大，因此组织制备中的关键步骤是确保皮肤与玻璃底成像皿之间接触均匀。获得平坦的视野以及视野内各点的深度与原始深度相近，是获得理想结果的两个关键因素。
激光的准直以及图像的动态范围必须得到极为细致的处理。若激光脉冲序列在显微镜中的准直不良，可能导致一系列问题，包括信号水平过低或视野（FOV）激发不均，从而产生对比度低的图像。另一个需要考虑的因素是在采集图像时应充分利用整个强度值的动态范围；否则，...
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讨论
局部生物利用度/生物等效性（BA/BE）的评估是一个需要多维度方法的研究领域，因为单一技术无法全面表征 在体 cPK。本方案介绍了一种基于相干拉曼成像评估局部药物产品生物利用度（BA）/生物等效性（BE）的方法学。其中，一个容易被忽视的关键点是皮肤样本必须足够薄，尤其是对于定量透射式SRS成像而言。若皮肤过厚（即， 由于光线难以穿透，受激拉曼散射（SRS）探测器测得的信号极弱或几乎没有，因此将无法提供可靠的浓度数据。必须谨慎妥善地制备这些组织样本，因为样本制备的质量可能直接决定实验的成败。对于裸鼠耳部组织，除用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗并轻轻拍干以去除耳部残留污物外，基本无需其他预处理步骤。
小鼠耳朵的厚度通常为几百微米（µm），适合透射式SRS检测。人皮肤样本通常包含皮下脂肪，厚度可达几毫米（mm），但具体厚度因皮肤组织的解剖来源及供体年龄而有显著差异。因此，必须尽可能去除多余的组织，以准确量化随时间变化的表皮和真皮中脂质结构及活性药物成分（API）的浓度。若忽略组织制备步骤，则后续实验设置的大部分操作将因起始条件非最优而变得极不适用。
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披露
CLE 是已授权给多家显微镜制造商的 CARS 显微技术相关专利的发明人。其余所有作者均无利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Evans 研究组的 Fotis Iliopoulos 博士和 Daniel Greenfield 对本文手稿的讨论与校对。此外，作者感谢 LEO Pharma 提供的支持。图 2 使用 BioRender.com 制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 组织制备 | |||
| 可高压灭菌的生物危害袋 | FisherBrand | 22-044562 | 文中提及：生物危害袋 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
| 细胞培养缓冲液：杜氏磷酸盐缓冲盐溶液 1x | Corning | MT21030CV | 文中提及：PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv |
| 一次性手术刀 | Exel International | 14-840-00 | 文中提及：手术刀 https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
| 高精度 45° 角宽头镊子/持针钳 | Fisherbrand | 12-000-132 | 文中提及：持针钳 https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
| Kimwipes 精细任务擦拭纸，单层 | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | 文中提及：任务擦拭纸 https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
| Parafilm M 实验室包裹膜 | Bemis | 13-374-12 | 文中提及：Parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
| 培养皿（35 mm × 10 mm） | Fisherbrand | FB0875711YZ | 文中提及：小型培养皿 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
| 培养皿（60 mm × 15 mm） | Fisherbrand | FB0875713A | 文中提及：大型培养皿 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
| 手术剪 | Roboz | NC9411473 | 文中提及：剪刀 https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC |
| 激光器/显微镜 | |||
| 650/60 nm BrightLine 单通带带通滤光片 | Semrock | 文中提及：CARS 滤光片 - CH2 振动（645 nm/60 nm 滤光片） | |
| 控制箱 IX2-UCB | Olympus | 文中提及：控制箱 | |
| D700/30m | Chroma | 文中提及：CARS 滤光片 - 氘化带 https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m | |
| DeepSee Insight | Spectra-Physics | 文中提及：激光器 https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser | |
| 数字手持式光学功率和能量计主机 | ThorLabs | PM100D | 文中提及：功率计 https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Fluoview 软件 | Olympus | 文中提及：显微镜控制软件 | |
| 磨砂显微镜载玻片 | FisherBrand | 文中提及：显微镜载玻片 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 | |
| FV1000 | Olympus | 文中提及：显微镜 | |
| 孵育腔 | Tokai Hit | GM-800 | 文中提及：孵育腔 |
| 积分球光电二极管功率传感器 | ThorLabs | S142C | 文中提及：光电二极管 https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| 电源 FV31-PSU | Olympus | 文中提及：电源 | |
| Precision 4063，80 MHz 双通道函数发生器 | BK Precision | 文中提及：函数发生器 | |
| ProScan – 精密显微镜自动化系统 | Prior Scientific Instruments | 文中提及：载物台控制器 https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation | |
| SecureSeal 成像间隔垫 | Grace Biolabs | 654004 | 文中提及：间隔垫 https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
| SRS 检测套件 | APE | 文中提及：SRS 检测器 | |
| UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | 文中提及：20X 物镜 https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ | |
| 脂质/药物成像 | |||
| 35 mm 培养皿，未包被盖玻片，14 mm 玻璃直径 | MatTek Corporation | NC9711297 | 文中提及：玻璃底培养皿 https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
| 棉签 | FisherBrand | 文中提及：棉签 | |
| Distriman 正向置换移液器 | Gilson | 文中提及：正向置换移液器 https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= | |
| Distriman 正向置换移液器吸头 | Gilson | 文中提及：移液器吸头 https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true | |
| 数据分析 | |||
| FIJI | 开源 | 文中提及：FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ | |
| Jupyter-Lab | 开源 | 文中提及：JupyterLab https://jupyter.org/ | |
| Rstudio | 开源 | 文中提及：Rstudio https://www.rstudio.com/ |
参考文献
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