通过细菌产生的双链RNA（dsRNA）进行口服给药，是一种常用于Caenorhabditis elegans的RNA干扰（RNAi）递送方法，本研究成功将其应用于成年蚊虫。该方法可在无需注射的情况下，实现可靠的反向遗传学研究及阻断传播的媒介研究。
本文内容
摘要
摘要
RNA干扰技术在过去二十年中被广泛用于反向遗传学分析。在成年蚊子中，双链RNA（dsRNA）的递送主要通过以下方式实现 通过 注射方法耗时较长，且不适用于田间应用。为克服这些局限性，本文介绍一种更高效的方法，通过口服递送dsRNA至成虫，实现RNA干扰的稳健激活 Anopheles gambiae长链dsRNA的制备 大肠杆菌 菌株HT115 (DE3)，并在棉球上提供含有dsRNA的热灭活细菌浓缩悬液（溶于10%蔗糖溶液） 随意摄取 成年蚊子。在处理期间，每2天更换一次棉球。使用该方法靶向 doublesex （一个参与性别分化的基因）或 叉头 （编码唾液腺转录因子）导致靶基因表达降低和/或蛋白质免疫荧光信号减弱，分别通过定量实时PCR（qRT-PCR）或荧光共聚焦显微镜检测确认。同时观察到唾液腺形态缺陷。这种高度灵活、操作简便、低成本且省时的dsRNA递送方法，可广泛适用于研究对昆虫媒介生理及其他生物学过程重要的靶基因。
引言
许多疾病通过蚊子传播，因此对蚊子生理学和遗传学的研究具有重要意义。在过去20年中，RNA干扰技术（RNAi）在这些生物中的应用十分突出，已实现了对大量蚊子基因的功能鉴定1,2,3,4,5。目前最常用的双链RNA（dsRNA）递送技术是显微注射法，但该方法存在可能损伤蚊体且耗时耗力等缺点。RNAi的口服递送方法虽已有尝试，但主要集中于蚊子的幼虫阶段6,7,8,9。成蚊中dsRNA的口服递送尚未得到充分探索，而该方法可能成为研究媒介生物学及媒介控制的有力工具。
疟疾由 按蚊属 当携带疟原虫的雌性蚊子叮咬未感染的宿主并注入含有疟原虫的唾液时，疟疾便通过蚊子传播10为了最终通过蚊子的唾液传播，寄生虫必须克服多个障碍，包括逃避免疫系统的攻击、穿越中肠屏障以及侵入唾液腺11蚊虫唾液腺（SG）的结构对于寄生虫入侵至关重要，而该结构受到唾液腺特异性表达的转录因子以及性别二态性决定因子的共同调控。多个高度保守的转录因子在唾液腺细胞的特化、稳态维持以及唾液蛋白的产生和分泌过程中发挥必需作用，这些唾液蛋白在吸血过程中具有重要功能。12,13,14叉头（Fkh） 是一种翅状螺旋转录因子，在果蝇和家蚕的研究中发现，其作为昆虫唾液腺结构与功能的主要调控因子发挥作用15,16,17,18,19,20. 在 果蝇 SGs中，Fkh与Sage（一种SG特异性的碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子）协同作用，促进SG的存活及唾液分泌19唾液分泌的一个重要正向共调节因子 果蝇 是一种经过深入研究的亮氨酸拉链转录因子 CrebA，可上调分泌途径相关基因的表达21,22,23雌性唾液腺在形态上也存在显著的分化，这不仅可能在吸血过程中发挥关键作用，还可能影响寄生虫侵入该组织的能力。24.
许多参与决定唾液腺存活、结构、生理功能及性二型性的基因具有复杂的时空表达谱25,26,27，而传统的dsRNA递送方法在靶向这些基因或其他组织中的此类基因时，并不总是高效。然而，已有研究成功通过幼虫期口服递送dsRNA，在埃及伊蚊（Aedes aegypti）和冈比亚按蚊（An. gambiae）中沉默了dsx基因的雌性特异性形式9,28。先前在蚊虫唾液腺中使用dsRNA的研究发现，尽管需要大量dsRNA，但基因沉默效果相对持久（至少持续13天）29。本研究检测了表达针对dsx、fkh或CrebA基因序列特异性dsRNA的热灭活E. coli菌株HT115 (DE3)是否能够在成年雌性蚊虫中诱导这些基因的RNAi沉默。通过口服给予dsRNA可在An. gambiae中实现基因敲低，表现为mRNA水平显著降低，并出现与这些基因功能缺失一致的表型。因此，该方法有望适用于多种唾液腺基因功能的敲低研究。
方案
1. 将双链RNA克隆到 E. coli 表达载体
- 选择目标基因序列，将其插入合适的载体中以表达dsRNA。使用以下方法从Vectorbase.org获取表达值。
- 在首页搜索框中搜索感兴趣的基因（例如，表1）。
- 在结果页面的基因信息页中，进入8. 转录组学部分。
- 查找列出的相关RNA-seq和微阵列基因表达实验。
- 将感兴趣的数值转录至电子表格软件中，并创建数据表。
- 选择一种市售的、至少含有一个T7启动子的质粒。如果所选质粒仅含有一个T7启动子（大多数商业质粒均如此），则应在用于扩增目的基因dsDNA的反向引物中加入第二个T7启动子。
注：可使用网络应用程序E-RNAi设计RNAi试剂，以选择目标基因的dsRNA序列30。可根据特定基因序列设计长片段dsRNA（约400 bp）或短发夹dsRNA（shRNA）。这些序列在克隆前应进行扩增并测序以确认其正确性。本研究中使用的目标基因区域、质粒和启动子详见补充文件1。 - 按照先前描述的简单一步法进行克隆9,31。为此，纯化PCR产物，并将其连接至线性化质粒DNA。将连接产物用于热激转化感受态E. coli细胞32。通过蓝/白斑筛选挑选转化子。使用T7引物PCR确认插入片段的方向，并使用M13引物确认序列。
注：当用于转化的质粒携带编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因时，可使用蓝/白斑筛选。白色菌落应含有插入lacZ中的目标片段，可用于进一步确认目标序列的存在及其方向33。 - 从首次转化中提取质粒，并如前所述将其转化至感受态E. coli HT115 (DE3)中34。在确认含有插入片段的质粒已存在于感受态E. coli HT115 (DE3)中后，制备单次使用量的甘油菌种保存液。
注：每次实验均应获取或制备适当的非相关对照dsRNA。本实验中使用的是来自Arabidopsis thaliana的非相关基因aintegumenta (ant)的序列。
表达dsRNA的热灭活细菌的制备
- 从含有表达dsRNA质粒的 E. coli 菌株HT115 (DE3) 的单个细菌菌落开始，在50 mL含有100 µg/mL氨苄青霉素和12.5 µg/mL四环素的Luria肉汤（LB）培养基中，于37 °C、180 rpm振荡培养12小时，以培养菌液。
- 将细菌培养物按1:1000比例稀释至含有100 µg/mL氨苄青霉素和12.5 µg/mL四环素的2倍酵母胰蛋白胨（2x YT）培养基中。
- 通过加入40 µM（终浓度）异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导dsRNA的产生。
- 当细胞在37 °C、180 rpm振荡条件下诱导约2小时后达到O.D.600 = 0.4时，按照Taracena等9所述方法制备热灭活细菌的浓缩悬液。将细胞在4 °C下以4000 × g 离心10分钟收集菌体，并用一倍体积的磷酸钠缓冲液（PBS）洗涤细胞。
- 在相同条件下再次离心，将菌体重悬于初始体积1/100的PBS中，并于70 °C放置1小时。
- 将热灭活的细菌分装为每份400 µL，保存于-20 °C备用（保存时间不超过一周）。该热灭活细菌悬液含有用于RNAi实验的特异性dsRNA。每个实验中均需同时对目标基因dsRNA细菌和无关dsRNA对照细菌进行上述操作。
3. 用表达dsRNA的热灭活细菌饲喂蚊子
- 解冻一份dsRNA（HT115 (DE3)细菌悬液），并与含有0.2%对羟基苯甲酸甲酯的1.6 mL 12%糖溶液混合。
- 将一小团棉球浸入该溶液中，并将浸透的棉球放入装有5日龄蚊子的笼内。确保蚊子摄食该溶液，同时摄入糖分和含dsRNA的细菌。
- 每隔一天更换一次浸有dsRNA-糖溶液的棉球，连续进行8天。
- 将蚊子饲养笼保持在恒定条件下，即27 °C、80%相对湿度，光照周期为12小时光照：12小时黑暗，其间分别以30分钟的黎明和30分钟的黄昏过渡。
4. 检测目的基因表达水平
- 将蚊子容器置于冰上约1分钟或直至蚊子停止活动，以低温麻醉蚊子。蚊子麻醉后，将其放置于低温表面，以便分离雌蚊进行解剖。
- 用70%乙醇喷洒蚊子，并将其置于含PBS的玻璃表面。用镊子固定蚊子头部，缓慢拉扯胸部，使唾液腺释放到PBS中。
- 将唾液腺保存在预冷的PBS中，直至完成10只蚊子的解剖。将10对唾液腺合并，采用硫氰酸胍-酚-氯仿法提取RNA，并将RNA沉淀重悬于30 µL无RNase的水中。
- 取上一步提取的唾液腺RNA 1 µL，测定260 nm和280 nm处的吸光度，乘以稀释倍数后计算各样本的RNA浓度。260/280比值约为2.0表明RNA质量良好。
- 取1 µg纯化后的RNA，使用商业逆转录试剂盒合成互补DNA（cDNA）。
- 将cDNA进行1:10稀释后，按照试剂盒说明书配制RT-PCR反应体系。每个样本分别设置目标基因和内参（HK）基因的反应体系，并行进行。每个基因的反应设三个技术重复，以消除实验方法中随机变异的影响。
注：本实验中使用冈比亚按蚊（An. gambiae）核糖体蛋白S7基因（GeneBank: L20837.1）和actin基因（VectorBase: AGAP000651）作为内参基因。 - 所有引物终浓度为300 nM，按照SYBR Green试剂生产商的说明进行操作。采用标准PCR程序扩增：95 °C预变性10分钟，随后进行40个循环（95 °C变性15秒，60 °C退火延伸60秒）。
注：基因表达量的定量采用ΔΔCt法（delta-delta-Ct法）。ΔCt为靶基因Ct值与内参基因Ct值之差；ΔΔCt为实验组ΔCt与对照组ΔCt之间的差值35。
5. 表型评估：成功的吸血
- 为评估吸血能力，将经目标 dsRNA 和对照 dsRNA 处理的 15 只雌蚊分组置于小型笼子（直径 12 cm）中，并饥饿处理 4 小时。
- 使用设定为 37 °C 的循环水浴，通过玻璃蚊子饲喂器（直径 24 mm）和 Parafilm 膜，向蚊子提供脱纤绵羊血。
注：血液可从商业供应商处获取，该供应商以无菌方式从美国来源的健康供体动物采血，并通过人工脱纤处理，不添加抗凝剂或任何添加剂。 - 通过直接观察，记录并统计每组中前五只完全吸饱血液的雌蚊成功获取血餐前的刺探尝试次数。
注：为避免蚊虫发生显著的代谢变化（可能干扰能量资源并影响寻血行为），饥饿时间保持在最低限度（4 小时）。因此，并非每只蚊子都会积极寻找血餐；我们将每组吸饱血液的雌蚊数量限定为五只（约为每组总数的三分之一），以减少时间变量的影响，例如暴露于人体气味、饲养室与饲喂表面之间的温度变化等。
6. 表型评估：唾液腺形态学及关键蛋白的表达下调
- 按照步骤4.2所述方法，将新鲜组织置于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中分离，并用预冷的丙酮在冰上固定90秒。去除丙酮后，用1× PBS多次漂洗。加入一抗（见材料表）稀释于1× PBS中，4 °C孵育过夜。
注：有关用于唾液腺蛋白（Anopheles抗血小板蛋白，AAPP；黏蛋白2，MUC2）、唾液腺转录因子（Fork Head，fkh；Sage，sage；环磷酸腺苷反应元件结合蛋白A，CrebA）以及分泌囊泡标记物（Rab11）的一抗信息，请参见材料表。这些抗体可用于评估唾液腺的形态与功能。然而，任何适用于免疫荧光的抗体均可用于本方案。 - 用1× PBS多次洗涤。加入用1× PBS稀释的二抗（荧光标记），室温避光孵育2小时。在2小时孵育结束前30分钟，加入任何所需的复染试剂［如4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；用于DNA）、麦芽凝集素（WGA；用于几丁质）、鬼笔环肽（用于F-actin）和/或尼罗红（用于脂质）］。
- 用1× PBS洗涤三次。然后将组织置于标准载玻片上，用100%甘油封片（盖玻片厚度为1 mm），并于-20 °C保存，待使用荧光共聚焦显微镜成像。
注：为获得定量数据，成像参数必须保持一致。本研究仅包含贯穿整个组织三维体积的最大强度投影图像，所有图像的定量分析均基于载玻片上同时存在的非唾液腺组织残留部分（脂肪体、表皮或头部）中的DAPI信号，在同一实验内的不同处理组之间进行归一化处理。
结果
首先，利用来自 VectorBase 的基因芯片表达数据，扫描各发育阶段的潜在靶标36,37，以确定本研究中所有相关基因的表达状态（表 1）。如预期所示，所有选定的靶基因均在成蚊唾液腺（SG）中表达。aapp 和 sage 的表达水平尤其高（表 1）。值得注意的是，f-Agdsx 在雌性成蚊唾液腺中表达水平较高9。
使用网络应用程序评估了每个基因的特定片段作为dsRNA的应用潜力 用于设计RNAi试剂的E-RNAi30. 随后将包含各目标基因特有序列的约 400 bp 区域进行克隆（图1A），转化至相应的细菌菌株中，并用于制备经热灭活的细菌悬液，诱导其产生dsRNA。成蚊在含有dsRNA细菌悬液的蔗糖浸润棉球上饲喂8天 f-Agdsx，fkh，或 蚂蚁 （无关的阴性对照）
为了分析雌性蚊子的RNAi饲喂效果，首先确定了f-Agdsx或fkh dsRNA饲喂是否能够诱导基因沉默。在饲喂fkh-dsRNA的组别中，fkh转录水平降低了98.8%（±2.1）（图1B），表明dsRNA能非常有效地减少唾液腺（SGs）中fkh转录本的丰度。令人意外的是，在用f-Agdsx dsRNA处理的蚊子中，fkh mRNA水平也降低了82.0%（±18.9），而该组f-Agdsx的表达量减少了89.86%（±4.48），提示fkh可能是F-Dsx在唾液腺中的靶基因。伴随着fkh表达水平的显著降低，fkh-敲低的蚊子在吸血过程中完成取食所需的探刺次数显著增加。这些蚊子平均需要比对照组或f-Agdsx dsRNA饲喂组多五倍的取食尝试才能完全吸饱血液（图1C）。这促使我们进一步探究fkh敲低的RNAi处理是否导致关键转录调控因子（唾液腺转录因子Sage和CrebA）（图2）、分泌蛋白（AAPP和黏蛋白）（图3）以及分泌机制［尼罗红染色（脂质）和Rab11（分泌囊泡）］（图4）的定位和/或分布发生变化。重要的是，不同小叶区域、不同小叶以及个体唾液腺之间的染色强度存在显著差异。
正如所预测的，水平 鼠尾草 和 CrebA 所有唾液腺叶中的染色均显著减少 fkh RNAi（图2B）相较于 蚂蚁 对照RNAi（图2A). 线扫描轮廓图中最高最大强度值（红色虚线及数字标签）和最低最大强度值（蓝色虚线及数字标签）的降低，提示组织内高信号和低信号区域均有所减少图2A，B。这些数据表明 冈比亚按蚊 fkh RNAi 具有有效性 fkh 调控SG转录因子的生成和/或稳定性 鼠尾草 和 CrebA 在 An. gambiae，类似于它们在遗传关系上的对应 果蝇 应激颗粒19,38,39.
在考虑高丰度的唾液成分蛋白时，其水平 按蚊属 抗血小板蛋白（AAPP）40,41 在所有三个唾液腺叶中均减少 fkh RNAi，相较于对照RNAi处理（图 3A，B；绿色）。另一方面，黏蛋白水平未观察到变化（图3A，B；紫色）。这些数据表明，Fkh 对不同唾液蛋白基因的表达具有差异性贡献。
最后观察到两种分泌标志物（图 4A、B）：Rab11（与顶膜循环内体相关的囊泡）42 和尼罗红（脂质）。在 fkh RNAi 处理后，远端侧叶（DL）中 Rab11 荧光信号减弱（图 4A v 与 4B v；绿色）。然而，在中央叶（M）和近端侧叶（PL）中 Rab11 信号增强（图 4A vii、ix 与 4B vii、ix；绿色）。与对照 RNAi 处理相比，fkh RNAi 处理后尼罗红信号未见明显差异（图 4A、B；紫色）。这些数据表明，fkh 表达降低可能以一种在唾液腺不同叶之间存在差异的复杂方式影响部分分泌机制的功能。
| 数据集： | Goltsev | Neira Oviedo | Neira Oviedo | Baker | Baker | Baker | Baker | ||
| 基因符号 | 功能 | AGAP ID | 胚胎（25 小时） | L3 幼虫 | L3 唾液腺 | 成年雌性 躯体（3 天） | 成年雄性 躯体（3 天） | 成年雌性 唾液腺（3 天） | 成年雄性 唾液腺（3 天） |
| AAPP | 唾液蛋白 | AGAP009974 | 3.92 | 4.38 | 4.33 | 3.81 | 2.46 | 11.92 | 2.69 |
| CrebA | 转录因子 | AGAP001464 | 6.28 | 5.22 | 5.92 | 2.99 | 2.96 | 3.27 | 3.13 |
| " | 转录因子 | AGAP011038 | 4.50 | 4.46 | 5.23 | 2.96 | 2.86 | 3.05 | 2.88 |
| dsx | 转录因子 | AGAP004050 | 4.91 | 5.39 | 5.55 | 3.72 | 4.00 | 4.57 | 4.01 |
| fkh | 转录因子 | AGAP001671 | 5.18 | 4.67 | 5.25 | 2.99 | 3.09 | 3.21 | 3.05 |
| MUC2 | 唾液蛋白 | AGAP012020 | 4.59 | 5.53 | 5.63 | 2.96 | 3.07 | 3.08 | 3.26 |
| Rab11 | 囊泡运输 | AGAP004559 | 10.21 | 7.47 | 8.60 | 4.90 | 3.79 | 3.38 | 2.96 |
| sage | 转录因子 | AGAP013335 | 5.32 | 5.96 | 8.89 | 3.40 | 3.33 | 7.37 | 7.23 |
表1：平均log2微阵列表达谱 An. gambiae 目的基因 图中显示了基因名称、功能类别、Vectorbase（AGAP）标识符以及从Vectorbase收集的平均log2微阵列表达数据。这些数据表明，我们关注的基因（参与唾液腺（SG）细胞生物学及分泌功能）在三龄幼虫（L3）和成虫唾液腺中的表达水平相较于整个个体更高，且存在富集。
图1：f-Agdsx 和 fkh 在成年 An. gambiae 中的敲低可降低唾液腺（SGs）中 fkh 的mRNA水平，并影响雌蚊吸血能力。（A）本研究中用于dsRNA制备的质粒设计示意图。通过在用于扩增插入片段的3'引物中加入第二个T7启动子序列，将其引入pGEM-T质粒中。随后将该质粒转化至E. coli HT115 (DE3)细菌中，并用诱导后灭活的细菌悬浮于10%蔗糖水中制成饲喂溶液。（B）以针对f-Agdsx或fkh的dsRNA饲喂的蚊虫，其fkh转录本水平显著降低（单因素方差分析，多重比较；n=15）。然而，仅fkh dsRNA饲喂组（C）在成功获取血餐所需的刺探次数上表现出显著差异。该组蚊虫平均需要的探针尝试次数是对照组或dsx-dsRNA饲喂组的五倍（单因素方差分析，多重比较；n=15）。误差棒表示均值标准误（SEM）。每项实验均独立进行了三次生物学重复。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：fkh在成年An. gambiae唾液腺中的敲低导致唾液腺转录因子水平下降。图中显示的是成年雌性An. gambiae在口服暴露于以下处理8天（第5至13天）后第13天的代表性图像：（A）非相关dsRNA对照（ant）或（B）靶向唾液腺转录因子fork head（fkh，AGAP001671）的dsRNA，溶于10%蔗糖中，并用以下染料染色：DAPI（DNA；红色）、标记的小麦胚芽凝集素（WGA，几丁质/O-GlcNAc修饰；蓝色）、抗唾液腺转录因子Sage（绿色）和CrebA（紫色）的抗血清。图中所示比例尺单位为微米（µm）。唾液腺（i）以白色虚线勾勒。放大叶图像中（黄色方框内区域，标注为“inset”）的黄线表示信号强度线扫描的位置。每个放大叶的绿色和紫色通道强度线扫描结果在图像下方的图表中绘制（始终按图像中从左到右的方向）；X轴=距离（像素），Y轴=灰度单位（像素强度）。像素强度的动态范围由红色（最大值）和蓝色（最小值）虚线标示，相应数值在每个图中显示。MIP = 穿过整个唾液腺深度的最大强度三维投影。DL：远端侧叶；M：中叶；PL：近端侧叶；SD：唾液导管。请点击此处查看此图的放大版本。
图3: fkh 成年个体中的基因敲低 An. gambiae 唾液腺分泌的蛋白质水平因唾液腺减少而降低。 显示的是第13天成年雌性个体的代表性图像 An. gambiae SGs 在口服暴露8天（第5-13天）后A) 非相关dsRNA对照 (蚂蚁），或（B靶向SG转录因子的dsRNA 叉头 (fkh，AGAP001671）在10%蔗糖中染色，使用的染料包括DAPI（DNA；红色）、标记的小麦胚芽凝集素（WGA，几丁质/O-GlcNAc修饰；蓝色）以及唾液蛋白AAPP（绿色）和黏蛋白（MUC2，紫色）。标尺长度单位为微米。唾液腺（i）以白色虚线勾勒。放大叶图像中（黄色方框包围区域）的黄色线条表示信号强度线扫描的位置。每个叶的线扫描对应的绿色和紫色通道强度在图像下方的图表中绘制（始终从唾液腺左侧到右侧）；X轴=距离（像素），Y轴=灰度值（像素强度）。像素强度的动态范围由红色（最大值）和蓝色（最小值）虚线界定，相应数值显示在每个图中。MIP = 穿过整个唾液腺深度的最大强度三维投影。DL：远端侧叶；M：中叶；PL：近端侧叶；SD：唾液导管。斜体“DL标签（Bi）表示同一DL叶的两个可见区域。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 4：fkh 在成年 An. gambiae 蚊唾液腺中敲低可降低唾液腺分泌标志物的表达。图中显示的是成年雌性 An. gambiae 唾液腺在口服暴露于以下处理 8 天（第 5–13 天）后第 13 天的代表性图像：（A）非相关 dsRNA 对照（ant），或（B）靶向唾液腺转录因子 fork head（fkh，AGAP001671）的 dsRNA，溶于 10% 蔗糖中。组织经以下染料染色：DAPI（DNA，红色）、标记的小麦胚芽凝集素（WGA，几丁质/O-GlcNAc 修饰，蓝色）、尼罗红（脂质，紫色），以及针对再循环内体囊泡标志物 Rab11 的抗血清（绿色）。图中所示比例尺单位为微米（µm）。唾液腺（i）以白色虚线勾勒。放大叶图像中（黄色方框所包围区域）的黄色线条表示信号强度线扫描的位置。每张图像下方的图表展示了各叶对应的绿色和紫色通道的线扫描强度（在唾液腺中始终从左至右）；X 轴 = 距离（像素），Y 轴 = 灰度值（像素强度）。像素强度的动态范围由红色（最大值）和蓝色（最小值）虚线界定，相应数值标注于各图中。MIP = 穿过整个唾液腺深度的最大强度三维投影。DL：远端侧叶；M：中叶；PL：近端侧叶；SD：唾液导管。请点击此处查看该图的放大版本。
补充文件 1. 请点击此处下载该文件。
讨论
通过口服喂食将dsRNA有效递送至An. gambiae蚊虫，对实验室和野外环境下的媒介生物学研究具有广泛意义。显微注射长期以来被认为是向蚊虫递送化学物质、抗体、RNA干扰（RNAi）以及遗传修饰策略的首选方式43,44。采用口服递送方式可避免因大量物理操作所导致的细胞损伤和应激反应，且该方法还可能适用于大规模或野外应用。先前的研究表明，RNAi在单个成年蚊虫体内具有普遍作用29，可在包括唾液腺在内的所有组织中产生效应。通过喂食大量表达dsRNA的E. coli，这些细菌可在较长时间内异步消化，从而有可能在笼内所有个体中实现一致且均匀的RNAi暴露。该方法可同时喂养大量蚊虫，并可根据靶基因分析所产生表型的潜在变异性。然而，一个重要的考虑因素是细菌（以及由此产生的dsRNA）在棉纤维中可能存在分布不均的情况。如前所述并计算所得，每日用于蚊虫糖饲的400 µL细菌悬液含有约≤4.6 µg的dsRNA9，但每只蚊虫实际摄入的dsRNA量尚未单独测定。如果构建dsRNA载体成为常规操作，这一简单的处理方案将使任何蚊虫研究人员能够快速掌握并应用该技术。A priori，与学习并应用显微注射处理类似样本量所需的时间相比，该方法在处理过程中的时间投入（每天30分钟）微不足道。
通过喂食dsRNA进行反向遗传学研究在模式生物Caenorhabditis elegans中已被常规使用45。这种广泛的应用凸显了口服递送方法的重要价值。构建一个在转化的E. coli中的An. gambiae全基因组文库，类似于已存在于C. elegans中的文库46,47，将能够以更高的通量实现蚊虫的快速反向遗传筛选。然而，需要注意的是，该方法的效率在很大程度上取决于内源性转录本的水平，且若目标基因的表达不仅限于靶组织而是更广泛地表达，则会影响效果4,8,44。此外，有证据表明某些杀虫剂可能引发蚊虫的行为回避48，而喂食可能对蚊虫产生不良影响的细菌也可能触发类似的回避行为。在实验室的受控环境中，由于蚊虫没有其他食物来源，因此无法选择避开含有E. coli的糖水，此时对营养来源的需求可能压倒回避细菌的本能。然而，如果该策略拟在控制程度较低的环境中应用，则这一点必须加以考虑。
有可能同时靶向多个基因（使用一种构建体、多种构建体，或转化后细菌分离物的混合物），但尚需进一步研究以评估其有效性。与此相关的一个重要考虑因素是，使用单一或多个靶点时可能产生的脱靶效应或协同效应的评估。建立适当的对照基因和对照组是实验设计中的重要环节。此外，可以推测该方法或许可用于靶向其他病原体或病毒49。此前在蚊子中诱导RNA干扰的研究是在试剂直接注射的条件下进行的，因此不存在大肠杆菌（E. coli）。而大肠杆菌（E. coli）可能提供一个保护性环境，使双链RNA（dsRNA）随时间缓慢释放，从而在更长的时间内维持相对持续的暴露状态29。
最后，这些结果表明，通过调整暴露的时间范围（持续时间和起始天数）以及使用的 E. coli 数量，可调节该技术的效果。这一特性使我们能够通过反复试验确定最佳的基因敲低条件，从而研究必需基因（dsx 和 fkh）的功能。这大大提高了利用该技术研究目标基因的可能性。
总之，研究发现，通过口服方式将RNAi递送至成年蚊子是一种简单、通用且强大的方法，可用于研究蚊子基因功能，并为蚊媒疾病的媒介控制提供新型且可调控的工具。
披露
作者声明不存在需要披露的利益冲突。
致谢
作者谨此感谢美国疾病控制与预防中心（CDC）昆虫学部门和寄生虫病与疟疾部门的工作人员和科学家，以及约翰斯·霍普金斯大学（JHU）的 Brian Trigg 和 Michelle Chiu 在细菌制备方面提供的帮助或对本研究的有益讨论。感谢约翰斯·霍普金斯疟疾研究所（JHMRI）昆虫饲养室及其负责人 Chris Kizito 提供并饲养了冈比亚按蚊（An. gambiae）蚊虫。感谢约翰斯·霍普金斯大学布隆伯格公共卫生学院（JHSPH）的 Wei Huang 协助获取本研究中使用的质粒 PJet GFP 和 pPB47 GFP。本研究的资金来源包括：美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R21AI153588（授予 DJA）；约翰斯·霍普金斯疟疾研究所博士后奖学金（授予 MW）；以及由 Good Ventures 基金会和开放慈善项目（Open Philanthropy Project）资助、通过 CDC 基金会提供的项目“支持蚊虫雌性发育的冷冻保存与抑制以促进疟疾研究”（2017 年，开放慈善项目）。我们衷心感谢约翰斯·霍普金斯大学显微镜设施的技术人员，以及支持本研究所用显微镜的 NIH 相关资助（NIH 资助号：S10OD016374）。本文所述的研究发现和结论仅代表作者观点，不一定代表美国疾病控制与预防中心（CDC）的立场。文中提及的商品名称仅用于标识目的，不意味着美国疾病控制与预防中心、公共卫生署或美国卫生与公共服务部的认可。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 | |
| 2x 酵母提取物胰蛋白胨（2xYT）培养基 | BD Difco | DF0440-17 | |
| AAPP | n/a | n/a | 抗血清，1:50 稀释（兔）；由 Fabrizio Lombardo 赠送 |
| AccuStart II PCR Supermix | Quantabio | 95137-100 | |
| 琼脂糖 | Millipore Sigma | A9539 | |
| 氨苄青霉素 | Millipore Sigma | A5354 | |
| Anopheles gambiae G3 | 生物防御与新发感染（BEI）疟疾研究与参考试剂资源中心（MR4） | MRA-112 | |
| BugDorm | BioQuip | 1452 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | P022628181 | |
| CrebA | DSHB | CrebA Rbt-PC | 抗血清，1:50 稀释（兔）；由 Andrew 实验室制备 |
| Damiens 饮食 | BioServ | ||
| DAPI | Life Technologies | n/a | 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；1:200 稀释 |
| 脱纤维绵羊血 | HemoStat | DSB050 | |
| Escherichia coli HT115 (DE3) | |||
| 溴化乙锭 | Millipore Sigma | E7637 | |
| High-Capacity cDNA 反转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| 异丙基 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷 | Millipore Sigma | I5502 | |
| JM109 感受态细胞 | Promega | L2005 | |
| LB 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 10855001 | |
| Mucin 2 | Proteintech | Muc2; 27 675-1-AP | 抗血清，1:100 稀释（小鼠） |
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 尼罗红 | Sigma | n/a | 脂质染料，1:50 稀释 |
| Owl EasyCast B2 Mini Gel 水平电泳系统 | Thermo Fisher Scientific | Model B2 | |
| pGEMT easy | Promega | A3600 | |
| Power SYBR-green PCR 主混合液 | Applied Biosystems | 4367659 | |
| PureLink PCR 纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K31001 | |
| QuantaStudio 6 | Applied Biosystems | ||
| QuantStudio6 实时 PCR 系统 | Applied Biosystems | ||
| Rab11 | n/a | n/a | 抗血清，1:100 稀释（兔）；由 Andrew 实验室制备 |
| Rh-WGA | Vector Labs | n/a | 罗丹明标记的小麦胚芽凝集素（几丁质、O-GlcNAc 修饰染料）；1:40 稀释 |
| Sage | n/a | n/a | 抗血清，1:50 稀释（大鼠）；由 Andrew 实验室制备 |
| T4 DNA 连接酶 | Promega | M1801 | |
| 四环素 | Millipore Sigma | 87128 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Zeiss LSM700 荧光共聚焦显微镜 | Zeiss | ||
| 抗体 | |||
| 鸡抗大鼠 IgG (H+L)，Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21472 | |
| 山羊抗小鼠 IgG (H+L)，Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A28181 | |
| IgG (H+L) 山羊抗兔，Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27034 | |
| 兔抗山羊 IgG (H+L)，Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27012 | |
| 引物 | |||
| ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA | CDC 生物技术核心设施分部 | n/a | qRT-PCR 引物 |
| ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC CGGA | CDC 生物技术核心设施分部 | n/a | qRT-PCR 引物 |
| FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA | CDC 生物技术核心设施分部 | n/a | qRT-PCR 引物 |
| FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC | CDC 生物技术核心设施分部 | n/a | qRT-PCR 引物 |
| newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT | CDC 生物技术核心设施分部 | n/a | qRT-PCR 引物 |
| newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA | CDC 生物技术核心设施分部 | n/a | qRT-PCR 引物 |
| S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC | CDC 生物技术核心设施分部 | n/a | qRT-PCR 引物 |
| S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC | CDC 生物技术核心设施分部 | n/a | qRT-PCR 引物 |
参考文献
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