蓝藻中完整藻胆体的分离与表征

Summary

目前的方案详细介绍了通过不连续蔗糖密度梯度离心从蓝藻中分离藻胆体的过程。完整的藻糖体的分数通过77K荧光发射光谱和SDS-PAGE分析得到证实。所得的藻胆体组分适用于TEM的负染色和质谱分析。

Abstract

在蓝藻中，藻胆体是一种重要的天线蛋白复合物，它收集光并将能量转移到光系统I和II进行光化学。研究藻胆体的结构和组成对科学家来说非常有趣，因为它揭示了蓝藻中光合作用的进化和分化。该协议提供了一种详细且优化的方法，通过磁珠打浆机以低成本有效地破坏蓝藻细胞。然后，完整的藻胆体可以通过蔗糖梯度超速离心从细胞提取物中分离出来。该方法已被证明适用于具有不同细胞类型的模型和非模型蓝藻。还提供了分步程序，通过77K荧光光谱和SDS-PAGE用硫酸锌和考马斯蓝染色来确认藻胆蛋白的完整性和性质。分离出的藻胆体也可以进行进一步的结构和成分分析。总体而言，该协议提供了一个有用的入门指南，使不熟悉蓝藻的研究人员能够快速分离和表征完整的藻类化合物。

Introduction

藻胆体（PBS）是一种巨大的水溶性色素 - 蛋白质复合物，附着在蓝细菌的类囊体膜中光系统的细胞质侧¹。PBS主要由有色藻胆蛋白和无色连接蛋白^组成1，2。藻胆蛋白可分为四大类:藻红素、藻红蓝蛋白、藻蓝蛋白和异体花青素³。四大类吸收490-650nm范围内不同波长的光能，叶绿素吸收效率低^下3。PBS可以用作光收集天线，用于收集光能并将其输送到光系统II和^I4。

PBS的结构和组成因物种而异。总的来说，在不同的蓝藻物种中已经鉴定出三种形状的藻胆体（半盘状、束状和杆状）⁵。即使在同一物种中，PBS的组成也会随环境而变化，例如光质和营养消耗^{6，7，8，9，10，}

Protocol

胞藻属PCC 6803，模型葡萄糖耐受菌株，从台湾中央研究院的Chu，Hsiu-An博士获得。Leptolyngbya sp. JSC-1，非模型丝状，是从美国宾夕法尼亚州立大学的Donald A. Bryant博士那里获得的。

1. 细胞培养和收获

1. 使用金属接种回路将Syn6803或JSC-1细胞接种到含有50 mL B-HEPES培养基的100 mL锥形烧瓶^中28。在30°C下，在50μmol光子^{m-2 s-1}（白光LED）下在1%（v / v）_CO2中培养细胞，并通过磁力搅拌器（120rpm）不断搅拌，直到培养物达到中等指数生长阶段（_OD750 = 0.6-0.8）。
   注意:当培养物在750nm处的光密度（_OD750）达到0.6-0.8时，通过转移到新的烧瓶中收获细胞培养物。光密度通常用于估计液体培养物中的微生物细胞密度²⁹。720-750 nm的波长用于各种研究，用于测量蓝藻生长^30，31，32

Results

将Syn6803和JSC-1细胞在锥形烧瓶中培养，在30°C的B-HEPES培养基中，在LED白光（50μmol光子^m-2s-1）下在充满1%（v / v）_CO2的生长室中持续搅拌。在指数生长阶段（_OD750 = ~0.5），将细胞转培养到最终光密度为OD ₇₅₀ = ~0.2的新鲜培养基中。在达到晚期指数生长阶段（_OD750 = 0.6-0.8）后，收集培养物并离心（室温下10，000×g20分钟）。弃去上清液，并将细胞沉淀储存在-80°C直至下一步可用。

为了破坏细胞，首先在室温下解冻细胞。在0.75 M K-磷酸盐缓冲液中用0.1mm玻璃珠敲打细胞。完全细胞裂解显示离心前深蓝绿色的上清液（图1B）。通过Triton X-100溶解并离心除去不溶性膜和细胞碎片后，将上清液加载到蔗糖梯度溶液的顶部，置于40mL离心管中（图1C

Discussion

该协议描述了一种简单而标准的方法，用于分离两种类型的蓝藻中的完整PBS，单细胞模型Syn6803和丝状非模型JSC-1。该方案的关键步骤是在蔗糖的不连续密度梯度上进行细胞均质化和超速离心。通常，丝状细胞的破坏比单细胞细胞更复杂。增加起始物质的量（细胞沉淀的湿重）和重复的磁珠打有助于提高丝状蓝藻细胞PBS的产量。对于丝状蓝藻JSC-1，使用的细胞是单细胞Syn6803的三倍。此外，要完全破坏丝状蓝藻，需要比单细胞蓝藻更多的珠子跳动才能观察提取缓冲液中的深蓝紫色。

建议打孔的持续时间不要超过30秒，因为样品在每个打珠循环期间都会被加热。建议在每个周期之间将管子在室温下在工作台上（或在水浴中）冷却，因为完整的PBS在低温下很容易解离²⁵。因此，建议在室温下进行该协议中的每个程序。许多研究文章描述了不同的细胞破碎方法，包括高压均质器（法国出版社）或超声仪^6，8，20

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mm 玻璃珠	PBS 萃取	BioSpec	11079101
13 mL 离心管	日立	13PA	超速离心
管 40 mL 离心管	日立	40PA	超速离心
酸	Merck	8.1875.2500	用于考马斯蓝染色
B-HEPES 培养基			来自 BG-11 培养基的改性蓝藻培养基
亮蓝 R-250	Sigma	B-0149	用于考马斯蓝染色
溴酚蓝	Wako 纯化学工业	2-291	蛋白质上样缓冲液
电子天平	Radwag	WLC 2/A2/C/2	用于细胞沉淀的湿重测量
荧光分光光度计	Hitachi	F-7000	分光光度计
甘油	BioShop	Gly001.500	蛋白质上样缓冲液
缓冲液交换	高速冷冻离心机	Hitachi	CR22N
Leptolyngbya sp. JSC-1			来自美国宾夕法尼亚州立大学的 Donald A. Bryant 博士。
低温测量附件	Hitachi	5J0-0112	该附件包括一个用于 77K 荧光光谱的透明杜瓦瓶容器。
甲醇	Merck	1.07018,2511	用于考马斯蓝染色
微量离心机	Thermo Fisher	Pico 21	用于 PBS 萃取
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	607 型	，用于 PBS 萃取
磷酸氢二钾	PanReac AppliChem	121512.121
二氢钾	PanReacAppliChem	141509.121	用于 PBS 萃取
螺口盖样品瓶	BioSpec	10832	用于 PBS 萃取
SmartView Pro Imager	Major Science	UVCI-2300	用于锌染色信号检测
十二烷基硫酸钠	Zymeset	BSD101	蛋白上样缓冲液
蔗糖	Zymeset	BSU101	用于 PBS 分离
集胞藻 sp. PCC 6803			耐葡萄糖菌株，来自台湾中央研究院
Tris	BioShop	TRS 011.1	蛋白质上样缓冲液
Triton X-100	PBS 提取	BioShop	TRX 506.500
Ultra 10 K 膜离心过滤器	Millipore	UFC901024	缓冲液交换
超 3 K 膜离心过滤器	缓冲液交换	Millipore	UFC500324
超速离心机	日立	CP80WX	超速离心
紫外/可见分光光度计	安捷伦	Cary 60	分光光度计
锌	PanReac AppliChem	131787.121	用于锌染色
和 β;-巯基乙醇	BioBasic	MB0338	蛋白上样缓冲液