蓝藻中完整藻胆体的分离与表征

摘要

目前的方案详细介绍了通过不连续蔗糖密度梯度离心从蓝藻中分离藻胆体的过程。完整的藻糖体的分数通过77K荧光发射光谱和SDS-PAGE分析得到证实。所得的藻胆体组分适用于TEM的负染色和质谱分析。

摘要

在蓝藻中，藻胆体是一种重要的天线蛋白复合物，它收集光并将能量转移到光系统I和II进行光化学。研究藻胆体的结构和组成对科学家来说非常有趣，因为它揭示了蓝藻中光合作用的进化和分化。该协议提供了一种详细且优化的方法，通过磁珠打浆机以低成本有效地破坏蓝藻细胞。然后，完整的藻胆体可以通过蔗糖梯度超速离心从细胞提取物中分离出来。该方法已被证明适用于具有不同细胞类型的模型和非模型蓝藻。还提供了分步程序，通过77K荧光光谱和SDS-PAGE用硫酸锌和考马斯蓝染色来确认藻胆蛋白的完整性和性质。分离出的藻胆体也可以进行进一步的结构和成分分析。总体而言，该协议提供了一个有用的入门指南，使不熟悉蓝藻的研究人员能够快速分离和表征完整的藻类化合物。

引言

藻胆体（PBS）是一种巨大的水溶性色素 - 蛋白质复合物，附着在蓝细菌的类囊体膜中光系统的细胞质侧¹。PBS主要由有色藻胆蛋白和无色连接蛋白^组成1，2。藻胆蛋白可分为四大类:藻红素、藻红蓝蛋白、藻蓝蛋白和异体花青素³。四大类吸收490-650nm范围内不同波长的光能，叶绿素吸收效率低^下3。PBS可以用作光收集天线，用于收集光能并将其输送到光系统II和^I4。

PBS的结构和组成因物种而异。总的来说，在不同的蓝藻物种中已经鉴定出三种形状的藻胆体（半盘状、束状和杆状）⁵。即使在同一物种中，PBS的组成也会随环境而变化，例如光质和营养消耗^{6，7，8，9，10，11}。因此，从蓝藻中分离PBS的实验程序有助于研究^PBS12。几十年来，许多不同的方案已经分离出PBS并分析了其结构，组成和功能^{6，7，8，12，13，14，15，16，17}。PBS分离方法种类繁多，确实为使用不同的试剂和仪器分离不同物种中的复合物提供了灵活性。然而，这也使得不熟悉蓝藻和PBS的科学家更难选择合适的方案。因此，在这项工作中为那些有兴趣从蓝藻中开始PBS分离的人开发了一个通用且直接的方案。

此处总结了从以前的出版物中分离 PBS 的方法。由于PBS是一种水溶性蛋白质复合物并且容易解离，因此在提取过程中需要高离子强度的磷酸盐缓冲液来稳定^PBS18。过去曾发表过几篇描述从蓝藻中分离PBS的方法的研究文章。大多数方法需要高浓度的磷酸盐缓冲液^{8，14，15，18，19}。然而，机械破坏细胞的程序各不相同，例如玻璃珠辅助提取，超声处理²⁰和法式压榨^6，8，14。不同的藻胆蛋白可以通过用硫酸铵²⁰ 沉淀并通过^HPLC21 或色谱柱²²纯化来获得。另一方面，完整的PBS可以通过蔗糖密度梯度超速离心轻松分离^6，8，15。

在该协议中，使用一种模型蓝藻和一种非模型蓝藻作为PBS分离的材料。它们是模型单细胞葡萄糖耐受 性Synechocystis sp. PCC 6803（以下简称Syn6803）和非模型丝状 Leptolyngbya sp. JSC-1（以下简称JSC-1），分别^7，23，24。该协议首先在高离子强度磷酸盐缓冲液中破坏单细胞和丝状蓝藻。裂解后，通过离心收集上清液，然后用非离子洗涤剂（Triton X-100）处理，以溶解来自类囊体膜的水溶性蛋白质。将总水溶性蛋白施加到不连续的蔗糖密度梯度上以分馏PBS。该方案中不连续的蔗糖梯度由四种蔗糖溶液组成，并将完整的PBS分配在蔗糖层^{的最低部分25}中。PBS的完整性可以通过SDS-PAGE，锌染色和77K荧光光谱分析^{6，7，8，26}。这种方法适用于旨在从蓝藻中分离完整PBS并研究其光谱，结构和组成特性的科学家。

此协议有几个优点。（1）该方法是标准化的，可用于从单细胞和丝状蓝藻中分离完整的PBS。大多数文章描述了应用于任何一种类型的蓝藻^4，7，^8，12^{，13，14，16，18}的方法。（2）该方法在室温下进行，因为PBS在低温下解离^19，27。（3）该方法描述了使用珠状敲击剂来破坏细胞;因此，它比高压法国压力机更便宜，更安全，并且其他方法中超声波仪可能造成的听力损伤^{8，13，14，20}。（4）该方法通过蔗糖梯度超速离心分离完整的PBS。通过这种方式，可以根据蔗糖浓度分离具有不同大小和部分解离PBS的完整PBS。

方案

胞藻属PCC 6803，模型葡萄糖耐受菌株，从台湾中央研究院的Chu，Hsiu-An博士获得。Leptolyngbya sp. JSC-1，非模型丝状，是从美国宾夕法尼亚州立大学的Donald A. Bryant博士那里获得的。

1. 细胞培养和收获

1. 使用金属接种回路将Syn6803或JSC-1细胞接种到含有50 mL B-HEPES培养基的100 mL锥形烧瓶^中28。在30°C下，在50μmol光子^{m-2 s-1}（白光LED）下在1%（v / v）_CO2中培养细胞，并通过磁力搅拌器（120rpm）不断搅拌，直到培养物达到中等指数生长阶段（_OD750 = 0.6-0.8）。
   注意:当培养物在750nm处的光密度（_OD750）达到0.6-0.8时，通过转移到新的烧瓶中收获细胞培养物。光密度通常用于估计液体培养物中的微生物细胞密度²⁹。720-750 nm的波长用于各种研究，用于测量蓝藻生长^30，31，32。在该协议中，使用_OD750 是因为JSC-1可以产生吸收远红光的颜料⁷。或者，叶绿素浓度也用于测量蓝藻的生长³³。
2. 将细胞培养物（_OD750 〜0.8）转移到1L锥形烧瓶中，并将其稀释至_OD750 = 0.2在500mL B-HEPES培养基中。在上述相同条件下（步骤1.1）培养培养物直到指数生长阶段晚期（_OD750 = 0.8-1.0），然后通过离心收获培养物。
3. 在室温下以10，000 ×g 离心培养物20分钟，并完全丢弃上清液。
   注意:细胞沉淀可以在-80°C下储存长达6个月。

2. 细胞裂解

1. 悬浮细胞沉淀并用0.75M磷酸钾缓冲液洗涤两次，pH 7。
   注意:要在pH 7下制备0.75 M磷酸钾缓冲液，请分别制备1.5 M _K2HPO4和1.5 M _KH2PO4。混合615 mL 1.5 M _K2HPO4和385 ml 1.5M _KH2PO4，在pH 7下获得1.5M K-磷酸盐缓冲液。只需用相同量的ddH ₂ O稀释即可在pH 7下制成0.75M磷酸钾缓冲液。
2. 通过在室温下以10，000 ×g 离心20分钟将细胞沉淀在50mL离心管中。弃去上清液并用0.75M磷酸钾缓冲液重悬细胞。通过电子天平测量沉淀的湿重，并将沉淀的1g湿重在5mL缓冲液中。
   注意:通过从含有细胞沉淀的离心管的重量中减去空离心管的重量来测量沉淀的湿重。
3. 将1mL细胞悬浮液和0.4-0.6g0.1mm玻璃珠（见 材料表）加入2mL螺旋盖小瓶中。
4. 用打珠器将细胞破碎30秒（见 材料表）。让管子在室温水浴中冷却2分钟，并重复破碎循环5次。
5. 裂解后，在室温下以500× g 离心小瓶10秒。用移液管将上清液收集到15 mL离心管中。用0.5mL的0.75M磷酸钾缓冲液洗涤珠子一次，然后转移到同一离心管中。
6. 将Triton X-100（2%w / v，终浓度）加入裂解的细胞悬浮液中，并在室温下在摇摆振荡器（40rpm）上孵育，直到溶液变得均匀（〜20分钟）。
7. 将管子以17，210g离心20分钟，以除去完整的细胞和大细胞碎片。将没有上部Triton胶束层的上清液在室温下储存长达1小时。
   注意:上清液包含两个分离的层。上部疏水性Triton X层含有叶绿素结合蛋白和疏水性杆状藻糖体⁶。下层水层含有水溶性PBS。

3. 蔗糖梯度缓冲液的制备和PBS分离

1. 在pH 7的0.75M K-磷酸盐缓冲液中制备四种浓度的蔗糖（2.0 M，1.0 M，0.75 M和0.5 M）。
   注意:建议在pH 7下使用1.5M磷酸钾缓冲液来制备蔗糖梯度，因为添加蔗糖会稀释K-磷酸盐缓冲液的浓度。蔗糖完全溶解后，加入_ddH2O，调节浓度至0.75M，pH 7。
2. 将2.8mL 2.0 M蔗糖缓冲液置于40 mL离心管的底部，并用三层蔗糖溶液（8 mL 1.0 M;12 mL 0.75 M和11 mL 0.5 M用于40 mL离心管）覆盖，最后覆盖含有PBS的上清液部分（3.0 mL）（图1A）。
   注意:小心地加入蔗糖溶液，让蔗糖在管内非常缓慢地滴落。在装入溶液时，将移液器吸头保持在管中溶液表面的正上方。蔗糖层在缓慢分层时可以观察到。
3. 在25°C下以125，800× g 离心所得梯度约16h-20小时。注意:此步骤需要超速离心机（见 材料表）。
4. 在超离心时，在层之间冷凝分馏的PBS和藻胆蛋白。在界面中观察到Syn6803中的蓝色条带（JSC-1中显示的紫色条带）（图1D）。
5. 用移液管从蔗糖梯度的顶部慢慢收集馏分。通过反复浓缩（3，500× g 20分钟）并在膜离心过滤单元中用0.75M K-磷酸盐缓冲液稀释馏分来除去蔗糖（10K分子量边界，见 材料表）。

4. 77K时PBS荧光的测量

注:配备液氮容器的荧光计（见 材料表）用于测量77K的荧光光谱。

1. 用0.75 M磷酸钾缓冲液稀释浓缩的PBS样品，以获得至少500μL。
   注:样品的藻蓝蛋白浓度为~4.2μgmL-1，基于以下公式:（_OD615 0.474 x _OD652）/5.34 [mg/mL]³⁴。
2. 将500μLPBS样品加入透明玻璃管中，并将管子冷冻在液氮中直至完全冷冻。将冷冻管移动到预先充满液氮的透明杜瓦瓶容器（见 材料表）中。
   注意:在本协议中，玻璃管的内径为3 mm。使用薄玻璃管来最小化样品中短波长发射的再吸收。
3. 选择藻红素和藻蓝蛋白的激发波长分别为550nm和580nm。
   注:荧光发射记录在560-800nm（550nm激发）或600-800nm（580nm激发）

5. PBS的SDS-PAGE分析

1. 缓冲液在膜离心过滤装置中将0.75 M磷酸钾溶液中的浓缩PBS样品与50 mM Tris缓冲液（pH 8.0）交换（分子量截止值，见 材料表）。
2. 将50μLPBS溶液与10μL6x SDS加载缓冲液[300mM Tris pH 6.8，12%（w / v）十二烷基硫酸钠，0.06%（w / v）溴酚蓝，50%（v / v）甘油，6%（v / v）β - 巯基乙醇]（见 材料表）混合在微量离心管中，并在95°C下在加热块中孵育10分钟。
3. 通过SDS-PAGE（8%-20%（w / v）聚丙烯酰胺凝胶）分离蛋白质样品，并继续进行锌和考马斯染色。详细过程已在参考文献 ⁸ 中描述。
4. 对于锌染色，在室温下将凝胶在50 mM ZnSO4溶液中孵育10分钟，用蒸馏水洗涤凝胶，并在紫外辐射（312nm）下可视化锌诱导的荧光。
5. 对于考马斯蓝染色，将凝胶在考马斯蓝染色缓冲液[0.25%（w / v）的考马斯R-250，10%（v / v）乙酸，50%（v / v）甲醇中孵育凝胶，见 材料表]在室温下1小时。用蒸馏水洗涤凝胶两次以除去残留的染色缓冲液，并在室温下在摇摇摇杯（40rpm）上用脱色缓冲液[10%（v / v）乙酸，30%（v / v）甲醇]孵育凝胶过夜。使用数码相机或扫描仪可视化完全脱色的凝胶。

结果

将Syn6803和JSC-1细胞在锥形烧瓶中培养，在30°C的B-HEPES培养基中，在LED白光（50μmol光子^m-2s-1）下在充满1%（v / v）_CO2的生长室中持续搅拌。在指数生长阶段（_OD750 = ~0.5），将细胞转培养到最终光密度为OD ₇₅₀ = ~0.2的新鲜培养基中。在达到晚期指数生长阶段（_OD750 = 0.6-0.8）后，收集培养物并离心（室温下10，000×g20分钟）。弃去上清液，并将细胞沉淀储存在-80°C直至下一步可用。

为了破坏细胞，首先在室温下解冻细胞。在0.75 M K-磷酸盐缓冲液中用0.1mm玻璃珠敲打细胞。完全细胞裂解显示离心前深蓝绿色的上清液（图1B）。通过Triton X-100溶解并离心除去不溶性膜和细胞碎片后，将上清液加载到蔗糖梯度溶液的顶部，置于40mL离心管中（图1C

讨论

该协议描述了一种简单而标准的方法，用于分离两种类型的蓝藻中的完整PBS，单细胞模型Syn6803和丝状非模型JSC-1。该方案的关键步骤是在蔗糖的不连续密度梯度上进行细胞均质化和超速离心。通常，丝状细胞的破坏比单细胞细胞更复杂。增加起始物质的量（细胞沉淀的湿重）和重复的磁珠打有助于提高丝状蓝藻细胞PBS的产量。对于丝状蓝藻JSC-1，使用的细胞是单细胞Syn6803的三倍。此外，要完全破坏丝状蓝藻，需要比单细胞蓝藻更多的珠子跳动才能观察提取缓冲液中的深蓝紫色。

建议打孔的持续时间不要超过30秒，因为样品在每个打珠循环期间都会被加热。建议在每个周期之间将管子在室温下在工作台上（或在水浴中）冷却，因为完整的PBS在低温下很容易解离²⁵。因此，建议在室温下进行该协议中的每个程序。许多研究文章描述了不同的细胞破碎方法，包括高压均质器（法国出版社）或超声仪^6，8，20

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 mm 玻璃珠	PBS 萃取	BioSpec	11079101
13 mL 离心管	日立	13PA	超速离心
管 40 mL 离心管	日立	40PA	超速离心
酸	Merck	8.1875.2500	用于考马斯蓝染色
B-HEPES 培养基			来自 BG-11 培养基的改性蓝藻培养基
亮蓝 R-250	Sigma	B-0149	用于考马斯蓝染色
溴酚蓝	Wako 纯化学工业	2-291	蛋白质上样缓冲液
电子天平	Radwag	WLC 2/A2/C/2	用于细胞沉淀的湿重测量
荧光分光光度计	Hitachi	F-7000	分光光度计
甘油	BioShop	Gly001.500	蛋白质上样缓冲液
缓冲液交换	高速冷冻离心机	Hitachi	CR22N
Leptolyngbya sp. JSC-1			来自美国宾夕法尼亚州立大学的 Donald A. Bryant 博士。
低温测量附件	Hitachi	5J0-0112	该附件包括一个用于 77K 荧光光谱的透明杜瓦瓶容器。
甲醇	Merck	1.07018,2511	用于考马斯蓝染色
微量离心机	Thermo Fisher	Pico 21	用于 PBS 萃取
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	607 型	，用于 PBS 萃取
磷酸氢二钾	PanReac AppliChem	121512.121
二氢钾	PanReacAppliChem	141509.121	用于 PBS 萃取
螺口盖样品瓶	BioSpec	10832	用于 PBS 萃取
SmartView Pro Imager	Major Science	UVCI-2300	用于锌染色信号检测
十二烷基硫酸钠	Zymeset	BSD101	蛋白上样缓冲液
蔗糖	Zymeset	BSU101	用于 PBS 分离
集胞藻 sp. PCC 6803			耐葡萄糖菌株，来自台湾中央研究院
Tris	BioShop	TRS 011.1	蛋白质上样缓冲液
Triton X-100	PBS 提取	BioShop	TRX 506.500
Ultra 10 K 膜离心过滤器	Millipore	UFC901024	缓冲液交换
超 3 K 膜离心过滤器	缓冲液交换	Millipore	UFC500324
超速离心机	日立	CP80WX	超速离心
紫外/可见分光光度计	安捷伦	Cary 60	分光光度计
锌	PanReac AppliChem	131787.121	用于锌染色
和 β;-巯基乙醇	BioBasic	MB0338	蛋白上样缓冲液