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方法文章

蓝细菌中完整藻胆体的分离与表征

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DOI：

10.3791/63272

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2021年11月10日

 , 
1Department of Life Science, National Taiwan University, 2Institute of Plant Biology, National Taiwan University

本文内容

摘要

本方案详细描述了通过不连续蔗糖密度梯度离心法从蓝细菌中分离藻胆体的方法。通过77K荧光发射光谱和SDS-PAGE分析确认完整藻胆体的组分。所得藻胆体组分适用于透射电子显微镜负染和质谱分析。

摘要

在蓝细菌中，藻胆体是一种重要的天线蛋白复合物，能够捕获光能并将能量传递给光系统I和II以进行光化学反应。研究藻胆体的结构与组成一直受到科学家的高度关注，因为它揭示了蓝细菌光合作用的进化与分化过程。本实验方案提供了一种经济、高效、使用珠磨破碎仪破碎蓝细菌细胞的详细且优化的方法。随后可通过蔗糖梯度超速离心从细胞裂解液中分离出完整的藻胆体。该方法已被证实适用于多种不同细胞类型的模式与非模式蓝细菌。本文还提供了一步一步的操作流程，通过77 K荧光光谱以及硫酸锌和考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE，验证藻胆蛋白的完整性与特性。分离得到的藻胆体还可用于进一步的结构与组成分析。总体而言，本方案提供了一个实用的入门指南，使不熟悉蓝细菌的研究人员也能快速分离和表征完整的藻胆体。

引言

藻胆体（PBS）是一种大型水溶性色素-蛋白质复合物，附着在蓝细菌类囊体膜光系统胞质侧1。藻胆体主要由有色藻胆蛋白和无色连接蛋白组成1,2。藻胆蛋白可分为四大类：藻红蛋白、藻红蓝蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白3。这四大类蛋白可吸收490–650 nm波长范围内的光能，该范围的光能被叶绿素吸收效率较低3。藻胆体可作为光捕获天线，收集光能并将其传递至光系统II和光系统I4。

PBS 的结构和组成因物种而异。在不同蓝细菌物种中，已发现三种形态的藻胆体（半盘状、束状和棒状）5。即使在同一物种中，PBS 的组成也会随着环境条件（如光质和营养耗竭）发生变化6,7,8,9,10,11。因此，从蓝细菌中分离 PBS 的实验方法在研究 PBS 方面发挥了重要作用12。数十年来，已有多种不同方案用于分离 PBS，并对其结构、组成和功能进行分析6,7,8,12,13,14,15,16,17。多种多样的 PBS 分离方法确实为使用不同试剂和仪器从不同物种中分离该复合物提供了灵活性。然而，对于不熟悉蓝细菌和 PBS 的科研人员而言，这也使得选择合适的实验方案变得更加困难。因此，本研究建立了一种通用且简便的实验流程，以服务于希望开展蓝细菌 PBS 分离工作的研究人员。

本文总结了先前文献中分离PBS的方法。由于PBS是一种水溶性蛋白复合物，且易于解离，因此在提取过程中需要使用高离子强度的磷酸盐缓冲液以维持其稳定性18过去已发表多篇关于从蓝细菌中分离PBS方法的研究文章。大多数方法需要高浓度的磷酸盐缓冲液8,14,15,18,19然而，细胞机械破碎的方法各不相同，例如玻璃珠辅助提取法、超声处理法20和法国压滤器6,8,14. 通过硫酸铵沉淀可获得不同的藻胆蛋白20 并通过高效液相色谱法纯化21 或色谱柱22另一方面，完整的PBS可通过蔗糖密度梯度超速离心法轻松分离。6,8,15.

在本方案中，一种模式蓝细菌和一种非模式蓝细菌被用作分离藻胆体的材料。它们均为模式单细胞蓝细菌 葡萄糖耐受的 集胞藻属 sp. PCC 6803（以下简称Syn6803）和非模式丝状 Leptolyngbya sp. JSC-1（以下简称JSC-1）7,23,24该方案首先在高离子强度的磷酸盐缓冲液中裂解单细胞和丝状蓝细菌。裂解后，通过离心收集上清液，随后加入非离子型去污剂（Triton X-100）处理，以溶解类囊体膜中的水溶性蛋白。将总水溶性蛋白加载至不连续蔗糖密度梯度中，用于分离藻胆体（PBS）。本方案中的不连续蔗糖梯度由四种不同浓度的蔗糖溶液组成，可将完整的PBS分离至蔗糖梯度的最低层组分中25PBS 的完整性可通过 SDS-PAGE、锌染色和 77K 荧光光谱法进行分析6,7,8,26该方法适用于旨在从蓝细菌中分离完整藻胆体（PBS）并研究其光谱、结构和组成特性的科研人员。

本方案具有多个优势。（1）该方法已标准化，可用于从单细胞和丝状蓝细菌中分离完整的藻胆体（PBS）。大多数文献报道的方法仅适用于其中一种类型的蓝细菌4,7,8,12,13,14,16,18。（2）该方法在室温下进行，因为藻胆体在低温下会发生解离19,27。（3）该方法采用珠磨法破碎细胞，因此相较于高压French压碎法以及其它方法中超声波破碎仪可能造成的听力损伤，本方法成本更低且更安全8,13,14,20。（4）该方法通过蔗糖梯度超速离心分离完整的藻胆体。借此，可根据蔗糖浓度分离不同大小的完整藻胆体以及部分解离的藻胆体。

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方案

集胞藻属（Synechocystis）sp. PCC 6803 是一种耐葡萄糖的模式菌株，由台湾中国科学院褚修安（Chu, Hsiu-An）博士提供。Leptolyngbya sp. JSC-1 是一种非模式丝状蓝藻，由美国宾夕法尼亚州立大学唐纳德·A·布莱恩特（Donald A. Bryant）博士提供。

1. 细胞培养与收获

  1. 使用金属接种环将 Syn6803 或 JSC-1 细胞接种至含有 50 mL B-HEPES 培养基的 100 mL 锥形瓶中28。在 30 °C、1% (v/v) CO2 条件下，以 50 µmol 光子 m-2 s-1（白光 LED）光照并用磁力搅拌器持续搅拌（120 rpm）培养细胞，直至培养物进入对数生长中期（OD750 = 0.6–0.8）。
    注意：当培养物在 750 nm 处的光密度（OD750）达到 0.6–0.8 时，转移至新锥形瓶进行收集。光密度通常用于估算液体培养物中的微生物细胞密度29。已有多种研究采用 720–750 nm 波长范围测量蓝细菌的生长情况30,31,32。本实验方案使用 OD750 是因为 JSC-1 可产生吸收远红光的色素7。此外，叶绿素浓度也可用于测定蓝细菌的生长33。
  2. 将细胞培养物（OD750 ~0.8）转移至 1 L 锥形瓶中，用 B-HEPES 培养基稀释至 OD750 = 0.2，总体积为 500 mL。在与上述相同条件下（步骤 1.1）继续培养，直至进入对数生长后期（OD750 = 0.8–1.0），然后通过离心收集培养物。
  3. 在室温下以 10,000 x g 离心 20 分钟，并彻底弃去上清液。
    ​注意：细胞沉淀可在 -80 °C 下保存长达 6 个月。

2. 细胞裂解

  1. 用 0.75 M K-磷酸盐缓冲液（pH 7）重悬细胞沉淀，并洗涤两次。
    注意：配制 pH 7 的 0.75 M K-磷酸盐缓冲液时，需分别配制 1.5 M K2HPO4 和 1.5 M KH2PO4 溶液。取 615 mL 1.5 M K2HPO4 与 385 mL 1.5 M KH2PO4 混合，得到 pH 7 的 1.5 M K-磷酸盐缓冲液，再加入等体积的 ddH2O 稀释，即可得到 pH 7 的 0.75 M K-磷酸盐缓冲液。
  2. 将细胞转移至 50 mL 离心管中，在室温下以 10,000 x g 离心 20 分钟收集细胞沉淀。弃去上清液，用 0.75 M K-磷酸盐缓冲液重悬细胞。使用电子天平测定沉淀的湿重，并将每 1 g 湿重的细胞沉淀重悬于 5 mL 缓冲液中。
    注意：细胞沉淀的湿重通过称量装有细胞沉淀的离心管重量，减去空离心管的重量获得。
  3. 向一个 2 mL 螺口小瓶中加入 1 mL 细胞悬液和 0.4–0.6 g 0.1 mm 玻璃珠（参见材料表）。
  4. 使用珠磨仪（参见材料表）破碎细胞 30 秒。将小瓶置于室温水浴中冷却 2 分钟，重复破碎过程共 5 次。
  5. 裂解完成后，在室温下以 500 xg 离心 10 秒。用移液器收集上清液至 15 mL 离心管中。用 0.5 mL 0.75 M K-磷酸盐缓冲液洗涤玻璃珠一次，随后将洗涤液转移至同一离心管中。
  6. 向裂解后的细胞悬液中加入 Triton X-100（终浓度为 2% w/v），在摇床（40 rpm）上室温孵育，直至溶液变为均一状态（约 20 分钟）。
  7. 以 17,210 g 离心 20 分钟，去除完整细胞和大颗粒细胞碎片。将上清液（不含上层 Triton 胶束层）在室温下保存，最多可保存 1 小时。
    ​注意：上清液分为两层。上层为疏水性的 Triton X 层，含有结合叶绿素的蛋白质和疏水性的棒状藻胆体6；下层为水相层，含有水溶性藻胆体（PBS）。

3. 蔗糖梯度缓冲液的配制及PBS分离

  1. 在 pH 7 的 0.75 M K-磷酸盐缓冲液中配制四种浓度的蔗糖溶液（2.0 M、1.0 M、0.75 M 和 0.5 M）。
    注意：建议使用 pH 7 的 1.5 M K-磷酸盐缓冲液来配制蔗糖梯度，因为加入蔗糖会稀释 K-磷酸盐缓冲液的浓度。待蔗糖完全溶解后，加入 ddH2O 将缓冲液浓度调节至 0.75 M，pH 7。
  2. 将 2.8 mL 的 2.0 M 蔗糖缓冲液置于 40 mL 离心管底部，然后依次叠加三层蔗糖溶液（1.0 M 溶液 8 mL；0.75 M 溶液 12 mL；0.5 M 溶液 11 mL，适用于 40 mL 离心管），最后加入含 PBS 的上清组分（3.0 mL）（图 1A）。
    注意：添加蔗糖溶液时应小心操作，使溶液沿管壁缓慢滴加。加样时将移液器吸头保持在管内液面之上。若缓慢分层，可观察到清晰的蔗糖层。
  3. 将所得梯度在 25 °C 下以 125,800 × g 离心约 16–20 小时。注意：此步骤需使用超速离心机（见材料表）。
  4. 超速离心后，分层界面处可见 PBS 组分及藻胆蛋白浓缩形成的条带。在 Syn6803 中观察到蓝色条带（JSC-1 中显示为紫色条带）位于各层界面处（图 1D）。
  5. 用移液器从蔗糖梯度顶部缓慢收集各组分。使用膜式离心过滤装置（10 K 分子量截留，见材料表），通过反复浓缩（3,500 × g，20 分钟）并用 0.75 M K-磷酸盐缓冲液稀释的方法去除蔗糖。

4. 在77K条件下测量PBS的荧光

注意：使用配备液氮容器的荧光计（参见材料表）在 77K 下测量荧光光谱。

  1. 用0.75 M K-磷酸盐缓冲液稀释浓缩的PBS样品，获得至少500 µL的体积。
    注：根据公式 (OD615 0.474 x OD652)/5.34 [mg/mL]34 计算，样品中藻红蛋白的浓度约为4.2 µg mL-1。
  2. 取500 µL PBS样品加入透明玻璃管中，并将玻璃管置于液氮中冷冻至完全冻结。将冻结后的玻璃管转移至预先装满液氮的透明杜瓦瓶（见材料表）中。
    注：本实验方案中所用玻璃管的内径为3 mm。使用细玻璃管可最大限度减少样品对短波长发射光的再吸收。
  3. 选择550 nm和580 nm分别作为藻红蛋白和藻蓝蛋白的激发波长。
    ​注：荧光发射光谱记录范围为560–800 nm（550 nm激发）或600–800 nm（580 nm激发）。

5. PBS 的 SDS-PAGE 分析

  1. 使用膜式离心过滤装置（3K 分子量截留，参见材料表），将浓缩的 PBS 样品置换至含有 50 mM Tris 缓冲液（pH 8.0）的 0.75 M K-磷酸盐溶液中。
  2. 在微量离心管中，将 50 µL PBS 溶液与 10 µL 6x SDS 上样缓冲液 [300 mM Tris pH 6.8, 12% (w/v) 十二烷基硫酸钠, 0.06% (w/v) 溴酚蓝, 50% (v/v) 甘油, 6% (v/v) β-巯基乙醇]（参见材料表）混合，并在金属浴中 95 °C 孵育 10 分钟。
  3. 通过 SDS-PAGE（8%-20% (w/v) 聚丙烯酰胺凝胶）分离蛋白质样品，随后进行锌染色和考马斯亮蓝染色。详细步骤见参考文献8。
  4. 进行锌染色时，将凝胶在 50 mM ZnSO4 溶液中室温孵育 10 分钟，用蒸馏水洗涤凝胶，然后在紫外光（312 nm）照射下观察锌诱导的荧光。
  5. 进行考马斯亮蓝染色时，将凝胶置于考马斯亮蓝染色液 [0.25% (w/v) 考马斯亮蓝 R-250, 10% (v/v) 乙酸, 50% (v/v) 甲醇，参见材料表] 中，室温孵育 1 小时。用蒸馏水洗涤两次以去除残留染色液，然后将凝胶置于脱色液 [10% (v/v) 乙酸, 30% (v/v) 甲醇] 中，在摇床（40 rpm）上室温脱色过夜。使用数码相机或扫描仪观察完全脱色后的凝胶。

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结果

Syn6803 和 JSC-1 细胞在锥形瓶中于 B-HEPES 培养基中培养，30 °C 下在含 1% (v/v) CO2 的培养室中用 LED 白光（50 µmol 光子 m-2s-1）持续搅拌培养。在对数生长期（OD750 = ~0.5）时，将细胞传代至新鲜培养基中，终末光密度 OD750 = ~0.2。当细胞达到后期对数生长期（OD750 = 0.6–0.8）后，收集培养物并离心（室温下 10,000 × g 离心 20 分钟）。弃去上清液，细胞沉淀物储存于 -80 °C，直至进行下一步实验。

为了破碎细胞，首先将细胞在室温下解冻。使用0.1 mm玻璃珠在0.75 M K-磷酸盐缓冲液中通过珠击法裂解细胞。完全裂解后，在离心前可见上清液呈深蓝绿色（图1B）。加入Triton X-100溶解后，经离心去除不溶性膜组分和细胞碎片，将上清液加至40 mL离心管中的蔗糖梯度溶...

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讨论

本方案描述了一种从两种蓝细菌中分离完整藻胆体（PBS）的简单且标准的方法，这两种蓝细菌分别为单细胞模式菌株Syn6803 和丝状非模式菌株JSC-1。该方案的关键步骤包括细胞匀浆以及在蔗糖不连续密度梯度中进行超速离心。通常情况下，破坏丝状细胞比单细胞更复杂。增加起始材料用量（细胞沉淀的湿重）以及多次进行珠磨破碎，有助于提高从丝状蓝细菌细胞中提取PBS的得率。对于丝状蓝细菌JSC-1，所需使用的细胞量是单细胞蓝细菌Syn6803的三倍。此外，为了彻底破碎丝状蓝细菌，在提取缓冲液中观察到深蓝紫色之前，需要比单细胞蓝细菌进行更多次的珠磨处理。

不建议珠磨破碎的时间超过30秒，因为在每次珠磨过程中样品会发热。建议在每轮破碎之间将离心管置于实验台（或水浴中）于室温下冷却，因为完整的PBS在低温下容易解离25。因此，本方案中的所有操作均建议在室温下进行。许多研究文章描述了不同的细胞破碎方法，包括高压均质器（French-Press）或超声波破碎仪6,

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

作者感谢台湾大学生命科学学院技术共同服务中心提供超速离心机的便利使用。集胞藻 Synechocystis sp. PCC 6803 和细长聚球藻 Leptolyngbya sp. JSC-1 分别由台湾“中央研究院”朱修安博士和美国宾夕法尼亚州立大学 Donald A. Bryant 博士惠赠。本研究由台湾科技部（109-2636-B-002-013- 和 110-2628-B-002-065-）及台湾教育部玉山青年学者计划（109V1102 和 110V1102）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1 毫米玻璃珠BioSpec11079101用于 PBS 提取
13 毫升离心管Hitachi13PA超速离心
40 毫升离心管Hitachi40PA超速离心
乙酸Merck8.1875.2500用于考马斯亮蓝染色
B-HEPES 培养基由 BG-11 培养基改良而来的蓝细菌培养基
亮蓝 R-250SigmaB-0149用于考马斯亮蓝染色
溴酚蓝和光纯药工业2-291蛋白上样缓冲液
电子天平RadwagWLC 2/A2/C/2用于测定细胞沉淀的湿重
荧光分光光度计HitachiF-7000分光光度计
甘油BioShopGly001.500蛋白上样缓冲液
高速冷冻离心机HitachiCR22N用于缓冲液置换
Leptolyngbya sp. JSC-1由美国宾夕法尼亚州立大学 Donald A. Bryant 博士提供。
低温测量附件Hitachi5J0-0112该附件包含一个用于 77 K 荧光光谱分析的透明杜瓦瓶容器。
甲醇Merck1.07018,2511用于考马斯亮蓝染色
微量离心机Thermo FisherPico 21用于 PBS 提取
Mini-Beadbeater-16BioSpecModel 607用于 PBS 提取
磷酸氢二钾PanReac AppliChem121512.121用于 PBS 提取
磷酸二氢钾PanReac AppliChem141509.121用于 PBS 提取
螺口盖小瓶BioSpec10832用于 PBS 提取
SmartView Pro 成像仪Major ScienceUVCI-2300用于锌染信号检测
十二烷基硫酸钠ZymesetBSD101蛋白上样缓冲液
蔗糖ZymesetBSU101用于 PBS 分离
Synechocystis sp. PCC 6803由中国台湾中央研究院 Chu Hsiu-An 博士提供的耐葡萄糖菌株
TrisBioShopTRS 011.1蛋白上样缓冲液
吐温 X-100BioShopTRX 506.500用于 PBS 提取
Ultra 10 K 膜式离心滤器MilliporeUFC901024用于缓冲液置换
Ultra 3 K 膜式离心滤器MilliporeUFC500324用于缓冲液置换
超速离心机HitachiCP80WX超速离心
紫外/可见光分光光度计AgilentCary 60分光光度计
硫酸锌PanReac AppliChem131787.121用于锌染
β-巯基乙醇BioBasicMB0338蛋白上样缓冲液

参考文献

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蓝细菌中完整藻胆体的分离与表征
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