蓝细菌中完整藻胆体的分离与表征

摘要

本方案详细描述了通过不连续蔗糖密度梯度离心法从蓝细菌中分离藻胆体的方法。通过77K荧光发射光谱和SDS-PAGE分析确认完整藻胆体的组分。所得藻胆体组分适用于透射电子显微镜负染和质谱分析。

摘要

在蓝细菌中，藻胆体是一种重要的天线蛋白复合物，能够捕获光能并将能量传递给光系统I和II以进行光化学反应。研究藻胆体的结构与组成一直受到科学家的高度关注，因为它揭示了蓝细菌光合作用的进化与分化过程。本实验方案提供了一种经济、高效、使用珠磨破碎仪破碎蓝细菌细胞的详细且优化的方法。随后可通过蔗糖梯度超速离心从细胞裂解液中分离出完整的藻胆体。该方法已被证实适用于多种不同细胞类型的模式与非模式蓝细菌。本文还提供了一步一步的操作流程，通过77 K荧光光谱以及硫酸锌和考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE，验证藻胆蛋白的完整性与特性。分离得到的藻胆体还可用于进一步的结构与组成分析。总体而言，本方案提供了一个实用的入门指南，使不熟悉蓝细菌的研究人员也能快速分离和表征完整的藻胆体。

引言

藻胆体（PBS）是一种大型水溶性色素-蛋白质复合物，附着在蓝细菌类囊体膜光系统胞质侧¹。藻胆体主要由有色藻胆蛋白和无色连接蛋白组成^1,2。藻胆蛋白可分为四大类：藻红蛋白、藻红蓝蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白³。这四大类蛋白可吸收490–650 nm波长范围内的光能，该范围的光能被叶绿素吸收效率较低³。藻胆体可作为光捕获天线，收集光能并将其传递至光系统II和光系统I⁴。

PBS 的结构和组成因物种而异。在不同蓝细菌物种中，已发现三种形态的藻胆体（半盘状、束状和棒状）⁵。即使在同一物种中，PBS 的组成也会随着环境条件（如光质和营养耗竭）发生变化^6,7,8,9,10,

方案

集胞藻属（Synechocystis）sp. PCC 6803 是一种耐葡萄糖的模式菌株，由台湾中国科学院褚修安（Chu, Hsiu-An）博士提供。Leptolyngbya sp. JSC-1 是一种非模式丝状蓝藻，由美国宾夕法尼亚州立大学唐纳德·A·布莱恩特（Donald A. Bryant）博士提供。

1. 细胞培养与收获

1. 使用金属接种环将 Syn6803 或 JSC-1 细胞接种至含有 50 mL B-HEPES 培养基的 100 mL 锥形瓶中²⁸。在 30 °C、1% (v/v) CO₂ 条件下，以 50 µmol 光子 m^-2 s^-1（白光 LED）光照并用磁力搅拌器持续搅拌（120 rpm）培养细胞，直至培养物进入对数生长中期（OD₇₅₀ = 0.6–0.8）。
   注意：当培养物在 750 nm 处的光密度（OD₇₅₀）达到 0.6–0.8 时，转移至新锥形瓶进行收集。光密度通常用于估算液体培养物中的微生物细胞密度²⁹。已有多种研究采用 720–750 nm 波长范围测量蓝细菌的生长情况³⁰

结果

Syn6803 和 JSC-1 细胞在锥形瓶中于 B-HEPES 培养基中培养，30 °C 下在含 1% (v/v) CO₂ 的培养室中用 LED 白光（50 µmol 光子 m^-2s^-1）持续搅拌培养。在对数生长期（OD₇₅₀ = ~0.5）时，将细胞传代至新鲜培养基中，终末光密度 OD₇₅₀ = ~0.2。当细胞达到后期对数生长期（OD₇₅₀ = 0.6–0.8）后，收集培养物并离心（室温下 10,000 × g 离心 20 分钟）。弃去上清液，细胞沉淀物储存于 -80 °C，直至进行下一步实验。

为了破碎细胞，首先将细胞在室温下解冻。使用0.1 mm玻璃珠在0.75 M K-磷酸盐缓冲液中通过珠击法裂解细胞。完全裂解后，在离心前可见上清液呈深蓝绿色（图1B）。加入Triton X-100溶解后，经离心去除不溶性膜组分和细胞碎片，将上清液加至40 mL离心管中的蔗糖梯度溶.......

讨论

本方案描述了一种从两种蓝细菌中分离完整藻胆体（PBS）的简单且标准的方法，这两种蓝细菌分别为单细胞模式菌株Syn6803 和丝状非模式菌株JSC-1。该方案的关键步骤包括细胞匀浆以及在蔗糖不连续密度梯度中进行超速离心。通常情况下，破坏丝状细胞比单细胞更复杂。增加起始材料用量（细胞沉淀的湿重）以及多次进行珠磨破碎，有助于提高从丝状蓝细菌细胞中提取PBS的得率。对于丝状蓝细菌JSC-1，所需使用的细胞量是单细胞蓝细菌Syn6803的三倍。此外，为了彻底破碎丝状蓝细菌，在提取缓冲液中观察到深蓝紫色之前，需要比单细胞蓝细菌进行更多次的珠磨处理。

不建议珠磨破碎的时间超过30秒，因为在每次珠磨过程中样品会发热。建议在每轮破碎之间将离心管置于实验台（或水浴中）于室温下冷却，因为完整的PBS在低温下容易解离²⁵。因此，本方案中的所有操作均建议在室温下进行。许多研究文章描述了不同的细胞破碎方法，包括高压均质器（French-Press）或超声波破碎仪^6,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 毫米玻璃珠	BioSpec	11079101	用于 PBS 提取
13 毫升离心管	Hitachi	13PA	超速离心
40 毫升离心管	Hitachi	40PA	超速离心
乙酸	Merck	8.1875.2500	用于考马斯亮蓝染色
B-HEPES 培养基			由 BG-11 培养基改良而来的蓝细菌培养基
亮蓝 R-250	Sigma	B-0149	用于考马斯亮蓝染色
溴酚蓝	和光纯药工业	2-291	蛋白上样缓冲液
电子天平	Radwag	WLC 2/A2/C/2	用于测定细胞沉淀的湿重
荧光分光光度计	Hitachi	F-7000	分光光度计
甘油	BioShop	Gly001.500	蛋白上样缓冲液
高速冷冻离心机	Hitachi	CR22N	用于缓冲液置换
Leptolyngbya sp. JSC-1			由美国宾夕法尼亚州立大学 Donald A. Bryant 博士提供。
低温测量附件	Hitachi	5J0-0112	该附件包含一个用于 77 K 荧光光谱分析的透明杜瓦瓶容器。
甲醇	Merck	1.07018,2511	用于考马斯亮蓝染色
微量离心机	Thermo Fisher	Pico 21	用于 PBS 提取
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	用于 PBS 提取
磷酸氢二钾	PanReac AppliChem	121512.121	用于 PBS 提取
磷酸二氢钾	PanReac AppliChem	141509.121	用于 PBS 提取
螺口盖小瓶	BioSpec	10832	用于 PBS 提取
SmartView Pro 成像仪	Major Science	UVCI-2300	用于锌染信号检测
十二烷基硫酸钠	Zymeset	BSD101	蛋白上样缓冲液
蔗糖	Zymeset	BSU101	用于 PBS 分离
Synechocystis sp. PCC 6803			由中国台湾中央研究院 Chu Hsiu-An 博士提供的耐葡萄糖菌株
Tris	BioShop	TRS 011.1	蛋白上样缓冲液
吐温 X-100	BioShop	TRX 506.500	用于 PBS 提取
Ultra 10 K 膜式离心滤器	Millipore	UFC901024	用于缓冲液置换
Ultra 3 K 膜式离心滤器	Millipore	UFC500324	用于缓冲液置换
超速离心机	Hitachi	CP80WX	超速离心
紫外/可见光分光光度计	Agilent	Cary 60	分光光度计
硫酸锌	PanReac AppliChem	131787.121	用于锌染
β-巯基乙醇	BioBasic	MB0338	蛋白上样缓冲液