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Xenopus laevis 蝌蚪脊髓横断

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DOI：

10.3791/63276

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2021年12月10日

 , 
1Center for Aging and Regeneration, Facultad de Ciencias Biológicas, P. Universidad Católica de Chile

本文内容

摘要

Xenopus laevis 蝌蚪脊髓横断是一种研究脊髓损伤与再生的相关损伤方法，通过在胸段水平进行横向切割，完全切断脊髓。

摘要

脊髓损伤（SCI）是一种永久性疾患，会影响中枢神经系统（CNS）的运动和感觉神经，导致损伤部位以下出现瘫痪。迄今为止，尚无能够实现SCI功能恢复的治疗方法，且对于SCI后发生的多种复杂动态事件仍缺乏清晰认识。许多非哺乳类生物在严重脊髓损伤后具有再生能力，例如辐鳍鱼类、有尾两栖类以及无尾两栖类的幼体阶段，包括Xenopus laevis蝌蚪。这些生物是研究SCI应答反应及成功再生机制的可靠模式生物。此类研究有助于识别可用于SCI治疗干预的潜在靶点。本文介绍了如何开展Xenopus laevis蝌蚪脊髓横断实验，内容涵盖饲养管理、手术操作、术后护理以及功能测试评估。该损伤方法可用于解析脊髓再生的不同阶段，通过研究SCI后及脊髓再生过程中的细胞、分子、遗传机制，以及组织学和功能演变过程。

引言

脊髓损伤（SCI）是一种每年在全球影响约25万至50万人的疾病1。除了高发病率外，脊髓损伤还会影响感觉和运动神经，导致损伤部位以下出现瘫痪，并使某些内脏器官与中枢神经系统（CNS）的控制发生中断。脊髓作为中枢神经系统的一部分，无法再生；由于该疾病的复杂性以及对所有相关过程尚未完全理解，目前仍缺乏能够实现功能恢复的有效疗法。

非哺乳动物生物，例如硬骨鱼类、有尾两栖类以及无尾两栖类的幼体阶段，在严重脊髓损伤（SCI）后能够再生脊髓，是研究成功再生过程调控机制以及理解哺乳动物再生能力失败的优秀模式生物2,3,4。这一理解具有重要意义，可能为开发脊髓损伤的新治疗靶点和潜在疗法提供原创性见解。

无尾目蛙类， 非洲爪蟾 是研究脊髓损伤（SCI）的优良模式生物。该生物在蝌蚪阶段具有极强的再生能力，而在变态过程中这种再生能力逐渐丧失，从而允许研究者在具有再生能力与丧失再生能力的不同阶段开展实验。3,5. 研究脊髓损伤（SCI）的已确立损伤方法 非洲爪蟾 蝌蚪的尾部截除包括完全移除整个尾部，涉及肌肉、脊索和脊髓等组织6该方法对于理解再生过程的普遍机制起到了重要作用4,7,8,9,10.

由于尾部截除涉及除脊髓外的多种组织，这与人类脊髓损伤（SCI）后的情况不同，因此需要一种更相关的损伤模型来研究SCI。我们参考了以往的研究11，以建立对损伤模型的全面描述5,12,13,14，以及用于研究SCI的多种方法12,13,14,15,16,17,18。在脊髓横断后，可分离脊髓的尾端部分，用于RNA和蛋白质表达分析及高通量检测14,19,20,21。此外，在脊髓横断前后，通过腹腔内注射药物和小分子，或对cDNA、RNA或吗啉寡核苷酸进行电穿孔，可研究这些分子在预防或治疗SCI，以及在SCI后特定事件和脊髓再生过程中的作用13,14。进一步地，可在损伤后的不同时间点，利用生物化学、分子生物学、组织学和功能学方法，研究损伤进展和再生过程12,13,14,17,19,20,21,22,23。

最后，上述所有技术均可用于非再生阶段，突显了使用Xenopus laevis作为研究脊髓损伤（SCI）模型生物的最重要优势之一，即能够在同一物种内对再生与非再生机制进行比较研究13,19,20,21,22。本文介绍了一种Xenopus laevis蝌蚪脊髓横断的实验方案，首先对具有再生能力的Nieuwkoop和Faber（NF）50期蝌蚪进行分期与筛选，随后描述了脊髓手术操作流程，以制备假手术组和脊髓横断组动物，术后护理，以及最终通过测量蝌蚪自由游泳距离来评估功能恢复情况。

方案

本方案提供了成功实施脊髓横断所需的全部信息。需要注意的是，其他文献中已发表有这些技术的详细方案14，可作为本文所述方案的补充。所有动物实验程序均已获得智利天主教大学生物科学学院生物伦理与生物安全委员会的批准。

1. 青蛙的自然交配

  1. 在交配前3至5天，对雄性和雌性青蛙皮下注射50单位的人绒毛膜促性腺激素（hCG）。使用"铁爪"技术固定青蛙；由于青蛙体表湿滑，必要时可用网具将其包围。将26 G × ½"针头的尖端插入侧线后方，在皮肤与肌肉之间向背侧推进至约1 cm深度。
  2. 在交配前，向雄性注射300单位、雌性注射700单位的hCG。
  3. 为促进交配，先将0.1x Barth溶液在4 °C预冷15分钟以模拟春季条件，随后立即将雄蛙和雌蛙放入2 L该溶液中，并在18 °C下过夜培养。
  4. 16小时后，使用剪去尖端的塑料巴斯德吸管小心收集胚胎，并将其转移至直径10 cm的培养皿中。通过将胚胎与25 mL含2%半胱氨酸的蒸馏水溶液（pH 7.8；确保液体完全覆盖胚胎）轻度振荡孵育5分钟，去除胚胎的胶状外膜。随后用蒸馏水洗涤3次，再用0.1x Barth溶液（8.9 mM NaCl；102 µM KCl；238.1 µM NaHCO3；1 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）；81.14 µM MgSO4；33.88 µM Ca(NO3)2；40.81 µM CaCl2，pH 7.6）洗涤3次。
  5. 挑选具有棕褐色外观且卵裂球对称分裂的健康胚胎。将胚胎置于直径10 cm的培养皿中，每皿加入50 mL 0.1x Barth溶液，胚胎密度不超过每皿100个。

2. 饲养管理

  1. 在第一周内，将胚胎置于18 °C条件下培养，直至其脱离卵黄囊。在此期间，每天更换一次Barth溶液，并移除呈白色死亡状态的胚胎，以及出现明显解剖结构异常或无任何游泳活动的蝌蚪。
  2. 第一周后，将蝌蚪转移至塑料水箱中的无氯水中，饲养密度为每升水体10只动物。在20–21 °C、12小时光照/12小时黑暗的循环条件下培养蝌蚪，每个水箱配备充氧石以增氧，每天投喂一次，每只动物0.5 mg饲料。每周更换一次水，并每日检查是否有废物积聚或死亡个体24。

3. 分期

  1. 受精后三至四周，将动物置于培养皿中，逐一检查前肢和后肢的形态与外观。如有必要，可将动物放入含有50 mL含0.02%甲磺酸三卡因的0.1×Barth溶液的培养皿中进行麻醉，以便更好地操作。麻醉时间不超过2分钟，随后将动物转移至0.1×Barth溶液中，使其从麻醉状态恢复。
  2. 观察50期动物的以下解剖学特征25：前肢刚刚出现，呈球形（图1）；后肢外凸且呈球形（图1).
    注意：可使用发育阶段为49至51的动物进行本实验（图1）；有关发育阶段的更多信息，请参阅 Nieuwkoop 和 Faber 的《正常发育表》 非洲爪蟾25.

4. 手术：脊髓横断与假手术动物

  1. 将50期蝌蚪置于含有50 mL 0.02%甲磺酸三卡因和0.1x Barth溶液的培养皿中，麻醉2分钟。
  2. 借助汤匙和镊子，将蝌蚪背侧朝上放置于玻璃培养皿上半部分湿润的纱布上。
  3. 使用显微解剖弹簧剪在胸部中段水平切开皮肤和背侧肌肉（图2A，B）。
    1. 对于对照假手术动物，确保切口大小仅为约0.2 mm（图2C）；不得损伤脊髓（图2D，D´）。
    2. 对于横断动物，再进行一个约0.2 mm的切口（图2C），以完全横断脊髓（图2E，E´）。

5. 术后护理

  1. 手术后，将蝌蚪转移至含有 0.5 L 0.1x Barth 溶液（添加 1x 青霉素-链霉素）的水箱中，每箱饲养 10–12 只蝌蚪。切断组与对照假手术组动物应分别饲养在不同水箱中。
    注意：蝌蚪将在数分钟内从麻醉状态恢复。
  2. 在 20–21 °C 温度条件下，对蝌蚪进行持续通气培养。
  3. 每隔一天更换一次含抗生素的 Barth 溶液，直至实验结束。
  4. 手术后一天开始每日喂食一次。
  5. 及时清除死亡个体。

6. 游动实验

  1. 获取一个内部带有LED照明的盒子，盒子表面覆盖一层透明的聚苯乙烯板，允许光线透过。
  2. 在LED盒子上方安装一台相机。
  3. 将一个直径为15 cm的培养皿放置在盒子上，皿中加入100 mL的0.1× Barth溶液。
  4. 在横断手术后第1天，将一只蝌蚪放入培养皿中，并静置5分钟以适应环境。
  5. 适应结束后，使用指定软件（见材料表）对自由游动行为进行5分钟的视频追踪。
  6. 视频记录完成后，将蝌蚪转移回其饲养缸中。
  7. 分别在横断手术后第5、10、15和20天重复进行视频追踪（图3）。

7. 生物伦理学考量

注意：假手术组和横断组动物的死亡率分别为13%和30%。此外，每组至少需要15至20只动物才能进行统计分析。因此，建议从23只假手术动物和26只横断手术动物开始实验。

  1. 使用0.02%的三卡因甲磺酸盐对动物进行2分钟麻醉，以确保在手术前降低神经元和运动活动以及疼痛感。
  2. 手术后，观察动物是否从麻醉中恢复。此外，每天喂食并检查动物状况。
  3. 完成游泳实验后，使用过量的三卡因甲磺酸盐（用30 mM碳酸氢钠溶液配制的1%三卡因甲磺酸盐）处死动物。

结果

本方案描述了在Xenopus laevis中研究脊髓再生的方法。通过检测特定药理学处理的影响以及特定基因表达在脊髓再生中的作用，可评估其对游泳功能恢复的效果。通过绘制损伤后不同时间点的总游泳距离，可比较对照组与处理组动物在特定时间点或特定时间段内的差异。运动功能随时间的恢复情况如图3所示，展示了横断损伤后5、10、15和20天的游泳距离。损伤后5天，动物在5分钟内平均游泳距离为0.7 m，表明游泳能力下降。随着天数增加，游泳能力逐渐提高，损伤后10天和15天的平均游泳距离分别为2.1 m/5 min和3.1 m/5 min；至损伤后20天，游泳能力完全恢复，平均达到5.7 m/5 min。

前肢和后肢发育阶段 49-51，显微镜图像中的肢体生长分析。
图 1：爪蟾蝌蚪的发育分期。 阶段 49-51 的代表性图像，显示前肢和后肢，用于动物分期参考。比例尺 = 2 mm。每个图像右下角显示方框区域的放大图，比例尺 = 1 mm。在阶段 49，前肢尚未出现，而后肢刚开始出现，呈球形。阶段 50 的前肢刚开始出现，呈球形，后肢则突出，亦呈球形。阶段 51 的前肢呈突出的球形，而后肢则呈突出的伸长形。虚线轮廓标示前肢和后肢。请点击此处查看该图的高清版本。

神经元细胞模式图；假手术组与横断组织分析的显微镜图像。
图 2：脊髓横断。（A）代表性图像显示动物在手术过程中正确的放置位置，背侧朝上。比例尺 = 2 mm。（B）A 的放大图显示损伤的位置和范围。红色十字标记表示损伤部位在脊髓胸段的精确位置，虚线表示损伤范围。比例尺 = 1 mm。（C）代表性图像显示脊髓胸段的侧面观。假手术切口和横断的延伸范围被标出。虚线界定脊髓的边界。比例尺 = 1 mm。（D）代表性图像显示假手术动物，其脊髓保持完整。比例尺 = 1 mm。（E）代表性图像显示脊髓被中断的横断动物。比例尺 = 1 mm。每个图像右下角显示方框区域的放大图（D´ 和 E´）。比例尺 = 1 mm。缩写：S = 假手术切口；T = 横断。请点击此处查看该图的放大版本。

运动分析；距离随时间变化的图示；显示随时间推移运动增加；包含图表和示意图。
图3：截断后随时间推移的游泳功能恢复情况。 代表性散点图显示了在截断后第5、10、15和20天，每只截断处理动物在5分钟内游过的距离。上方展示了游泳轨迹的样本。数据来自10只蝌蚪，以均值±标准误（SEM）表示。缩写：dpT = 截断后天数；SEM = 均值标准误。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本文所述方案是进行脊髓损伤（SCI）并评估功能恢复的优良方法。为了保证实验可重复性，必须培养健康的蝌蚪，并选择体型相近的个体。喂养不当会导致营养压力，从而降低再生能力26；因此，应特别注意蝌蚪的喂食。蝌蚪在3-4周后达到50期，此时可提高培养温度以加速生长，18-25 °C为最佳范围27。水质至关重要，因为动物对水环境和化学物质敏感。理想的水质条件包括使用活性炭过滤、无氯的水，其参数如下：pH值（6.5–7.5）、氯化物（<0.02 mg/L）、电导率（1.0 mS/cm ± 0.1 单位）、铜（<0.3 mg/L）；碳酸盐硬度（KH：5–10 dKH）；总硬度（GH：6–16 dGH）；硝酸盐（NO3：<20 mg/L）；以及亚硝酸盐（NO2：<0.1 mg/L）14,27,28。此外，为避免污染，塑料饲养箱应在饲养期间每周清洁一次，手术后则应每隔一天彻底清洗一次，使用无氯水和海绵擦洗即可，严禁使用洗涤剂。

为了提高手术后的存活率，蝌蚪不得长时间暴露于麻醉剂中（不超过2分钟）。此外，建议一次仅麻醉一只蝌蚪。由于动物需要保持湿润，手术前后应始终将其浸没在溶液中，并在开始手术前用勺子将溶液轻轻浇在蝌蚪体表。确保损伤范围足以覆盖整个脊髓，但又不能过大，以免导致功能恢复不良或死亡。如果脊索受到损伤，动物身体将发生弯曲，影响功能恢复。若损伤范围超出脊索，死亡概率将增加14。在游泳行为检测过程中，若软件能用蓝色阴影正确识别每只动物，则视为有效记录；否则应重复记录。记录过程中应避免任何移动、气流或光线变化，以防止记录错误。

关于脊髓损伤与再生的细胞和分子机制，目前仍有许多未解的问题。本研究中描述的方案可用于研究不同细胞事件、基因表达及治疗手段对功能恢复的贡献，功能恢复通过检测游泳能力来评估。此外，还可对接受手术的动物应用许多其他技术。可分离脊髓组织以提取蛋白质和/或 mRNA14，用于研究损伤和治疗后的蛋白质与基因表达谱19,20。该手术也已被用于研究脊髓损伤后脊髓的细胞反应22以及神经干细胞前体细胞的行为12,13,22。参与脊髓再生的信号通路也已通过本文所述的脊髓损伤模型得以研究23。总之，本文所描述的方案是研究脊髓损伤与再生的优良模型，已被广泛应用于多项研究，为该领域现有知识的积累作出了重要贡献。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由以下科研基金资助：PG Slater：FONDECYT N° 3190820；J. Larraín：FONDECYT N° 1180429，CARE Chile UC-衰老与再生研究中心（PFB 12/2007）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
空气泵Regent CALMRC-006用于氧气扩散器石块的功能
ANY-maze 软件Stoelting游泳行为测试
Ca(NO3)2·4H2OSigma-Aldrich237124
CaCl2·2H2OSigma-Aldrich223506
相机Stoelting60528游泳行为测试
计算机游泳行为测试（最低推荐配置：PC，Windows 7，Intel Core i3，2 GB RAM，10 GB硬盘）
1个可用USB端口，1,366 × 768 监测器
半胱氨酸Sigma-AldrichC7352
解剖体视显微镜NikonSMZ745T手术 / 分期
玻璃培养皿100 × 20 mm
HEPESGibco11344-041
人绒毛膜促性腺激素它可以在药店以不同剂型找到
KClMerck Millipore104936
LED光源箱定制木箱：55 厘米长，34 厘米宽，9 厘米高，LED 灯，透明聚苯乙烯板
MgSO₄4·7H2OMerck Millipore105886
用于横断的显微解剖剪Fine Science Tools15003-08手术用弹簧剪
MS-222Sigma-AldrichE10521麻醉剂；三卡因甲磺酸盐
NaClMerck Millipore106404
NaHCO₃3Sigma-AldrichS6014
Nasco 品牌幼体爪蟾脆性饲料NascoSB09480(LM)MX非洲爪蟾蝌蚪的喂食阶段  44 至 60
氧气扩散器石PentairAA1动物的维持与饲养
镊子Fine Science Tools杜蒙特 n° 5号手术镊用于手术
青霉素Sigma-AldrichP7794
pH计
塑料巴斯德吸管Sigma-AldrichZ331740交配后收集胚胎的方法
塑料培养皿Sigma-AldrichP5981150 x 15 毫米
带盖塑料箱/盒4.5升容量；20厘米 × 17 cm × 15 cm 或类似尺寸
无菌纱布
链霉素Sigma-AldrichS1277
汤匙
Xenopus laevis
特化品系和品系		国家爪蟾资源中心
欧洲爪蟾资源中心
非洲爪蟾研究资源中心		http://www.mbl.edu/xenopus
https://xenopusresource.org/
https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx
非洲爪蟾 野生型非洲爪蟾 1
爪蟾表达		https://xenopus1.com
http://www.xenopus.com

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