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维持实验室培养的双斑蟋蟀（Gryllus bimaculatus），一种适用于昆虫养殖与无脊椎动物生理学研究的多功能直翅目模式生物

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DOI：

10.3791/63277

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2022年6月8日

 ,  , 
1Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 2Global Health Institute, University of Wisconsin-Madison

本文内容

摘要

本文概述了标准化可食用蟋蟀Gryllus bimaculatus实验室种群长期饲养过程中若干重要影响因素的基本方法，这些因素包括种群密度、饲料供应、水源以及环境控制。

摘要

Gryllus bimaculatus （德·盖尔） 是一种体型较大的蟋蟀，分布于非洲和南欧亚大陆，在其原生范围内常被野外采集作为人类食物。在其原生范围之外，人工养殖 G. bimaculatus 因其食性可塑性强、繁殖周期短、无需滞育、耐高密度饲养以及对病原体具有较强抗性，因此是可行的。 G. bimaculatus 可以 研究昆虫生理学、行为学、胚胎学或遗传学的多功能模型。

饲养密度、笼内庇护物、光周期、温度、相对湿度和饮食等环境参数均会影响蟋蟀的生长、行为和基因表达，因此应予以标准化。在日益增多的可食用昆虫养殖研究文献中，这些蟋蟀常被用于评估来源于农作物残余物、食品加工副产物及其他低成本废弃物的候选饲料添加剂。

为了支持评估饲料基质变化对双斑蟋（G. bimaculatus）生长表现和营养品质影响的持续实验，本文建立并展示了一套完整的实验室标准操作规程，涵盖繁殖、饲养管理、操作、测量及安乐死等环节。工业标准的蟋蟀饲料已被证实营养充分，适用于长期维持蟋蟀种群繁殖，也可作为实验对照饲料。在平均温度27 °C、光周期为12小时光照（L）/12小时黑暗（D）的条件下，将蟋蟀以0.005只/cm3的密度饲养于29.3 L聚乙烯网盖饲养箱中，并以湿润椰糠同时作为水分来源和产卵基质，已成功维持蟋蟀健康生长达两年之久。在受控实验中，按照本方法饲养的蟋蟀从投放（22天龄）至收获（65天龄）期间，存活率达89%，性成熟率达68.2%，收获时平均体重为0.724 g ± 0.190 g。

引言

如果以标志性的昆虫为例，那就是果蝇 黑腹果蝇， 利用昆虫作为实验室模式生物在遗传学、毒理学和生理学研究中具有显著优势1昆虫体型较小，可减少培养所需空间以及饲料和耗材的用量。许多昆虫 快速繁殖，使其特别适用于创建特定遗传品系以及需要评估多个连续世代的研究。

许多研究集中于完全变态且具有蛹期的全变态昆虫，例如Drosophila。然而，也存在其他研究模型，包括Gryllus bimaculatus（De Geer） （即双斑蟋蟀）。G. bimaculatus属于半变态昆虫，在达到性成熟前会经历7至11个若虫龄期2。该蟋蟀表现出多种与性选择相关的行为，包括鸣叫、领域展示和护偶行为3。与全变态昆虫的幼虫不同，这种蟋蟀的未成熟个体与许多半变态昆虫的若虫类似，能够在蜕皮过程中再生丢失或受损的附肢4。此外，G. bimaculatus的全基因组序列已于2021年完成测序并发表5。这些特性使该蟋蟀成为基础研究中极具吸引力的研究对象。

双斑蟋蟀被广泛用于人类食品和动物饲料的养殖。这些养殖规模通常远大于实验室研究的规模6,7。尽管规模不同，研究人员面临的挑战与商业蟋蟀养殖户所遇到的问题在很大程度上存在重叠。这些因素在以提高可食用昆虫生产效率为目标的实验室研究中汇聚在一起。随着可食用昆虫产业不断发展和壮大，优化饲料投入以及生产的众多其他方面成为主要目标8。实验室研究若能证明在蟋蟀养殖效率、存活率或世代时间等方面取得可量化的改善，将有望长期提升蟋蟀养殖业务的盈利能力。

标准化的饲养方案有助于更深入地比较不同研究中关于饲养优化的结果。迄今为止，公开发表的关于实验室饲养G. bimaculatus的详细方案仍较少。理想的饲养方案应能反映实际蟋蟀养殖操作中的条件，同时保持严格的受控环境，以准确测量实验处理引起的生长表现变化，并突出风险缓解策略。本文所述方法基于已发表的多种蟋蟀物种饲养方案、技术及设备，涵盖从实验室到商业化生产的不同规模2,9,10,11,12。此外，本方案还参考了若干非同行评审的资料来源，包括未发表的技术简报以及与北美商业蟋蟀养殖户的个人交流。本方案的制定旨在促进建立用于昆虫农业相关试验的G. bimaculatus实验室种群。

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方案

1. 准备产卵基质

注意：G. bimaculatus 的产卵基质首选椰糠。有关如何从压缩椰糠砖中分离椰糠的详细方法及呼吸安全注意事项，请参见补充材料步骤1.1。

  1. 用肥皂和水洗手。
  2. 将洁净的容器置于天平上归零，称取约一个拳头大小的干燥椰糠质量。
  3. 将椰糠放入可密封的洁净容器中，容器需能容纳最多为原始体积6倍的膨胀空间。
  4. 用干净的手轻轻将从大块中取出的椰糠团块掰散。
  5. 使用50 mL量筒，量取适量的去离子水，使水与干椰糠的质量比为5:1。
  6. 缓慢加入已量取的去离子水，均匀润湿所有椰糠颗粒。手动碾碎结块，确保润湿均匀。
  7. 重新校准先前称量椰糠所用容器的皮重。
  8. 称取75 g湿润的椰糠。
  9. 使用干净的塑料勺将75 g湿润的椰糠转移至一个100 mm × 15 mm的培养皿中，确保椰糠均匀铺满皿底，无结块。
  10. 用实验室胶带在培养皿侧面标记，注明卵的来源群体及卵采集日期。
  11. 用量筒量取额外的45 mL去离子水。
  12. 在培养皿中，将水均匀地加至压实的椰糠表面，以确保充分且均匀地润湿。确保椰糠完全饱和，直至水分积聚形成约 ¼ 容器侧壁的上方路径。
  13. 将培养皿装填完毕后，将剩余的湿润椰糠密封于密闭容器中，并在 -20 ℃ 下储存。 °C.
    注意：按照本文所述方法操作， G. bimaculatus 个体在产卵后平均58天达到性成熟。
  14. 收集卵
    1. 将湿润的产卵基质放入装有目标亲代蟋蟀种群的饲养笼中，位置应尽可能远离饲料，以避免蟋蟀机械性地将饲料颗粒带至产卵基质上。
    2. 记录日期和时间。
      注意：按照本方法饲养的繁殖型蟋蟀种群，其标准化工作密度为 n = 150 只成虫。在此密度下，24 小时产卵期内可获得 800 至 1,500 枚卵，具体数量取决于种群年龄、前期产卵情况以及亲本饲养笼中的性别比例。
    3. 在工作台面上放置一个小型可高压灭菌的垃圾桶，以应对处理和清洁富含卵的产卵基质时可能产生的 containment 风险。
    4. 将一个洁净的空29.3 L塑料笼置于工作台面，紧邻垃圾桶旁，用作富含卵的产卵基质的接收笼。
    5. 将装有亲代蟋蟀种群和产卵基质的29.3 L饲养笼放置在垃圾容器与空笼相对的另一侧。
    6. 24小时后，将产卵基质从亲代蟋蟀饲养笼中取出，并置于可高压灭菌的废液容器上方。
    7. 检查产卵基质表面，查看是否有蟋蟀踢到椰糠表面的粪便颗粒或饲料残渣。
      注意：任何非卵块或椰糠的物质都可能导致孵化期间基质上产生霉菌。
    8. 使用干净的刮勺或塑料勺将椰糠中的污染物移至废液容器中。
    9. 将塑料勺放入废物容器中。
    10. 将清洁后的产卵基质放入洁净的29.3 L笼中。
    11. 将笼子放入设定为 27 °C 的培养箱中 °在12小时黑暗/12小时光照的光周期下，于60%相对湿度条件下，温度为C。
    12. 将装有繁殖种群的饲养笼放回原始位置，并清理工作台面上的所有物品。
    13. 将废弃物容器放入机构内专用于存放可能被蟋蟀卵污染的物品的冷冻柜中。
    14. 用10%的次氯酸钠溶液对工作台面进行消毒，并静置60秒。
    15. 用干净的纸巾将工作台面擦干。打开冷冻柜，将纸巾丢入废物容器中。
  15. 每日喷雾加湿并监测卵基质
    注意：有关校准喷雾瓶喷雾量体积的方法，请参见 补充材料 步骤 1.2.
    1. 将喷雾瓶置于产卵基质上方，使喷出的水分均匀分布在基质表面。
    2. 执行计算所得的泵送次数 补充材料 每天对每种产卵基质重复步骤1.2，连续进行11天。
    3. 每天检查每个产卵基质，观察椰糠表面是否有丝状霉菌生长。
    4. 若观察到真菌生长，使用洁净的勺子或刮勺清除表面霉斑。
    5. 将工具和移除的椰糠丢弃至存放在设施冷冻柜中的可高压灭菌废物容器中。
      注：尚不清楚霉菌是否对蟋蟀的发育产生不利影响。
    6. 在产卵后第11天，开始密切观察基质中是否有若虫出现。
      注意：在 27 °C 条件下 °C，卵的 G. bimaculatus 需要11-13天孵化。
  16. 建立原代饲养笼
    1. 选取两个未使用过的 30.8 cm x 30.8 cm（12 英寸 x 12 英寸）商用鸡蛋托盘平片。使用美工刀或强力剪刀将其切割成六个独立的 10.1 cm（4"宽度相等的条状。用手刷去切边，以去除松动的纸板碎屑。
    2. 将六块尺寸为10.1厘米×30.8厘米（4英寸×12英寸）的纸板垂直竖立放置于笼底，纸板的长边方向与29.3升笼具较窄的水平方向平行。再将第七块纸板平放在上述六块竖立纸板的顶部。
    3. 选取三块约25 cm × 25 cm的粗糙棕色纸巾。将每块对折。取其中两块覆盖在纸盒结构近端顶部，另一块覆盖在纸盒堆叠的远端上方。
    4. 在产卵后第11天，将产卵基质移至笼子右前方靠近角落的位置。
  17. 照顾早期若虫
    注意：卵产出后第14天，大多数有活力的卵已完成孵化，早期若虫需要提供饲料和水分。幼龄蟋蟀无法突破水滴的表面张力，若环境中积水可能导致溺亡；但同时它们对干燥亦十分敏感。在此发育阶段，维持约60%的相对湿度对确保若虫存活至关重要。
    1. 当观察到孵化时，将步骤1.4.3中放置在纸箱顶部的纸巾喷水，直至湿润但不滴水。
    2. 用70%乙醇彻底擦拭100 mm培养皿盖的两面，并使其干燥。将其用作盛放蟋蟀饲料的容器。
      注意：一龄若虫所需的饲料颗粒应比后续发育阶段的若虫更小。这种细颗粒饲料应在若虫孵化后的前20天内提供。
    3. 将50 g饲料倒入60瓦的单份搅拌机中，以10,000 rpm研磨1分钟。
    4. 称取1 g饲料，振荡使其落入笼内培养皿盖上。使用勺子或刮刀的洁净端，将饲料尽可能均匀地铺展在皿底。
    5. 每2天更换一次饲料。移除食盘前，用勺子末端将蟋蟀从食盘中轻轻刷落。将废弃饲料丢弃至可高压灭菌的废弃物容器中。
    6. 监测饲料是否长霉。若饲料开始呈现白色或绿色，应立即丢弃培养皿及饲料。
    7. 在产卵后14天，使用2.54 cm（1英寸）的画笔，将培养皿中黏附在原生椰糠基质上的蟋蟀刷下，从椰糠表面及培养皿侧壁将所有蟋蟀刷入饲养笼中。
    8. 将移除的产卵基质放入可高压灭菌的废物容器中，并在高压灭菌前储存于冰箱冷冻。
    9. 按照步骤 1.1.5–1.1.9 的方法制备新的椰糠培养皿，用于补充水分，并替换原有的基质。
    10. 使用去离子水洗瓶加水，直至椰糠表面有光泽但不积水。
      ​注意：蟋蟀密度对生长表现具有显著影响 G. bimaculatus13. 将繁殖种群维持在过高的密度下，可能导致其后代在实验中出现非预期的拥挤诱导表观遗传效应9. 蟋蟀必须被 "稀释" 从卵基质中孵化出的高密度若虫，分装至符合0.005只蟋蟀/cm³标准的饲养密度3 空间。

2. 三龄若虫至成虫的饲养管理

  1. 设置饲养笼
    注意：有关制作筛网盖的技术细节，请参见补充材料步骤1.3.1。
    1. 重复步骤1.4.1。
    2. 将五块切好的蛋盒碎片安装在笼子远端，使蛋形凹面朝外。确保短边靠近笼子两侧，长边平放在底部，每块蛋盒碎片之间相距约3 cm。
    3. 将最后一块切好的蛋盒碎片盖在直立的蛋盒碎片上方，如同房屋的屋顶，如补充图S1所示。
    4. 按照步骤1.1.8–1.1.13准备保湿基质。
    5. 将保湿基质放置在蟋蟀饲养笼的近端右角，如补充图S2所示。
    6. 使用洗瓶加入6–10 mL去离子水，直至椰壳纤维表面湿润且有反光，但椰壳纤维未完全浸没。
      注意：表面应呈现轻微凹陷，水的表面张力使其沿椰壳纤维轮廓分布。
    7. 将一个100 mm培养皿的盖子倒置，放置在笼子近端左侧。加入2–3 g标准蟋蟀饲料，如补充图S2所示。
  2. 调整种群密度
    注意：此步骤应在孵化后20天或蟋蟀平均体重达到0.01 g时进行。
    1. 在工作台面上放置一个大容器，其面积足以容纳三个并排站立的29.3 L饲养笼的底面布局。
      注意：此为二级 containment，用于控制在种群转移过程中逃逸的蟋蟀。
    2. 将原始种群从饲养架上取下，放置在工作台面上。
    3. 在原始种群的右侧放置一个相同尺寸的空笼。
    4. 在空笼的右侧放置一个已按步骤2.1.1–2.1.7设置好的笼子。
    5. 检查确认蟋蟀未附着在装有蟋蟀的笼子筛网盖的底面。如发现附着，轻敲笼顶使其脱落。
    6. 打开装有蟋蟀的笼子的筛网盖。
    7. 以一次轻柔、平稳的动作，将“屋顶”蛋盒及其表面附着的所有蟋蟀整体转移至中间的笼子中。
    8. 待蛋盒进入中间笼子后，轻轻晃动纸板使其与笼壁碰撞，使所有蟋蟀脱落。
    9. 目视检查确认所有蟋蟀均已脱落，然后将该蛋盒碎片放回原笼近端一侧，以便剩余蟋蟀重新附着。
    10. 按从前到后的顺序，依次对原笼中所有蛋盒碎片重复步骤2.2.8–2.2.9，直至所有蟋蟀均转移至中间笼中。
    11. 轻轻倾斜装有蟋蟀的中间笼，使所有蟋蟀滑向底部角落。
    12. 将装有蟋蟀的笼子提起，移至受体笼上方。
    13. 缓慢倾斜供体笼，使蟋蟀逐渐攀附于笼壁，并从底部角落的群体中以可控方式爬出，如补充图S3所示。
    14. 若蟋蟀移动过快，调整中间笼的倾斜角度，使其回落。
    15. 在笼子倾斜状态下，使用2.54 cm（1英寸）毛刷引导蟋蟀进入受体笼，逐个计数，直至总数达到150只。使用毛刷阻止移动过快的个体，以确保计数准确。
    16. 在新装填的蟋蟀笼上标注日期、亲本种群及所含蟋蟀数量。
    17. 通过将整个容器置于-20 °C冰箱中至少30分钟，人道处死仍留在中间笼和原始容器底部的多余蟋蟀。
    18. 检查原始笼，确保所有蟋蟀均已转移。
    19. 将蟋蟀笼放置在植物生长架上，位于全光谱荧光灯罩下方25 cm处，灯罩连接家用级户外定时器，设定为12小时光照/12小时黑暗的光周期。参见补充图S4。
    20. 将原始笼中残留的所有粪便、用过的保湿基质和饲料碟、纸巾、蜕皮及死蟋蟀转移至可高压灭菌的废物容器中。
    21. 若废物不立即进行高压灭菌，应储存在设施内的-20 °C冰箱中。
    22. 检查地面、工作人员服装、二级 containment 笼及工作台面，查找逃逸的蟋蟀。
    23. 使用10%次氯酸钠溶液对工作台面和二级 containment 笼进行消毒，并将纸巾丢入可高压灭菌的废物容器中。
  3. 喂食与供水
    1. 打开密封的饲料储存容器，用一个空的100 mL样品杯取满蟋蟀饲料。将杯中饲料的四分之一倒入饲养笼内的培养皿盖中供饲料使用。
    2. 为蟋蟀供水时，按照步骤1.1.9–1.1.13准备一个含椰壳纤维的培养皿。
    3. 根据消耗速率相应增加饲料供给量，以确保饲料自由取食（ad libitum）。
      注意：蟋蟀饲料需求随发育阶段而变化。
  4. 将蟋蟀转移至清洁笼中
    1. 每两周将蟋蟀转移至清洁的笼中一次。复制步骤2.2.1–2.2.4中的笼子排列方式。
      注意：大量粪便已积聚在蛋盒的凹陷处。
    2. 按照步骤2.2.5–2.2.23将蟋蟀转移至清洁笼中。
    3. 轻柔移动蛋盒，使大部分粪便落入原始笼中，同时在重复步骤2.2.7–2.2.10时允许蟋蟀继续附着于蛋盒上。
    4. 使用毛刷或塑料勺引导被困在粪便中的蟋蟀从中间笼移至清洁笼中。
    5. 检查原始笼，确保所有蟋蟀均已转移。
    6. 将原始笼中残留的所有粪便、用过的保湿基质和饲料碟、纸巾、蜕皮及死蟋蟀转移至可高压灭菌的废物容器中。
    7. 若废物不立即进行高压灭菌，应储存在设施内的-20 °C冰箱中。
    8. 检查地面、工作人员服装、二级 containment 笼及工作台面，查找逃逸的蟋蟀。
    9. 使用10%次氯酸钠溶液对工作台面和二级 containment 笼进行消毒，并将纸巾丢入可高压灭菌的废物容器中。
  5. 设置实验笼
    注意：实验笼为塑料容器，所容纳的蟋蟀数量较少。其设置方式与容纳繁殖种群的29.3 L笼相同，但使用7.1 L容器，配备较小的水盘、饲料盘，并减少蛋盒的表面积。
    1. 在每个实验笼的远端放置六块10.1 cm × 15.4 cm（4英寸 × 6英寸）的蛋盒碎片，使蛋盒的长轴横跨笼子窄边的宽度，短轴朝向笼盖和笼底。
    2. 将10 g湿润的椰壳纤维工作混合物压入一个培养皿中。
    3. 使用装有去离子水的洗瓶加入约15 mL去离子水，或直至椰壳纤维表面形成弯月面。
    4. 将一个60 mm × 15 mm培养皿的盖子倒置，用于盛放饲料。
      注意：实验期间饲料供给速率可能变化。有关实验笼蟋蟀的随机化与装填程序，请参见补充材料步骤1.4。
  6. 终止昆虫
    1. 当蟋蟀不再用于繁殖或实验时，执行步骤2.2.17。
    2. 确认蟋蟀死亡后，从冰箱中取出笼子，打开盖子，将其中所有材料转移至可高压灭菌的废物容器中，并将废物重新放回冰箱，直至进行高压灭菌。
    3. 将空笼浸入10%次氯酸钠溶液中，静置至少5分钟。
    4. 用冷水对空笼进行三次冲洗，彻底去除残留的次氯酸钠，特别注意容器底部的沟槽部分。

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结果

2021年9月进行的一项饲喂试验中，收集了从孵化到65日龄成功饲养蟋蟀的数据。蟋蟀从卵开始饲养，遵循本方案中步骤1.1.1至2.6.1的操作，随后按照上述步骤2.7，将六个重复的饲养笼中各放入24只随机选取的22日龄（三龄若虫）蟋蟀。之后，蟋蟀在室温条件下饲养；但由于设施的空气处理单元出现故障，饲养环境的平均室温为25 ± 1 °C、相对湿度20%，而非建议的27 °C。在孵化后22至65天期间，每周两次测量蟋蟀的质量。本实验的结果如下所述，以均值±标准差表示。

数据如图所示 图1 和 图2 代表本方案所述标准饲料的六个重复笼。蟋蟀来自平均质量为21的种群 ± 9 毫克。实验结束时，所有合并的若虫和成虫蟋蟀的平均质量为 0.724 克 ± 0.190 g（图1）。随着 G. bimaculatus 具有性二型性，因此我们按性别报告了成体质量。收获时...

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讨论

这种蟋蟀饲养方法的简便性可惠及多个研究领域，并为成功的蟋蟀养殖提供了一个通用模板，能够轻松适应各种实验需求。与此前关于G. bimaculatus的多项研究相比，本方法中成虫个体体型较小，成熟速度较慢14，我们认为这是由于实际条件限制导致饲养温度未达最佳所致。上述方法已在两年时间内持续使用并不断优化。在此期间，种群保持健康稳定，未出现商业蟋蟀养殖中偶见的问题，例如因病原体感染导致的大规模死亡（如家蟋蟀Acheta domesticus因浓核病毒引起体内液化等典型临床症状）或严重的同类相食现象15。在种群建立后未再引入外来个体，这很可能显著降低了疾病传播的风险。

防止过度拥挤对于确保蟋蟀健康至关重要。野生 G. bimaculatus 为独居性，雄性通过攻击性展示和打斗来保卫领地16成功的圈养管理需要将种群密度控制在适当范围内，以减少攻击性行为和整体应激反应

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本项目得到了威斯康星大学麦迪逊分校校内资助的支持。衷心感谢 Bachhuber 咨询公司（Bachhuber Consulting Inc.）的 Kevin Bachhuber 提供其未发表的商业蟋蟀养殖指南的使用权限，同时感谢 Michael Bartlett Smith 在优化和排查这些方法中的问题时所提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
31-qt（29.3 L）带扣盖储物箱（含盖）HOMZ3430CLBL用于饲养繁殖种群
3层12托盘植物补光灯架Fischer ScientificNC1938548
50加仑（189.27 L）带盖周转箱Sterilite#14796603处理蟋蟀时用作二级防护容器
50 mL 聚丙烯量筒Fischer ScientificS95171
7.5-夸脱（7.1 L）带扣盖储物箱（含盖）HOMZ3410CLBL用于饲养实验品系
Accuris 500 g × 0.01 g 天平由 Benchmark Scientific 旗下子公司 Accuris 生产W3300-500通过威斯康星大学系统采购服务从 Dot Scientific 购买 "ShopUW+"
Ace Premier 1 英寸平头芯片刷Ace Hardware #1803261
Bel-Art SP Scienceware 去离子水冲洗瓶Fischer Scientific03-421-160 
明亮的铝制窗纱 PhiferUNSPSC# 11162108网孔尺寸 18 x 16"
透明一次性塑料分装杯 5.5 盎司，带盖沃尔玛N/A
去离子水
Diablo 4-4/8" x 13 TPI 超细光洁度双金属曲线锯片家得宝#313114935
蛋托填充板 - 纸质，12 x 12"UlineS-5189
Fisherbrand 100 x 15 mm 带透明盖培养皿Fischer ScientificFB0875714
Fisherbrand 培养皿（透明盖）60 × 15 mmFischer ScientificFB0875713A
Georgia-Pacific Envision 棕色纸巾家得宝#205675843
Infinity Tough Guy 高性能热熔胶棒Infinity BondInfinity IM-Tough-Guy-12
Mazuri 蟋蟀饲料Land O' Lakes 国际组织货号#  3002219-105
Stanley TimeIt Twin 2插口接地机械式24小时定时器沃尔玛N/A
佛蒙特有机物回收土壤 11磅椰壳砖家得宝#300679904

参考文献

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