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方法文章

利用自发荧光成像评估细胞代谢

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DOI：

10.3791/63282

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2021年11月15日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University-College Station

本文内容

摘要

本方案描述了内源性代谢辅酶还原型烟酰胺腺嘌呤（磷酸）二核苷酸（NAD(P)H）以及氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的荧光成像与分析。对NAD(P)H和FAD进行自发荧光成像，可提供一种无需标记、非破坏性的细胞代谢评估方法。

摘要

细胞代谢是细胞产生能量的过程，许多疾病（包括癌症）都表现为代谢异常。还原型烟酰胺腺嘌呤（磷酸）二核苷酸（NAD(P)H）和氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）是代谢反应中的辅酶。NAD(P)H 和 FAD 具有自发荧光特性，可通过激发和发射波长进行光谱分离。这两种辅酶 NAD(P)H 和 FAD 均可处于游离状态或与蛋白质结合状态，每种状态均具有独特的荧光寿命——即荧光团保持在激发态的时间。荧光寿命成像（FLIM）可对 NAD(P)H 和 FAD 的荧光强度和荧光寿命进行定量，从而实现对细胞代谢的无标记分析。通过选择合适的激发和发射波长，可优化荧光强度和荧光寿命显微镜，用于 NAD(P)H 和 FAD 的成像。使用氰化物诱导代谢扰动，可验证自发荧光成像方案检测细胞内代谢变化的能力。本文将演示利用 NAD(P)H 和 FAD 的自发荧光成像技术来测量细胞代谢的方法。

引言

代谢是细胞产生能量的过程。细胞代谢包含多种通路，包括糖酵解、氧化磷酸化和谷氨酰胺分解。健康细胞利用这些代谢通路产生能量，以支持增殖和功能活动，例如免疫细胞产生细胞因子。许多疾病，包括代谢紊乱、癌症和神经退行性疾病，其特征是细胞代谢发生改变1。例如，某些类型的癌细胞即使在有氧条件下也表现出升高的糖酵解速率，以生成用于合成核酸、蛋白质和脂质的分子2,3。这种现象被称为瓦博格效应（Warburg effect），是多种癌症类型的标志性特征，包括乳腺癌、肺癌和胶质母细胞瘤4。由于癌症进展过程中伴随细胞代谢的改变，细胞代谢可作为药物反应的替代生物标志物5,6。此外，理解药物在细胞水平上的疗效至关重要，因为细胞异质性可能导致个体间对药物的反应不同7,8。

用于鉴定和量化细胞代谢变化的技术对于癌症研究和药物反应研究至关重要。化学分析和蛋白质分析可用于评估细胞或组织的代谢情况，但缺乏单细胞分辨率和空间信息。基于代谢板式读数仪的检测方法能够随时间测量样品中的pH值和氧气消耗，并进一步评估化学物质引起的代谢扰动。pH值可用于计算细胞外酸化率（ECAR），从而反映细胞的糖酵解活性9。全身成像方法包括氟-18标记的氟代脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描（FDG PET）和磁共振波谱分析（MRS），这些无创成像技术在临床上通过代谢测量用于识别肿瘤复发和评估药物疗效10,11,12,13,14。

FDG-PET 通过显像放射性标记的葡萄糖类似物 FDG 在组织中的摄取情况。肿瘤对 FDG-PET 的摄取高于周围组织，这是由于瓦伯格效应12,13。MRS 可对代谢过程中常见分子核素（如 13C 和 31P）进行成像，并能够获取代谢在刺激（如运动或进食）作用下动态变化的信息14。尽管 FDG-PET 和 MRS 可用于临床，但这些技术的空间分辨率不足以解析肿瘤内部的异质性。同样，耗氧量的测量也是针对细胞群体整体进行的。自发荧光成像克服了这些技术在空间分辨率上的局限，提供了一种无创定量细胞代谢的方法。

线粒体中的三羧酸循环示意图，显示NADH的生成、ATP合成以及电子传递。
图1：常见代谢途径中的NADH和FAD。 NADH和FAD是参与糖酵解、三羧酸循环和电子传递链的辅酶。对这些分子进行自发荧光成像可提供有关细胞代谢的信息。 请点击此处查看该图的放大版本。

还原型烟酰胺腺嘌呤（磷酸）二核苷酸（NAD(P)H）和氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）是多种代谢反应的辅酶，包括糖酵解、氧化磷酸化和谷氨酰胺分解（图1）。NAD(P)H 和 FAD 均具有自发荧光特性，可为荧光成像提供内源性对比度1,15。NADPH 的荧光特性与 NADH 相似，因此在研究中常将 NAD(P)H 用于代表 NADH 与 NADPH 的总和信号2,16。

荧光寿命成像（FLIM）用于量化荧光寿命，即荧光分子处于激发态的时间。荧光寿命对荧光分子所处的微环境具有响应性，可提供有关细胞代谢的信息17。NAD(P)H 和 FAD 在细胞内可处于与蛋白质结合或游离的构象，每种构象具有不同的荧光寿命。游离态 NAD(P)H 的荧光寿命比结合态 NAD(P)H 更短；相反，游离态 FAD 的荧光寿命比结合态 FAD 更长18,19。荧光寿命及其寿命组分权重可通过荧光寿命衰减数据，利用公式（1）进行量化20：

I(t) = α1e-t/τ1 + α2e-t/τ2 + C （1）

公式（1）表示归一化荧光强度随时间的变化关系。该方程中的 α1 和 α2 分别代表短寿命和长寿命的组分比例（α1 + α2 = 1），τ1 和 τ2 分别代表短寿命和长寿命，C 用于校正背景光7,20。此处表示为 τm 的振幅加权寿命，由公式（2）计算得出。

τm= α1τ1+ α2τ2  (2)

通过将“t”对荧光团的强度衰减进行平均，可计算出平均寿命，对于双指数衰减，该过程由公式（3)17,21.

τ*m = (α1τ12 + α2τ22) / (α1τ1 + α2τ2)  （3）

通过积分荧光寿命衰减，可以从寿命图像计算出荧光强度图像。自发荧光成像是无损且无需标记的方法，可用于在亚细胞分辨率下表征活细胞的代谢状态。光学氧化还原比提供了一种细胞化学氧化还原状态的光学类比度量指标，其计算方式为NAD(P)H与FAD强度的比值。尽管目前尚未建立统一的光学氧化还原比计算公式22,23,24,25，本文将其定义为FAD强度与NAD(P)H和FAD总强度之比。采用此定义的原因在于，分母中的总强度可使该指标归一化至0到1之间，且预期氰化物抑制的结果表现为氧化还原比降低。游离态NAD(P)H和FAD的荧光寿命可反映代谢微环境中溶剂性质的变化，包括pH、温度、与氧气的接近程度以及渗透压17。

NAD(P)H 和 FAD 结合组分的荧光寿命变化可指示代谢通路的利用情况及底物特异性的代谢状态26。通过辅酶游离态与结合态组分权重的变化，可进一步解读其代谢动态18,19。总体而言，这些定量的自发荧光寿命指标可用于细胞代谢分析，自发荧光成像已被用于区分肿瘤组织与正常组织27,28、干细胞的表征29,30、免疫细胞功能的评估31,32,33,34,35、神经活动的监测36,37,38，以及乳腺癌和头颈部癌等癌症类型中药物疗效的评价21,39,40,41,42。高分辨率自发荧光成像可结合图像分割技术，实现单细胞分析及细胞群体内异质性的量化43,44,45,46,47。

NAD(P)H 和 FAD 可在配置为强度或寿命成像的单光子或多光子荧光显微镜上进行成像。对于单光子显微镜，由于这些波长下有常见的激光光源，NAD(P)H 和 FAD 通常分别在 375–405 nm 和 488 nm 波长处激发48。在双光子荧光激发中，NAD(P)H 和 FAD 的激发波长分别约为 700 至 750 nm 和 700 至 900 nm15,49。荧光团被激发后，NAD(P)H 和 FAD 分别在约 410 nm 至 490 nm 和约 510 nm 至 640 nm 波长范围内发射光子15。NAD(P)H 和 FAD 的最大发射波长分别约为 450 nm 和 535 nm48。

由于两种代谢辅酶的激发和发射波长不同，其荧光信号可在光谱上相互分离。了解NAD(P)H和FAD的光谱特性对于自发荧光成像方案的设计与优化至关重要。氰化物是电子传递链（ETC）复合体IV的抑制剂。氰化物对细胞代谢以及细胞内NAD(P)H和FAD的自发荧光强度与荧光寿命的影响已有充分研究27,40。因此，氰化物扰动实验是验证NAD(P)H和FAD成像方案有效性的一种有效手段。成功的氰化物实验可证明该NAD(P)H和FAD成像方案可用于评估未知分组或干预条件下的细胞代谢状态。

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方案

1. 用于成像的细胞接种

  1. 吸出一个含有80-90%融合度MCF-7细胞的T-75培养瓶中的培养基，用10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，并加入2 mL 0.25%胰蛋白酶（1×）以使细胞从培养瓶底部脱落。
  2. 将培养瓶在37 °C下孵育约4分钟，在显微镜下观察细胞以确认其已脱落。
  3. 立即加入8 mL培养基以中和胰蛋白酶活性。
  4. 将细胞收集至锥形离心管（15 mL或50 mL）中，使用血细胞计数板对细胞进行计数。
  5. 以200 × g 离心5分钟。
  6. 离心后，吸去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL培养基中，并将4 × 105个细胞接种至35 mm玻璃底成像培养皿（或所用显微镜适配的相应样品载具）中。
  7. 向成像培养皿中加入2 mL培养基以维持细胞代谢。
  8. 在成像前，将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育24–48小时，以使细胞贴壁并进入对数生长期。
    ​注：细胞的生长阶段依据前期对该细胞系的经验，并通过细胞产品说明书确认。

2. NAD(P)H 和 FAD 的多光子荧光寿命成像（FLIM）

  1. 开启多光子荧光寿命显微镜的所有组件，包括显微镜、激光光源以及所使用的探测器。
  2. 样本放置
    1. 打开明场光源，确保光线进入目镜。选择一个物镜，通常用于细胞成像的为 20x、40x 或 100x 物镜。在物镜顶部滴加一滴适当的浸没介质 [若使用干式物镜则跳过此步]。
    2. 将物镜下调，正确放置样本，避免物镜接触样本。将玻璃底培养皿置于显微镜载物台的样品架上，确保样本固定牢固，在成像过程中不会移动。
    3. 使用 X-Y 载物台控制将样本在物镜下居中。完成后，通过目镜观察，并将物镜上调以对细胞进行聚焦。
    4. 若显微镜位于封闭箱体内，请关闭光箱门。打开图像采集软件，点击 多光子成像 选项卡，并设置以下多光子成像参数：图像尺寸 = 256 × 256 像素；像素驻留时间 = 4–25 µs；总图像采集时间 ≈ 60 秒；单光子计数模式下的优化探测器增益 = 85%（具体取决于所用系统）。
  3. 仪器响应函数（IRF）与荧光寿命标准品成像
    1. 将尿素晶体置于玻璃底培养皿上，并用胶带或封口膜固定皿盖。
      注：尿素晶体在室温下可稳定数月。
    2. 对尿素晶体进行成像。
      1. 将装有尿素的培养皿置于显微镜载物台上，对准尿素晶体进行聚焦。
      2. 将激发激光波长设置为 900 nm。
      3. 使用可捕获 450 nm 波长的发射滤光片。
      4. 在样品处激光功率 <1 mW 的条件下，使用步骤 2.2.4 中推荐的成像参数获取尿素晶体的荧光寿命图像。
    3. 对黄色-绿色（YG）荧光微珠进行成像，作为荧光寿命标准品。
      1. 通过将 YG 微珠溶液用无菌水稀释 1:1,000 制备 YG 微珠载玻片。取少量体积（约 30 µL）滴加至载玻片或玻璃底培养皿上，加盖盖玻片，并用透明指甲油密封盖玻片边缘。
      2. 将 YG 微珠载玻片置于显微镜载物台上，确保盖玻片一侧朝向物镜。
      3. 将激发激光波长设置为 890 nm。
      4. 使用可捕获约 500–600 nm 波长的发射滤光片。
      5. 在样品处激光功率 <1 mW 的条件下，使用推荐的成像参数 [步骤 2.2.4] 获取 YG 微珠的荧光寿命图像。
      6. 使用尿素的 IRF 检查微珠的寿命。若寿命不接近 2.1 ns，需检查是否存在以下情况：微珠与其他微珠接触导致荧光猝灭、微珠溶液已干燥、微珠失焦、IRF 不准确，或 IRF 与荧光衰减之间的偏移未优化 [参见步骤 4.2.4]。
        注：约 2.1 ns 的寿命随时间保持稳定。
  4. NAD(P)H 成像
    1. 将装有细胞的玻璃底培养皿置于显微镜载物台上，并对细胞进行聚焦。
      注：建议将细胞置于环境培养箱中，以在图像采集期间维持温度、湿度和 CO2 水平，因为这些参数可能影响细胞代谢。
    2. 将探测器增益调整至 FLIM 的最佳值。此外，调整至所需的驻留时间——该参数表示激光在样本每个像素上停留的时间。
      注：这些参数在整个后续操作中应保持不变，以确保激光照射和探测器设置的一致性，从而保证基于强度的测量结果的有效性，此类测量依赖于激光功率、扫描参数和探测器增益。在单光子计数模式下运行探测器时存在一个优化的探测器增益值；本系统参考值为 85%。
    3. 将多光子激光器设置为 750 nm。初始时确保激光功率控制设为零，以避免在打开激光快门时损伤细胞。
      注：推荐使用 750 nm 激发 NAD(P)H，尽管其在 700–750 nm 范围内具有宽吸收带。推荐使用 890 nm 激发 FAD，尽管其在 700–900 nm 范围内具有宽吸收带。
    4. 设置或选择发射滤光片，以收集约 400–500 nm 的发射波长。
    5. 以 聚焦 或 实时预览 模式开始成像，以优化图像设置。
      注：激光现已运行。此时切勿打开显微镜封闭箱体。请佩戴适当的个人防护装备。
    6. 缓慢将样品处的激光功率增加至约 3–8 mW，同时确保细胞保持在焦平面上。调整完成后，记录所用的最大功率，并在其他培养皿区域进行 NAD(P)H 成像时使用相同的功率设置。
      注：重要的是在样品处或分光窗口处测量激光功率，而不要依赖于普克尔斯盒电压，因为普克尔斯盒并不稳定。通常在成像过程中通过分光窗口监测激光功率，而非在样品处。通过在物镜处使用第二个功率计，可建立分光窗口处功率与样品处功率之间的关系，从而根据分光窗口测量值估算样品处的近似功率。
    7. 采集一张图像积分时间为 60 秒的 NAD(P)H FLIM 图像。
    8. 检查图像在荧光寿命衰减曲线中是否具有足够的光子数（细胞质像素峰值约 100 个光子）。若光子数过低，则增加激光功率或图像采集时长。
      注：荧光指数衰减曲线中最小光子峰值数取决于系统参数，包括时间分辨率、IRF 和背景噪声。
  5. FAD 成像
    1. 将多光子激光器设置为 890 nm，并等待其在新波长下实现锁模。初始时确保激光功率控制设为零，以避免在打开激光快门时损伤细胞。
      注：执行此步骤时切勿移动载物台或物镜焦距。FAD 的视野（FOV）应与 NAD(P)H 的 FOV 完全一致。
    2. 设置或选择发射滤光片，以收集约 500–600 nm 的发射波长。
    3. 以 聚焦 或 实时预览 模式开始成像，以优化图像设置。
      注：激光现已运行。此时切勿打开显微镜封闭箱体。
    4. 缓慢将样品处的激光功率增加至约 5–10 mW，并记录所用的最大功率。在其他培养皿区域进行 FAD 成像时使用此功率设置。
    5. 采集一张图像积分时间为 60 秒的 FAD FLIM 图像。
    6. 检查图像在荧光寿命衰减曲线中是否具有足够的光子数（细胞质像素峰值约 100 个光子）。若光子数过低，则增加激光功率或图像采集时长。
      注：荧光指数衰减曲线中最小光子峰值数取决于系统参数，包括时间分辨率、IRF 和背景噪声。
  6. 在额外的四至五个视野（FOV）中重复步骤 2.4–2.5。确保每个图像位置与其他成像区域至少相隔 2 个 FOV。

3. 氰化物实验准备

  1. 将130.24 mg氰化钠溶解于25 mL PBS中，配制80 mM（20倍浓度）的氰化钠溶液。
    注意：氰化物具有毒性。请佩戴适当的个人防护装备。
  2. 从培养皿中吸出100 µL培养基，并加入100 µL氰化钠溶液，使培养皿中氰化物的终浓度为4 mM。
  3. 将细胞置于培养箱中孵育5分钟，使细胞与氰化钠溶液充分反应。
  4. 重复步骤2.4–2.6，获取氰化物处理后细胞的NAD(P)H和FAD图像。
    注意：长时间暴露于氰化物会导致细胞死亡。加氰化物后需在30分钟内完成处理后的图像采集。

4. FLIM 图像分析

  1. 打开FLIM寿命分析软件。
    1. 打开尿素图像以获取测得的红外图像响应函数。
    2. 导入尿素图像。选择一个 图像上的点 用于图像分析的尿素晶体。增加 空间箱值 将多个像素的 FLIM 数据整合为 1 或更高值 衰减峰 > 100 个光子 通过改变 Bin 位于主软件界面上的变量。
    3. 将数据保存为 IRF.
      1. 在引用的软件中，单击标题为的下拉菜单 IRF，选择 从衰变数据复制. 此后，单击 复制到剪贴板 用于实验过程中所拍摄图像的图像分析。
  2. NAD(P)H和FAD寿命成像的图像分析
    1. 将图像文件导入荧光寿命分析软件。
    2. 通过调整亮度和对比度（如有需要），改善图像可视化效果，以便观察细胞和亚细胞结构。
      1. 点击 选项 下拉菜单并选择 强度此处，根据需要调整强度和对比度，然后单击 好的.
    3. 从尿素图像导入IRF。
      1. 点击 IRF 下拉菜单并选择 粘贴自剪贴板.
    4. 设置 多指数衰减 参数50.
      1. 为细胞质像素的衰减评估设置阈值。
        注意：此处使用了50作为阈值。该值通过比较若干代表性背景和细胞核像素的荧光峰值与若干细胞质像素的峰值确定，选择介于细胞核像素和细胞质像素峰值之间的值作为阈值。
    5. 检查位移值是否使仪器响应函数（IRF）相对于荧光上升沿对齐。如有需要，调整位移值至使卡方值最小的数值。
    6. 增大空间像素范围，使细胞质像素的荧光峰值达到或超过100。
      注意：增大空间二值化范围将导致空间分辨率降低。
    7. 计算图像中所有像素的荧光寿命。
      1. 在参考程序中，单击 计算 下拉菜单 衰变矩阵.
        注意：成功的结果以按荧光寿命加权振幅伪彩成像的图像表示。
    8. 保存荧光寿命数据。
      1. 点击 文件 下拉菜单 导出. 选择所需的分析参数并单击 好的保存图像。
      2. 选择 颜色 按钮从 选项 下拉菜单以调整显示的荧光寿命参数， 颜色配置 至 蓝-绿-红，并设置特定的颜色条最小值和最大值，以调整荧光寿命图像的颜色标度。

光学光谱学；使用光谱仪装置进行光子发射光谱分析的图像和图表。
图2：尿素晶体测得的仪器响应函数（IRF）。（A）从尿素获得的强度图像。选择一个代表性像素以生成仪器响应函数衰减曲线（B），用于后续细胞荧光寿命图像的分析。缩写：IRF = 仪器响应函数。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 细胞分割
    注意：此处描述的实验方案使用了一款图像分析软件51。代表性MCF-7图像及数据分析代码已提供52。
    1. 下载 MCF7_Segmentation_Final.cpproj 文件52。
    2. 通过点击 文件 | 导入 | 从文件导入流程，导入 MCF7_Segmentation 流程，选择文件 MCF7_Segmentation_Final.cpproj。
    3. 点击 图像 模块，并添加待分割的 NAD(P)H 强度图像。
      注意：图像必须为 .tif、.png 或 .jpg 格式。
    4. 点击左下角的 分析图像 按钮。
      注意：对于在不同系统上获取的图像，该流程可能需要优化。如遇问题，请尝试以下子步骤：
      1. 使用 测试 模式测试不同参数：点击 启动测试模式，然后点击各模块名称旁的 播放 按钮逐个运行模块。
      2. 点击第一个 IdentifyPrimaryObjects 模块，调整 对象典型直径（像素单位，最小值、最大值），使其与细胞直径相匹配。
        注意：对于 MCF-7 细胞，最小值和最大值分别设置为 10 和 40 像素。
      3. 点击 EnhanceOrSuppressFeatures 模块，调整 特征尺寸，以改善所选 特征类型 的识别效果。
        注意：MCF-7 细胞的特征尺寸设置为 10 像素。
      4. 点击第二个 EnhanceOrSuppressFeatures 模块，调整 孔洞尺寸范围，以优化细胞核区域的增强效果。
        注意：MCF-7 细胞使用的范围为 5–20。
      5. 点击第二个 IdentifyPrimaryObjects 模块，调整参数（阈值策略、阈值方法、阈值平滑尺度 和 阈值校正因子），以优化细胞核的识别。点击每个参数旁的 ? 以确定最佳设置，并将其应用于 IdentifySecondaryObjects 模块。
      6. 点击 FilterObjects 模块，调整面积形状。选择待识别区域形状的最小和最大像素值。
        ​注意：对于 MCF-7 细胞，最大值和最小值分别设置为 500 和 100。通过识别细胞核并扩展至细胞边界实现细胞分割的过程，已在 Walsh 和 Skala 的研究中详细阐述47。
    5. 利用细胞质掩膜，对图像中每个细胞的荧光寿命输出变量进行平均。

细胞图像分割分析；荧光显微镜；细胞核与细胞质识别。
图3：单个细胞的识别与分割。通过整合荧光寿命图像获得的MCF7细胞NAD(P)H强度图像（A），使用750 nm激发光、5 mW功率照射60 s进行成像。x轴和y轴表示图像的像素位置。（A）识别出单个细胞。（B）对细胞进行掩膜处理，以消除数据集中的背景噪声。（C）随后识别细胞核，并将其投射到细胞掩膜上（D）。（E）然后对细胞进行过滤，以去除不符合典型细胞大小的掩膜区域。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

5. 替代方法：荧光强度成像

  1. 开启实验过程中将使用的设备。
    注意：荧光强度图像可使用宽场荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜或多光子显微镜获取。
    1. 确保所用显微镜具备适用于NAD(P)H的合适激发光源（单光子波长 ~370-405 nm；双光子波长 ~700-750 nm）以及适用于FAD的激发光源（单光子波长 ~488 nm；双光子波长 ~890 nm）。
    2. 确保显微镜配备用于分离NAD(P)H发射光的滤光片（~400-500 nm）。
      注意：4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）设置通常适用于NAD(P)H。
    3. 确保显微镜配备用于分离FAD发射光的滤光片（~500-600 nm）。
      注意：绿色荧光蛋白（GFP）设置通常适用于FAD。
  2. 准备显微镜。
    1. 打开明场光源，确保光线进入目镜。如有需要，在相应物镜顶部滴加一滴合适的浸油介质。
    2. 将物镜下调，以正确放置样品并避免干扰。将培养皿正确放置于载物台上，确保样本固定牢固，在成像过程中不会移动。
      注意：建议将细胞置于环境培养箱中，以在图像采集期间维持温度、湿度和CO2水平，因为这些参数可能影响细胞代谢。
    3. 使用物镜对样本进行居中。完成后，通过目镜观察，并移动物镜直至细胞清晰对焦。
  3. 开始强度成像。
    1. 打开成像软件，点击图像采集软件中的采集标签，设置激发和发射参数以捕获NAD(P)H信号，并将NAD(P)H的激发和发射滤光片置于显微镜转盘中。
      注意：NAD(P)H成像使用了357/44激发滤光片、409长通二向色镜和447/60发射滤光片。
    2. 优化激发光照强度和探测器参数。若存在光漂白问题，可降低光照强度并增加图像积分时间。
      注意：NAD(P)H信号较弱；若使用过高功率，需注意光漂白现象。
    3. 采集所需尺寸的NAD(P)H图像，并确保图像已保存。
    4. 设置激发和发射参数以捕获FAD信号，并优化激发光照和探测器参数。
      注意：FAD成像使用了458/64激发滤光片、495长通二向色镜和550/88发射滤光片。
    5. 采集FAD图像，并确保图像已保存。
      注意：在整个成像实验过程中，NAD(P)H和FAD图像的采集参数（光照强度、图像尺寸、探测器增益）应保持一致。
    6. 在另外五个位置重复上述过程，各位置之间至少间隔2个视场。
  4. 图像层面的氧化还原比数据分析
    1. 在图像处理程序中打开NAD(P)H和FAD强度图像。
    2. 对NAD(P)H图像设置阈值，保留细胞质像素，并将背景和细胞核像素设为0。
    3. 通过在每个像素上计算公式 FAD/(NAD(P)H+FAD) 来生成氧化还原比图像，使用已设阈值的NAD(P)H图像。
    4. 计算非零像素的平均值。
      注意：这些步骤可在图像分析软件中完成，也可通过脚本直接编程实现。
  5. 细胞层面的氧化还原比分析
    1. 按照步骤4.3.1-4.3.5，获得每张NAD(P)H图像中细胞的掩膜图像。
    2. 通过在每个像素上计算公式 FAD/(NAD(P)H+FAD) 生成氧化还原比图像。
    3. 利用细胞质掩膜，对图像中每个细胞的所有像素的氧化还原比值进行平均。

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结果

乳腺癌上皮细胞系 MCF-7 在添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基中培养。为进行荧光成像，将细胞以每 35 mm 玻璃底成像皿 4 × 105 个细胞的密度接种，并在成像前 48 小时进行培养。根据上述方案，在氰化物处理前后对细胞进行成像。氰化物实验的目的是确认 NAD(P)H 与 FAD 荧光的光谱分离，并验证成像系统及分析流程检测细胞代谢变化的能力。在加入氰化物前和加入氰化物后，分别在五个不同位置采集配对的 NAD(P)H 和 FAD 荧光寿命图像。使用尿素测得的仪器响应函数（IRF）（图 2）计算荧光寿命参数（光学氧化还原比、NAD(P)H α1、NAD(P)H τ1、NAD(P)H τ2、NAD(P)H τm、FAD τ1、FAD τ2、FAD α1、FAD τ1、FAD τ2 和 FAD τm

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讨论

自发荧光强度和寿命成像已广泛用于评估细胞代谢21,55。荧光寿命成像（FLIM）具有高分辨率，因此可分辨单个细胞，这对于癌症研究尤为重要，因为细胞异质性与肿瘤侵袭性和耐药性相关7,39,41,44,45,46,58。同样，细胞代谢的自发荧光成像也适用于免疫细胞成像，因为免疫细胞功能与细胞代谢密切相关，且免疫细胞群体通常具有异质性20,31。标准的...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

资助来源包括德克萨斯癌症预防与研究所（CPRIT RP200668）和德克萨斯农工大学&M 大学 图1 使用 BioRender.com 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）SigmaAC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
抗生素抗微生物剂（青霉素-链霉素）Gibco15240096
细胞样本美国模式培养物集存库N/AMCF-7 癌细胞系
CellProfilerBroad InstituteN/A图像分析软件
锥形管VWR89039-66415 mL 锥形管
DMEMThermoFisher11965092培养基
FAD 二向色镜SemrockFF495-Di03-25x36495 nm
FAD 发射滤光片SemrockFF01-550/88-25550/88 nm
FAD 激发滤光片SemrockFF01-458/64-25458/64 nm
FBSThermoFisher16000036
荧光寿命显微镜3iN/A
玻璃底培养皿MatTek CorpP35G-1.0-14-C
多光子激光器CoherentN/A双光子 Coherent 激光器，可调范围 680 nm–1080 nm
NAD(P)H 二向色镜SemrockFF409-Di03-25x36409 nm
NAD(P)H 发射滤光片SemrockFF02-447/60-25447/60 nm
NAD(P)H 激发滤光片SemrockFF01-357/44-25357/44 nm
PBSThermoFisher70011044
氰化钾Sigma-Aldrich380970
SlideBooks 63iN/A图像采集软件
SPCImageBecker & Hickl GmbHN/A荧光寿命分析软件
载物台培养箱okoLabN/A
胰蛋白酶Biosciences786-262
尿素Sigma-AldrichU5128
YG 微珠Polysciences19096-2YG 微球（20.0 µm）

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