本方案描述了内源性代谢辅酶还原型烟酰胺腺嘌呤（磷酸）二核苷酸（NAD(P)H）以及氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的荧光成像与分析。对NAD(P)H和FAD进行自发荧光成像，可提供一种无需标记、非破坏性的细胞代谢评估方法。
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摘要
摘要
细胞代谢是细胞产生能量的过程，许多疾病（包括癌症）都表现为代谢异常。还原型烟酰胺腺嘌呤（磷酸）二核苷酸（NAD(P)H）和氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）是代谢反应中的辅酶。NAD(P)H 和 FAD 具有自发荧光特性，可通过激发和发射波长进行光谱分离。这两种辅酶 NAD(P)H 和 FAD 均可处于游离状态或与蛋白质结合状态，每种状态均具有独特的荧光寿命——即荧光团保持在激发态的时间。荧光寿命成像（FLIM）可对 NAD(P)H 和 FAD 的荧光强度和荧光寿命进行定量，从而实现对细胞代谢的无标记分析。通过选择合适的激发和发射波长，可优化荧光强度和荧光寿命显微镜，用于 NAD(P)H 和 FAD 的成像。使用氰化物诱导代谢扰动，可验证自发荧光成像方案检测细胞内代谢变化的能力。本文将演示利用 NAD(P)H 和 FAD 的自发荧光成像技术来测量细胞代谢的方法。
引言
代谢是细胞产生能量的过程。细胞代谢包含多种通路，包括糖酵解、氧化磷酸化和谷氨酰胺分解。健康细胞利用这些代谢通路产生能量，以支持增殖和功能活动，例如免疫细胞产生细胞因子。许多疾病，包括代谢紊乱、癌症和神经退行性疾病，其特征是细胞代谢发生改变1。例如，某些类型的癌细胞即使在有氧条件下也表现出升高的糖酵解速率，以生成用于合成核酸、蛋白质和脂质的分子2,3。这种现象被称为瓦博格效应（Warburg effect），是多种癌症类型的标志性特征，包括乳腺癌、肺癌和胶质母细胞瘤4。由于癌症进展过程中伴随细胞代谢的改变，细胞代谢可作为药物反应的替代生物标志物5,6。此外，理解药物在细胞水平上的疗效至关重要，因为细胞异质性可能导致个体间对药物的反应不同7,8。
用于鉴定和量化细胞代谢变化的技术对于癌症研究和药物反应研究至关重要。化学分析和蛋白质分析可用于评估细胞或组织的代谢情况，但缺乏单细胞分辨率和空间信息。基于代谢板式读数仪的检测方法能够随时间测量样....
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方案
1. 用于成像的细胞接种
- 吸出一个含有80-90%融合度MCF-7细胞的T-75培养瓶中的培养基，用10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，并加入2 mL 0.25%胰蛋白酶（1×）以使细胞从培养瓶底部脱落。
- 将培养瓶在37 °C下孵育约4分钟，在显微镜下观察细胞以确认其已脱落。
- 立即加入8 mL培养基以中和胰蛋白酶活性。
- 将细胞收集至锥形离心管（15 mL或50 mL）中，使用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 以200 × g 离心5分钟。
- 离心后，吸去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL培养基中，并将4 × 105个细胞接种至35 mm玻璃底成像培养皿（或所用显微镜适配的相应样品载具）中。
- 向成像培养皿中加入2 mL培养基以维持细胞代谢。
- 在成像前，将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育24–48小时，以使细胞贴壁并进入对数生长期。
注：细胞的生长阶段依据前期对该细胞系的经验，并通过细胞产品说明书确认。
2. NAD(P)H 和 FAD 的多光子荧光寿命成像（FLIM）
- 开启多光子荧光寿命显微镜的所有组件，包括显微镜、激光光源以及所....
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结果
乳腺癌上皮细胞系 MCF-7 在添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基中培养。为进行荧光成像，将细胞以每 35 mm 玻璃底成像皿 4 × 105 个细胞的密度接种，并在成像前 48 小时进行培养。根据上述方案，在氰化物处理前后对细胞进行成像。氰化物实验的目的是确认 NAD(P)H 与 FAD 荧光的光谱分离，并验证成像系统及分析流程检测细胞代谢变化的能力。在加入氰化物前和加入氰化物后，分别在五个不同位置采集配对的 NAD(P)H 和 FAD 荧光寿命图像。使用尿素测得的仪器响应函数（IRF）（图 2）计算荧光寿命参数（光学氧化还原比、NAD(P)H α1、NAD(P)H τ1、NAD(P)H τ2、NAD(P)H τm、FAD τ1、FAD τ2、FAD α1、FAD τ1、FAD τ2 和 FAD τm
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讨论
自发荧光强度和寿命成像已广泛用于评估细胞代谢21,55。荧光寿命成像（FLIM）具有高分辨率，因此可分辨单个细胞，这对于癌症研究尤为重要，因为细胞异质性与肿瘤侵袭性和耐药性相关7,39,41,44,45,46,58。同样，细胞代谢的自发荧光成像也适用于免疫细胞成像，因为免疫细胞功能与细胞代谢密切相关，且免疫细胞群体通常具有异质性20,31。标准的.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
资助来源包括德克萨斯癌症预防与研究所（CPRIT RP200668）和德克萨斯农工大学&M 大学 图1 使用 BioRender.com 制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG） | Sigma | AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250 | |
| 抗生素抗微生物剂（青霉素-链霉素） | Gibco | 15240096 | |
| 细胞样本 | 美国模式培养物集存库 | N/A | MCF-7 癌细胞系 |
| CellProfiler | Broad Institute | N/A | 图像分析软件 |
| 锥形管 | VWR | 89039-664 | 15 mL 锥形管 |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | 培养基 |
| FAD 二向色镜 | Semrock | FF495-Di03-25x36 | 495 nm |
| FAD 发射滤光片 | Semrock | FF01-550/88-25 | 550/88 nm |
| FAD 激发滤光片 | Semrock | FF01-458/64-25 | 458/64 nm |
| FBS | ThermoFisher | 16000036 | |
| 荧光寿命显微镜 | 3i | N/A | |
| 玻璃底培养皿 | MatTek Corp | P35G-1.0-14-C | |
| 多光子激光器 | Coherent | N/A | 双光子 Coherent 激光器，可调范围 680 nm–1080 nm |
| NAD(P)H 二向色镜 | Semrock | FF409-Di03-25x36 | 409 nm |
| NAD(P)H 发射滤光片 | Semrock | FF02-447/60-25 | 447/60 nm |
| NAD(P)H 激发滤光片 | Semrock | FF01-357/44-25 | 357/44 nm |
| PBS | ThermoFisher | 70011044 | |
| 氰化钾 | Sigma-Aldrich | 380970 | |
| SlideBooks 6 | 3i | N/A | 图像采集软件 |
| SPCImage | Becker & Hickl GmbH | N/A | 荧光寿命分析软件 |
| 载物台培养箱 | okoLab | N/A | |
| 胰蛋白酶 | Biosciences | 786-262 | |
| 尿素 | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| YG 微珠 | Polysciences | 19096-2 | YG 微球（20.0 µm） |
参考文献
- Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomarkers in Medicine. 4 (2), 241-263 (2010).
- Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using en....
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