高效且具有成本效益的电穿孔方法研究颗粒细胞前体中的原代纤毛依赖性信号通路

Summary

在这里，我们提出了一种可重复的 体外 电穿孔方案，用于原代小脑颗粒细胞前体（GCP）的遗传操作，具有成本效益，高效且可行。此外，该协议还展示了一种简单的方法，用于原代GCP细胞中原代纤毛依赖性刺猬信号通路的分子研究。

Abstract

原代纤毛是一种关键的信号细胞器，几乎存在于从细胞表面转导刺猬（Hh）信号刺激的每个细胞上。在颗粒细胞前体（GCP）中，原代纤毛充当关键信号中心，通过调节Hh信号通路来协调前体细胞增殖。通过对通路成分的 体外 遗传操作来促进原发性纤毛依赖性Hh信号传导机制的研究，以可视化它们对原发性纤毛的动态定位。然而，使用目前已知的电穿孔方法在GCP的初级培养物中转染转基因通常成本高昂，并且通常导致细胞活力低和不良转染效率。本文介绍了一种高效、经济且简单的电穿孔方案，该方案显示出~80-90%的高转染效率和最佳的细胞活力。这是一种简单、可重复且高效的遗传修饰方法，适用于研究原代 GCP 培养物中原发性纤毛依赖性刺猬信号通路。

Introduction

小脑GCP由于其在体内对Hh信号通路的高丰度和高敏感性，被广泛用于研究神经元祖细胞类型中Hh信号通路的机制^{1，2，3，4}。在GCP中，原发纤毛充当关键的Hh信号转导中枢⁵，协调前体细胞的增殖^6，7，8。原发性纤毛上Hh信号传导成分的体外可视化通常具有挑战性，因为它们的内源性基础水平较低。因此，蛋白质表达水平的转基因修饰和目标基因的荧光团标记是在分子分辨率下研究该途径的有用方法。然而，使用基于脂质体的转染方法对 GCP 原代培养物进行遗传操作通常会导致转染效率低下，从而阻碍进一步的分子研究⁹。电穿孔可提高效率，但通常需要过多的供应商专用和电池类型受限的电穿孔试剂¹⁰。

本文介绍了一种高效且具有成本效益的电穿孔方法，用于操纵基仕伯原代培养物中的Hh信号通路组分。使用....

Protocol

所有与动物有关的程序均按照动物处理指引及香港卫生署批准的规程进行。根据《动物（实验控制）条例》（第340章）取得动物实验牌照，已向香港政府卫生署索取。动物工作是按照香港浸会大学研究处及实验室安全委员会批准的动物安全道德规范进行的。有关此协议中使用的所有材料的详细信息，请参阅材料 表 。

1. 体验前准备

1. 培养基和缓冲液的制备
   1. 无血清培养基 （SFM）
      1. 为了制备50mL SFM，向49mL神经基础培养基中加入500μL100x L-谷氨酰胺替代品，500μL青霉素链霉素，1mM丙酮酸钠和12.5μL1M KCl（最终250μM）。
      2. 将SFM分成2个等分试样，在50 mL锥形管中加入10 mL和40 mL，并在4°C下储存长达一个月。
   2. 消化阻断培养基:SFM中10%FBS
      1. 将 1.1 mL 热灭活 FBS 加入 10 mL 等分试样 SFM 中，以制备消化阻断培养基。
   3. 基仕伯培养基:SFM与B27
      1. 要制备 GCP 培养基，将 800 μL 无血清 B-27 补充剂加入 40 mL 等分试样 SFM 中。
         注意:补充B-27的SFM可以在4°C下储存长达一个月。然而，新鲜制备的培养基会产生最佳结果。

Results

使用Opti-MEM（见 材料表）作为通用试剂，这种提出的电穿孔方法可以实现〜80-90%的持续高电穿孔效率（图1）。在电穿孔后DIV 2处，通过定量所有配对的盒状蛋白-6（Pax6）表达GCP细胞中绿色荧光阳性细胞的百分比来确定Smo-EGFP载体的电穿孔效率。DMSO和SAG处理基团的电穿孔效率似乎相当（图1 和 表2）。

此外，原代纤毛标志物Arl13b的免疫染色表明，在载体和SAG处理组中，培养的DIV 2处GCP的纤毛率约为18%（DMSO:17.35%±0.59%;SAG:18.24%±0.88%）。纤毛速率表示为电穿孔后DIV 2时在细胞表面上具有初级纤毛（Arl13b阳性）的表达Pax6的GCP的百分比（图2 和 表3）。

为了破译原.......

Discussion

通过电穿孔法转染原代GCP培养物中的转染基因通常与细胞活力低和转染效率差有关^9，10。本文介绍了一种具有成本效益且可重复的电穿孔方案，该协议已被证明具有高效率和可行性。此外，我们还展示了一种研究原代GCP细胞中原代纤毛依赖性Hh信号通路的简单方法。

其他常见的电穿孔方法通常需要昂贵的细胞类型特异性电穿孔试剂，这些试剂必须从特定制造商处购买。这里描述的方法被认为是有利的，因为它使用通用且经济的电穿孔试剂来治疗不同的细胞类型。此外，这些数据表明，电穿孔效率达到~80-90%，与其他电穿孔和转染方法相比效率很高^9，10。

为了保持更高的细胞活力，应该考虑几个关键步骤。小脑解剖和解离程序应在1-2小时的最短时间内完成。另一个关键步骤是在电穿孔过程中脉冲之前避免质粒 - 细胞电穿孔混合物中形成气泡。脉冲后.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GCP Culture
B27 补充剂	Life Technologies Ltd	17504044
细胞过滤器，70 µm	康宁	352350
DNase I，来自牛胰腺	Roche	11284932001
Earle's 平衡盐溶液	Gibco，Life Technologies	14155063
FBS，合格的	Thermo Scientific	SH30028.02
谷氨酸MAXTM-I，100x	Gibco，Life Technologies	35050061	L-谷氨酰胺替代品
L-半胱氨酸	Sigma Aldrich	C7352
基质胶	BD Biosciences	354277	基底膜基质
Neurobasal	Gibco，Life Technologies	21103049
木瓜蛋白酶，悬浮液	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma Aldrich	P6407
SAG	Cayman Chemical	11914-1	平滑激动剂
IF 染色
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A7906
多聚甲醛	Sigma Aldrich	P6148
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
<强>一抗混合物
抗 GFP 山羊抗体	Rockland	600-101-215	稀释因子：1 ： 1000
抗 Arl13b 小鼠单克隆抗体	NeuroMab	75-287	稀释因子：1 ： 1000
抗 Pax6 兔多克隆抗体	Covance	PRB-278P	稀释因子： 1 ： 1000
<强>二抗混合物
Alexa Fluor 488 驴抗山羊 IgG	Invitrogen	A-11055	稀释因子： 1 ： 1000
Alexa Fluor 555驴抗小鼠 IgG	Invitrogen	A-31570	稀释因子：1 ： 1000
Alexa Fluor 647 驴抗兔 IgG	Invitrogen	A-31573	稀释因子： 1 ： 1000
DAPI	Thermo Scientific	62247	稀释因子： 1 ： 1000
电穿孔
CU 500 比色皿室	Nepagene	CU500
EPA 电穿孔比色皿（2 mm 间隙）	Nepagene	EC-002
Opti-MEM	Life Technologies Ltd	31985070	转染减血清培养基
pEGFP-mSmo	Addgene	25395
超级电穿孔仪 NEPA21 TYPE II 体外和体内电穿孔	Nepagene	NEPA21	电穿孔仪