一种高效且经济的电穿孔方法用于研究颗粒细胞前体中依赖初级纤毛的信号通路

摘要

此处，我们展示一种可重复的 体外 一种经济高效且可行的电穿孔方案，用于对原代小脑颗粒细胞前体（GCPs）进行遗传操作。此外，该方案还展示了一种简便的方法，用于在原代GCP细胞中开展依赖初级纤毛的Hedgehog信号通路的分子研究。

摘要

初级纤毛是一种几乎存在于所有细胞上的关键信号细胞器，能够将细胞表面的Hedgehog（Hh）信号刺激进行转导。在颗粒细胞前体（GCP）中，初级纤毛作为核心信号中心，通过调控Hh信号通路来协调前体细胞的增殖。通过体外（in vitro）对通路组分进行遗传操作以观察其在初级纤毛中的动态定位，有助于研究依赖初级纤毛的Hh信号机制。然而，目前常用的电穿孔方法在GCP原代培养细胞中转染外源基因时，通常成本较高，且常导致细胞存活率低、转染效率不理想。本文介绍了一种高效、经济且操作简便的电穿孔方案，其转染效率高达约80–90%，并能保持最佳的细胞活力。该方法简单、可重复且高效，适用于在GCP原代培养体系中研究依赖初级纤毛的Hedgehog信号通路。

引言

小脑颗粒细胞前体（cerebellar GCPs）因其丰度高且对Hh信号通路高度敏感，被广泛用于研究神经前体细胞类型中Hh信号通路的作用机制。 体内^1,2,3,4在颗粒细胞前体中，初级纤毛作为 Hedgehog 信号转导的关键枢纽⁵ 协调前体细胞增殖的过程^6,7,8. 体外 由于Hh信号通路组分在初级纤毛中的内源性基础水平较低，对其进行可视化通常具有挑战性。因此，通过转基因手段调节目标蛋白的表达水平，并对目的基因进行荧光蛋白标记，是研究该通路分子机制的有效策略。然而，利用基于脂质体的转染方法对GCP原代细胞进行遗传操作时，往往转染效率较低，从而限制了进一步的分子机制研究。⁹电穿孔可提高效率，但通常需要昂贵的、厂商特异且限于特定细胞类型的电穿孔试剂¹⁰.

本文介绍....

方案

所有与动物相关的操作均遵循香港卫生署批准的动物操作指南和方案，并符合其相关规定。已根据《动物（实验管制）条例》（第340章）获得香港特别行政区政府卫生署颁发的动物实验许可证。动物实验工作严格遵守香港浸会大学研究办公室及实验室安全委员会批准的动物安全伦理规范。 本实验所用材料的详细信息请参见材料表。

1. 实验前准备

1. 培养基和缓冲液的制备
   1. 无血清培养基（SFM）
      1. 配制50 mL SFM：在49 mL Neurobasal培养基中加入500 µL 100倍L-谷氨酰胺替代物、500 µL 青霉素-链霉素、1 mM 丙酮酸钠和12.5 µL 1 M KCl（终浓度为250 µM）。
      2. 将SFM分装为两份，分别为10 mL和40 mL，置于50 mL锥形管中，4 °C保存，最长可保存一个月。
   2. 消化终止液：含10% FBS的SFM
      1. 向10 mL SFM中加入1.1 mL热灭活FBS，配制消化终止液。
   3. GCP培养基：含B27的SFM
      1. 配制GCP培养基时，向40 mL SFM中加入800 µL无血清B-27添加剂。
         注：含B-27的SFM....

结果

使用Opti-MEM（见材料表）作为通用试剂，本方案的电穿孔方法可实现稳定且较高的电穿孔效率，约为80–90%（图1）。Smo-EGFP质粒的电穿孔效率通过电穿孔后第2天（DIV 2）表达绿色荧光的细胞占所有配对盒蛋白6（Pax6）阳性颗粒细胞前体（GCP）细胞的百分比进行定量测定。DMSO处理组与SAG处理组的电穿孔效率相似（图1和表2）。

此外，初级纤毛标志物Arl13b的免疫染色显示，在体外培养第2天（DIV 2），对照组和SAG处理组的颗粒前体细胞（GCP）纤毛化率均约为18%（DMSO组：17.35% ± 0.59%；SAG组：18.24% ± 0.88%）。纤毛化率表示在电转染后第2天（DIV 2），表面具有初级纤毛（Arl13b阳性）的Pax6阳性GCP所占的百分比（图2 和 表3）。

讨论

通过电穿孔法将外源基因转染到原代颗粒前体细胞（GCP）培养物中通常伴随着较低的细胞存活率和较差的转染效率^9,10。本文介绍了一种经济高效且可重复的电穿孔方案，该方案已显示出较高的转染效率和细胞存活率。此外，我们还展示了一种在原代GCP细胞中研究依赖于初级纤毛的Hh信号通路的简便方法。

其他常见的电穿孔方法通常需要使用昂贵的、针对特定细胞类型的电穿孔试剂，且必须从特定厂商购买。本文所述方法具有优势，因其采用一种通用且经济的电穿孔试剂即可适用于多种不同细胞类型。此外，这些数据表明，电穿孔效率可达约80–90%，与其他电穿孔及转染方法相比，效率非常高^9,10。

为了保持较高的细胞存活率，需要考虑几个关键步骤。小脑解剖和组织解离过程应在尽可能短的时间内完成，最好在1-2小时内完成。另一个关键步骤是在电穿.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
GCP 培养
B27 添加剂	Life Technologies LTD	17504044
细胞筛，70 µm	Corning	352350
牛胰 DNase I	Roche	11284932001
Earle’s 平衡盐溶液	Gibco, Life Technologies	14155063
经鉴定合格的胎牛血清（FBS）	Thermo Scientific	SH30028.02
GlutamMAXTM-I，100 倍浓度	Gibco, Life Technologies	35050061	L-谷氨酰胺替代物
L-半胱氨酸	Sigma Aldrich	C7352
Matrigel	BD Biosciences	354277	基底膜基质
Neurobasal 培养基	Gibco, Life Technologies	21103049
木瓜蛋白酶悬浮液	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma Aldrich	P6407
SAG	Cayman Chemical	11914-1	Smoothened 激动剂
免疫荧光染色
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A7906
多聚甲醛	Sigma Aldrich	P6148
曲拉通 X-100	Sigma Aldrich	X100
一抗混合液
抗-GFP 山羊抗体	Rockland	600-101-215	稀释倍数：1 : 1000
抗-Arl13b 小鼠单克隆抗体	NeuroMab	75-287	稀释倍数：1 : 1000
抗-Pax6 兔多克隆抗体	Covance	PRB-278P	稀释倍数：1 : 1000
二抗混合液
Alexa Fluor 488 驴抗山羊 IgG	Invitrogen	A-11055	稀释倍数：1 : 1000
Alexa Fluor 555 驴抗小鼠 IgG	Invitrogen	A-31570	稀释倍数：1 : 1000
Alexa Fluor 647 驴抗兔 IgG	Invitrogen	A-31573	稀释倍数：1 : 1000
DAPI	Thermo Scientific	62247	稀释倍数：1 : 1000
电穿孔
CU 500 电穿孔杯室	Nepagene	CU500
EPA 电穿孔杯（2 mm 间隙）	Nepagene	EC-002
Opti-MEM	Life Technologies LTD	31985070	用于转染的低血清培养基
pEGFP-mSmo	Addgene	25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II 体外与体内电穿孔仪	Nepagene	NEPA21	电穿孔仪