此处，我们展示一种可重复的 体外 一种经济高效且可行的电穿孔方案，用于对原代小脑颗粒细胞前体（GCPs）进行遗传操作。此外，该方案还展示了一种简便的方法，用于在原代GCP细胞中开展依赖初级纤毛的Hedgehog信号通路的分子研究。
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摘要
摘要
初级纤毛是一种几乎存在于所有细胞上的关键信号细胞器，能够将细胞表面的Hedgehog（Hh）信号刺激进行转导。在颗粒细胞前体（GCP）中，初级纤毛作为核心信号中心，通过调控Hh信号通路来协调前体细胞的增殖。通过体外（in vitro）对通路组分进行遗传操作以观察其在初级纤毛中的动态定位，有助于研究依赖初级纤毛的Hh信号机制。然而，目前常用的电穿孔方法在GCP原代培养细胞中转染外源基因时，通常成本较高，且常导致细胞存活率低、转染效率不理想。本文介绍了一种高效、经济且操作简便的电穿孔方案，其转染效率高达约80–90%，并能保持最佳的细胞活力。该方法简单、可重复且高效，适用于在GCP原代培养体系中研究依赖初级纤毛的Hedgehog信号通路。
引言
小脑颗粒细胞前体（cerebellar GCPs）因其丰度高且对Hh信号通路高度敏感，被广泛用于研究神经前体细胞类型中Hh信号通路的作用机制。 体内1,2,3,4在颗粒细胞前体中，初级纤毛作为 Hedgehog 信号转导的关键枢纽5 协调前体细胞增殖的过程6,7,8. 体外 由于Hh信号通路组分在初级纤毛中的内源性基础水平较低，对其进行可视化通常具有挑战性。因此，通过转基因手段调节目标蛋白的表达水平，并对目的基因进行荧光蛋白标记，是研究该通路分子机制的有效策略。然而，利用基于脂质体的转染方法对GCP原代细胞进行遗传操作时，往往转染效率较低，从而限制了进一步的分子机制研究。9电穿孔可提高效率，但通常需要昂贵的、厂商特异且限于特定细胞类型的电穿孔试剂10.
本文介绍了一种高效且经济的电穿孔方法，用于在颗粒细胞前体（GCP）原代培养中调控Hh信号通路组分。通过采用这种改良的电穿孔方案，绿色荧光蛋白（GFP）标记的Smoothened转基因（pEGFP-Smo）被高效导入GCPs，并实现了较高的细胞存活率和转染效率（80–90%）。此外，免疫细胞化学染色结果表明，转染后的GCPs对Smoothened激动剂诱导的Hh信号通路激活表现出高度敏感性，表现为EGFP-Smo向初级纤毛的定位转运。该方案可直接适用于涉及 体外 难以转染的细胞类型的基因改造，例如人和啮齿类动物的原代细胞培养，以及人诱导的 多能干细胞
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方案
所有与动物相关的操作均遵循香港卫生署批准的动物操作指南和方案，并符合其相关规定。已根据《动物（实验管制）条例》（第340章）获得香港特别行政区政府卫生署颁发的动物实验许可证。动物实验工作严格遵守香港浸会大学研究办公室及实验室安全委员会批准的动物安全伦理规范。 本实验所用材料的详细信息请参见材料表。
1. 实验前准备
- 培养基和缓冲液的制备
- 无血清培养基（SFM）
- 配制50 mL SFM：在49 mL Neurobasal培养基中加入500 µL 100倍L-谷氨酰胺替代物、500 µL 青霉素-链霉素、1 mM 丙酮酸钠和12.5 µL 1 M KCl（终浓度为250 µM）。
- 将SFM分装为两份，分别为10 mL和40 mL，置于50 mL锥形管中，4 °C保存，最长可保存一个月。
- 消化终止液：含10% FBS的SFM
- 向10 mL SFM中加入1.1 mL热灭活FBS，配制消化终止液。
- GCP培养基：含B27的SFM
- 配制GCP培养基时，向40 mL SFM中加入800 µL无血清B-27添加剂。
注：含B-27的SFM可在4 °C保存最多一个月，但新鲜配制的培养基效果最佳。
- 配制GCP培养基时，向40 mL SFM中加入800 µL无血清B-27添加剂。
- 解剖缓冲液：含葡萄糖和HEPES的EBSS
- 在含10 mM HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）的无钙镁Earle's平衡盐溶液（EBSS）中加入6 g/L葡萄糖。
- 通过0.2 µm注射器滤器过滤除菌，4 °C长期保存。
- 消化缓冲液
注：使用前新鲜配制。- 每消化2–4个小脑组织需准备2 mL消化缓冲液，每消化4–10个组织需准备4 mL。配制4 mL消化缓冲液时，将1.5 mg L-半胱氨酸（终浓度200–400 µg/mL）溶于4 mL EBSS中。反复颠倒混匀，直至粉末完全溶解。
- 使用0.2 µm注射器滤器和5 mL注射器对溶液进行除菌，并将溶液转移至无菌的35 mm细胞培养皿中。
- 加入4 µL木瓜蛋白酶（原液浓度20单位/mg，稀释1:1,000）和40 µL DNase I（原液10 mg/mL，稀释1:100，终浓度0.1 mg/mL）。
- 将溶液在37 °C、CO2培养箱中孵育至少30分钟，或直至使用。
注：此步骤对激活木瓜蛋白酶至关重要。为获得最佳效果，37 °C孵育时间不得超过45分钟。使用前应确保溶液透明，无白色沉淀。
- 无血清培养基（SFM）
- 盖玻片预包被
- 为促进细胞贴附，将经高压灭菌的12 mm玻璃盖玻片与100 µg/mL多聚-L-赖氨酸（PDL，用无菌dH2O将1 mg/mL原液稀释）在37 °C孵育至少1小时。使用前将盖玻片保留在同一PDL溶液中，4 °C保存。
- 在原代细胞培养当天，将PDL收集至洁净锥形管中，并用无菌dH2O彻底冲洗盖玻片三次，以去除残留PDL。
注：收集的PDL可在4 °C保存并重复使用。 - 将PDL包被的玻璃盖玻片转移至24孔板中，每孔放置一片。
- 去除多余水分后，加入200–300 µL Matrigel（根据产品说明书，用无血清DMEM-F12培养基重悬），完全覆盖盖玻片。
- 将盖玻片在CO2培养箱中37 °C孵育1小时。
注：接种细胞前需去除Matrigel。该Matrigel可收集后于4 °C保存，多次重复使用。
- 预铺板培养皿的制备
- 将2 mL 100 µg/mL PDL（将1 mg/mL PDL原液用无菌dH2O稀释）加入60 mm细胞培养皿中，在37 °C孵育1小时进行包被。
- 细胞接种前立即去除并收集使用过的PDL至洁净锥形管中，4 °C保存以供多次重复使用。用无菌dH2O将PDL包被的培养皿冲洗并洗涤三次。细胞接种前将培养皿自然晾干。
- 每个60 mm细胞培养皿用于接种最多2个完整小脑组织来源的细胞。
- 根据小脑组织数量准备额外的培养皿。
注：预铺板 培养皿的使用方法见步骤2.1.18和2.1.19。
2. 实验第0天
- 小鼠原代颗粒细胞前体的分离与培养
注意：GCP 培养方法是在标准方案基础上改进而来的，简要方案如下 在我们之前的工作中已有简要描述6,11,12为获得最佳颗粒细胞前体（GCP）产量，应使用出生后（P）第6天或第7天的小鼠幼崽进行GCP分离。为确保细胞活力，以下解剖步骤2.1.6–2.1.10应尽快完成。- 在解剖过程中，将无血清培养基（SFM）、消化阻断液、培养基和 Opti-MEM 预热至 37 °C。
- 在洁净工作台上，将所有解剖器械预先浸泡于70%乙醇中进行消毒。
- 将2-3 mL解剖缓冲液加入60 mm细胞培养皿中，并置于冰上预冷。
- 按照第1.1.5节所述配制新鲜消化缓冲液，并于37 °C保温。
- 使用70%乙醇擦拭幼鼠头部以进行消毒。
- 在无麻醉条件下断头处死幼鼠。用镊子夹住头部，使用灭菌的手术剪从颅骨后部剪断以完成断头。用镊子小心剥离皮肤和颅骨，暴露脑组织。
- 使用镊子夹除小脑，并迅速将其浸入步骤2.1.3中预先冷却的解剖缓冲液中。
- 在解剖显微镜下，将小脑浸入解剖缓冲液中，去除脑膜。在解剖显微镜下，富含血管的脑膜应呈粉红色。
- 使用镊子去除所有脑膜。
注意：无脑膜的小脑应呈白色外观。 - 去除任何可见的中脑组织和脉络丛 小脑
- 将小脑转移至一个预先装有步骤2.1.4中配制的温热消化缓冲液的35 mm培养皿中。避免转移过多的解剖缓冲液。使用微型弹簧剪尽快将小脑剪成细小碎片。
- 立即将切碎的小脑在37 °C条件下于CO₂培养箱中孵育15分钟2 培养箱。若需处理超过4个小脑，则将孵育时间延长至20分钟。
注意：孵育后，组织会聚集成团。 - 立即使用预先用消化阻断液润洗过的P1000移液器吸头，将消化后的组织转移至一个新的无菌15 mL离心管底部（避免转移消化缓冲液）。
- 加入适量的消化终止液（每 cerebellum 加入 1 mL），以终止消化反应，并使用 P1000 移液器轻柔吹打 30 次，进一步将组织解离为单细胞悬液。注意避免产生气泡。
- 轻轻将细胞悬液通过70 µm细胞滤网过滤至新的无菌离心管中，以去除细胞团块。
- 将额外的1 mL新鲜消化阻断培养基通过细胞筛，以收集细胞筛上残留的细胞。
- 将滤液在 200 × g 室温（RT）孵育5分钟。移除上清液，用1 mL无血清培养基（SFM）重悬沉淀。重复此步骤两次。避免产生气泡。
- 将沉淀重悬于终体积为2 mL的GCP培养基中，然后将细胞悬液转移至步骤1.3中制备的多聚赖氨酸包被的60 mm预铺培养皿中。在37 °C、CO₂培养箱中孵育15分钟。2 培养箱
注意：不要超过 20 分钟。 - 孵育后，轻轻敲击培养皿侧面，使疏松贴壁的颗粒细胞前体（GCP）脱落。用P1000移液器轻柔吹打，将贴壁的GCP细胞收集至培养基中。将该GCP悬液转移至新的15 mL离心管中。弃去60 mm培养皿。
注意：贴壁性较强的星形胶质细胞和成纤维细胞将仍附着在60 mm培养皿底部，并在此步骤中被去除。省略此步骤将影响GCP培养物的纯度。 - 计数细胞并立即进行电穿孔。
- 天 体外 (DIV) 0：电穿孔法实现Hh受体转基因过表达：pEGFP-Smo
- 使用2 mm间隙电穿孔比色皿进行电穿孔时，为每反应准备以下质粒-细胞电穿孔混合物：1.2 × 106 细胞和10 µg pEGFP-mSmo（将DNA储存液浓度调整为约2–5 µg/µL，溶于Tris-EDTA缓冲液或无菌dH₂O中）2O) 溶于 100 µL Opti-MEM 中。
注意：如果细胞数量不足，可减少总细胞数（但可能会降低电转效率）。然而，每支比色皿中质粒的用量和 Opti-MEM 的总体积不得调整。若实验所需的总细胞数超过 1.5 × 106 细胞，相应扩大电穿孔混合物体积，并分别进行多次电穿孔反应。电穿孔杯最多可重复使用5次。 - 在24孔培养板（含步骤1.2中已包被的盖玻片）的每孔中加入0.5 mL培养基，制备电转染后细胞接种板，并将其置于37 °C CO₂培养箱中保温。2 培养箱
- 从步骤 2.1.20 开始，将所需数量的细胞移入无菌的 1.5 mL 微离心管中，于 200 × g 室温下孵育5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL Opti-MEM中。用Opti-MEM重复此步骤两次，以确保管中无残留培养基。
注意：对于24孔板的每个孔/盖玻片，电穿孔并接种1.2–1.3 × 106 每孔接种细胞，使培养次日细胞融合度达到约70–75%。 - 电穿孔参数设置如下所示 表1.
- 轻轻吹打电穿孔反应液以充分混匀，使用长型P200吸头将恰好100 µL混合液转移至2 mm间隙的电穿孔杯中。避免产生气泡。
- 将比色皿放入比色皿室中。
- 按下电穿孔仪的 Ω 按钮（参见 材料表）并记录阻抗值，该值应约为30-35。为确保电阻抗值Ω处于30-35范围内，需精确加入100 µL体积。
- 按压 开始 按钮以启动脉冲。
- 记录读数框上显示的测量电流值和焦耳值。
- 从比色皿室中取出比色皿。
- 立即向比色皿中加入100 µL预热的培养基，通过轻柔吹打2–3次重悬细胞。立即将细胞悬液转移至步骤2.2.2中准备好的24孔板中。
注意：为尽量减少细胞死亡，电穿孔后应立即接种细胞。 - 在37 °C的CO₂培养箱中孵育细胞2 培养箱中孵育。静置细胞3小时，避免细胞脱落。
- 接种后3小时，轻柔吸出并弃去一半上清液，以去除漂浮的死细胞和碎片，然后加入等量的预热培养基。
- 在37 °C下孵育细胞 在 CO2 培养箱中培养，每隔一天更换一半培养基。
- 第二天在荧光显微镜下观察细胞，即DIV1（图1)检测GFP信号以确定Smo过表达的效率。
- 在体外培养第1天（DIV 1）更换一半培养基后，为激活Hh信号通路，向细胞中加入0.2 µM Smoothened激动剂（SAG），对照组加入等体积的DMSO。孵育24小时后进行细胞固定。
注意：DMSO/SAG 的添加体积应尽可能小。此处每孔 500 µL 培养基中加入 0.5 µL DMSO 或 0.5 µL 0.2 mM SAG，稀释比例为 1:1,000。
- 使用2 mm间隙电穿孔比色皿进行电穿孔时，为每反应准备以下质粒-细胞电穿孔混合物：1.2 × 106 细胞和10 µg pEGFP-mSmo（将DNA储存液浓度调整为约2–5 µg/µL，溶于Tris-EDTA缓冲液或无菌dH₂O中）2O) 溶于 100 µL Opti-MEM 中。
第3天：初级纤毛的可视化及Hh信号通路的研究
- 细胞固定
- 处理后24小时，移除培养基，并使用一次性巴斯德吸管用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞2-3次，同时 避免细胞脱落。
- 加入约400 µL的4%多聚甲醛（用PBS配制），在室温下孵育10分钟以固定细胞。
- 使用一次性巴斯德吸管用PBS冲洗并洗涤2-3次。
- 可在4 °C下以PBS保存长达2个月，或直接进行免疫染色。
- 颗粒细胞前体（GCPs）及初级纤毛标志物的免疫细胞化学染色
- 在24孔板中，用PBS轻轻振荡洗涤细胞，每次5分钟，共洗涤两次。
- 向细胞中加入0.5 mL的100 mM氯化铵，在室温下孵育10分钟以淬灭固定剂。
- 用PBS轻轻振荡洗涤一次，再洗涤2-3次，每次10分钟。
- 将30 µL封闭缓冲液（BB：含0.1% Triton X-100、1% BSA和2%热灭活马血清的PBS溶液）轻轻滴加到一片Parafilm上，形成无气泡的液滴。
- 用镊子将盖玻片从孔中取出，使细胞面朝下置于BB液滴上。在湿盒中室温孵育1小时。
- 根据材料表所示，在BB中配制一抗混合液。为进行一抗孵育，重复步骤3.2.4和3.2.5，将BB替换为一抗混合液。室温孵育2小时。
- 用镊子将盖玻片转移回24孔板中，使细胞面朝上。用PBS轻轻振荡洗涤一次，再洗涤3-4次，每次10分钟。
- 根据材料表所示，在BB中配制二抗混合液。为进行二抗孵育，重复步骤3.2.4和3.2.5，将BB替换为二抗混合液。室温避光孵育1小时。
- 重复步骤3.2.7，进行二抗孵育后的洗涤。
- 使用封片剂将盖玻片封固于洁净的显微镜载玻片上。
- 在避光条件下静置过夜晾干，随后进行共聚焦成像13。
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结果
使用Opti-MEM（见材料表）作为通用试剂，本方案的电穿孔方法可实现稳定且较高的电穿孔效率，约为80–90%（图1）。Smo-EGFP质粒的电穿孔效率通过电穿孔后第2天（DIV 2）表达绿色荧光的细胞占所有配对盒蛋白6（Pax6）阳性颗粒细胞前体（GCP）细胞的百分比进行定量测定。DMSO处理组与SAG处理组的电穿孔效率相似（图1和表2）。
此外，初级纤毛标志物Arl13b的免疫染色显示，在体外培养第2天（DIV 2），对照组和SAG处理组的颗粒前体细胞（GCP）纤毛化率均约为18%（DMSO组：17.35% ± 0.59%；SAG组：18.24% ± 0.88%）。纤毛化率表示在电转染后第2天（DIV 2），表面具有初级纤毛（Arl13b阳性）的Pax6阳性GCP所占的百分比（图2 和 表3）。
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讨论
通过电穿孔法将外源基因转染到原代颗粒前体细胞（GCP）培养物中通常伴随着较低的细胞存活率和较差的转染效率9,10。本文介绍了一种经济高效且可重复的电穿孔方案，该方案已显示出较高的转染效率和细胞存活率。此外，我们还展示了一种在原代GCP细胞中研究依赖于初级纤毛的Hh信号通路的简便方法。
其他常见的电穿孔方法通常需要使用昂贵的、针对特定细胞类型的电穿孔试剂，且必须从特定厂商购买。本文所述方法具有优势，因其采用一种通用且经济的电穿孔试剂即可适用于多种不同细胞类型。此外，这些数据表明，电穿孔效率可达约80–90%，与其他电穿孔及转染方法相比，效率非常高9,10。
为了保持较高的细胞存活率，需要考虑几个关键步骤。小脑解剖和组织解离过程应在尽可能短的时间内完成，最好在1-2小时内完成。另一个关键步骤是在电穿...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由香港浸会大学种子基金和二级启动拨款（RG-SGT2/18-19/SCI/009）以及研究资助局协作研究基金（CRF-C2103-20GF）资助，资助对象为 C.H.H. Hor。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| GCP 培养 | |||
| B27 添加剂 | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| 细胞筛，70 µm | Corning | 352350 | |
| 牛胰 DNase I | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s 平衡盐溶液 | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| 经鉴定合格的胎牛血清（FBS） | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I，100 倍浓度 | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-谷氨酰胺替代物 |
| L-半胱氨酸 | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | 基底膜基质 |
| Neurobasal 培养基 | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| 木瓜蛋白酶悬浮液 | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐 | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened 激动剂 |
| 免疫荧光染色 | |||
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A7906 | |
| 多聚甲醛 | Sigma Aldrich | P6148 | |
| 曲拉通 X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| 一抗混合液 | |||
| 抗-GFP 山羊抗体 | Rockland | 600-101-215 | 稀释倍数：1 : 1000 |
| 抗-Arl13b 小鼠单克隆抗体 | NeuroMab | 75-287 | 稀释倍数：1 : 1000 |
| 抗-Pax6 兔多克隆抗体 | Covance | PRB-278P | 稀释倍数：1 : 1000 |
| 二抗混合液 | |||
| Alexa Fluor 488 驴抗山羊 IgG | Invitrogen | A-11055 | 稀释倍数：1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 驴抗小鼠 IgG | Invitrogen | A-31570 | 稀释倍数：1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 驴抗兔 IgG | Invitrogen | A-31573 | 稀释倍数：1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | 稀释倍数：1 : 1000 |
| 电穿孔 | |||
| CU 500 电穿孔杯室 | Nepagene | CU500 | |
| EPA 电穿孔杯（2 mm 间隙） | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | 用于转染的低血清培养基 |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II 体外与体内电穿孔仪 | Nepagene | NEPA21 | 电穿孔仪 |
参考文献
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