使用三天发育中的雏鸡胚胎生成钩缺血再灌注模型

Summary

本文描述了使用脊髓针定制钩在3天雏鸡胚胎中的缺血再灌注（I / R）建模，以更好地了解I / R发展和治疗。该模型简单，快速且价格低廉。

Abstract

缺血和再灌注 （I/R） 疾病（如心肌梗死、卒中和外周血管疾病）是疾病和死亡的一些主要原因。目前有许多 体外 和 体内 模型可用于研究疾病或受损组织中的I / R机制。然而，迄今为止，还没有报告 任何蛋内 I / R模型，这将允许更好地了解I / R机制和更快的药物筛选。本文描述了在3天雏鸡胚胎中使用脊柱针定制钩进行I / R建模，以了解I / R发育和治疗机制。我们的模型可用于研究DNA，RNA和蛋白质水平的异常。此方法简单，快速且价格低廉。当前模型可以独立使用，也可以与现有的 体外 和 体内 I / R模型结合使用。

Introduction

缺血再灌注组织损伤与许多病理有关，包括心脏病发作、缺血性卒中、创伤和外周血管疾病^{1，2，3，4，5}。这主要是由于缺乏对疾病进展的全面了解以及缺乏有效的研究模型。缺血性损伤发生在组织特定区域的血液供应被切断时。结果，缺血组织最终坏死，尽管速率因组织而异。因此，恢复血液供应可能有助于减轻损害。然而，已经观察到，在某些情况下，再灌注比单独的缺血造成的组织损伤更多^6，7，8。因此，需要了解缺血再灌注的分子和细胞机制，以开发有效的治疗干预措施。目前，尚无针对 I/R 损伤的有效治疗方法。这种差异促使创建了新的实验模型，从体外到体内模型，以解决现有问题^9，10，^11，12，13。

雏鸡胚胎（Gallus gallus domesticus）因其易于获取，道德可接受性，相对较大的尺寸（与其他胚胎相比），低成本和快速生长而被广泛用于研究¹⁴。我们使用雏鸡胚胎在发育72小时时通过在脊髓针的帮助下闭塞和释放右维特林动脉来创建 卵内 I / R。我们将其命名为 Hook-I/R 缺血再灌注模型（图 1）。本研究中使用的模型能够准确模拟所有下游过程，包括氧化和炎症途径，这些途径通常与I / R损伤相关^15，16，17。

Protocol

Era勒克瑙医学院和医院的机构动物伦理委员会发布了一份书面豁免，指出根据动物实验控制和监督委员会（CPCSEA）进行这些实验不需要正式批准。然而，遵循标准操作程序以尽量减少胚胎痛苦的可能性。

1. 缓冲液制备（表1）

1. 准备林格的解决方案
   1. 为了制备林格溶液，将0.72克NaCl（123mM），0.017gCaCl2（1.53mM），0.037gKCl（4.96mM）溶解在70mL无菌蒸馏_H2O中，最终体积为100mL。 将pH值调节至7.4。让它完全溶解并高压灭菌。然后，通过0.22μm过滤器过滤，等分试样成一次性使用量（约10mL）并在室温下储存。
2. 准备生理盐水（0.9%氯化钠，氯化钠）。
   1. 在70 mL无菌蒸馏_H2 O中，溶解0.9gNaCl（154mM）。将体积补到 100 mL。在121°C下高压灭菌15分钟。 如有必要，用0.1 N HCl或0.1 N NaOH调节pH值至7.4。在15 mL无菌离心管中制备10 mL等分试样，并在室温下储存。
3. 准备70%乙醇（v / v）。
   1. 将 70 mL 纯乙醇（摩尔重量 46.07 g/L）与 30 mL 无菌 _H2O 混合。无需消毒。
4. 准备1x磷酸盐缓冲液盐水（1x PBS）。
   1. 将0.144克Na2HPO4·_7H2O（5.37 mM），0.8 g NaCl（136.8 mM），0.2 g KCl（26.8 mM），0.2 g _KH2PO4（14. 6 mM）加入70 mL蒸馏水中，准备100 mL 1x PBS。 溶解并补足体积至100 mL，并在121°C下高压灭菌15分钟。 如果需要，将pH值降至7.4，加入几滴0.1 N HCl或0.1 N NaOH。在15 mL无菌离心管中等分试样10 mL并储存在室温下。

2. 第一天

1. 安排鸡蛋灭菌所需的所有工具（70%乙醇，清洁湿巾，蛋架和OHP标记）。
2. 用薄纸巾用70%乙醇清洁0天鸡蛋。只使用0天卵子，因为较老的卵子可能不会产生胚胎。
3. 用OHP标记在鸡蛋上写下当前日期。
4. 将卵放入温度设置为36-37°C，湿度水平为60%-65%的蛋孵化器中。在接下来的24小时内孵化卵。

3. 第2天

1. 安排必要的设备，以取出5-6毫升白蛋白（锋利的剪刀，5毫升注射器，18 G针头，注射器丢弃器和胶带）。
2. 用70%乙醇擦拭手术剪刀，或在用70%乙醇擦拭后使用高压灭菌器灭菌。
3. 现在从37°C的鸡蛋孵化器中取出鸡蛋进行分层。
4. 将鸡蛋放在干净的蛋架上。
5. 将一小块胶带（尺寸:长约1英寸x宽）绑在鸡蛋的边缘。
6. 用尖尖的边缘剪刀在蛋壳的边缘打一个小洞。以大约 75° 的角度插入 5 mL 注射器。
   注意:5 mL 注射器随附 24 G x 1 针头（无菌），但最好将 24 G x 1 针头替换为 18 G x 1.5 针头（无菌）。18 G x 1.5 针的宽度为 1.25 x 38 mm。因此，它将促进白蛋白的去除。
7. 将针头插入卵黄囊后，慢慢取出5-6毫升白蛋白。
   注意:这为胚胎提供了一个可以生长的床。撤回白蛋白可防止白蛋白溢出，同时建立窗口。最后，通过消除5-6mL白蛋白来减轻胚胎在开窗期间受损的风险。
8. 除去白蛋白后，用胶带重新密封开口，并将卵在37°C下孵育48小时。

4. 第4天

1. 按照方案第1节所述准备铃声溶液，0.9%生理盐水和1x PBS。然后，高压灭菌三种溶液。高压灭菌后，将相应的溶液置于室温下。
2. 从37°C的鸡蛋孵化器中取出鸡蛋，并将蛋壳切成圆形。在切割蛋壳之前，用胶带覆盖要切割的区域。
   注意:用胶带覆盖窗户区域可防止蛋壳破裂到不需要的地方。但是，如果您闯入不需要的地方，请用胶带密封该区域。用胶带覆盖要切割的地方，防止壳片掉落到蛋黄囊上。
3. 在需要窗户的地方用尖尖的边缘剪刀在蛋壳上打一个小洞，然后开始切割一个圆形开口。此过程称为窗口化。
   注意:确保圆形切口足够大，以便从任何方向轻松进入胚胎。如果需要，改变卵子的位置以适应胚胎的位置。
4. 接下来，使用立体变焦手术显微镜，定位右侧的维特林动脉（RVA）。
   注意:鸡胚胎在发育过程中通常会经历胸扭转（以及宫颈屈曲等），使得头部的左侧在72小时阶段与蛋黄相抵。更尾部，在卵形动脉离开身体的地方，胚胎没有太多扭曲，身体的这一部分位于腹侧朝向蛋黄。所以，直接看，胚胎的右边是研究人员的右边。
5. 找到RVA后，使用26 G针在RVA的左侧和右侧创建两个小孔（图2）。
6. 将多普勒血流成像探头放在RVA上方。确保将多普勒血流成像探头放置在距缺血部位5±1mm处，并朝向RVA的远端。取通量读数2分钟30秒（如果需要，则更长）。这将是正氧相读数。
7. 同时，使用鼻钳和齿镊子，手动将脊髓针的边缘模塑成钩子的形状（图3）。通过弯曲脊柱针的边缘约1毫米来做到这一点。较大的尺寸将使在I / R过程中插入和取出脊柱针头更加困难。
8. 使用显微操作器将脊髓针直接插入右外斜动脉下方。
   注意:请极其小心地插入脊柱针，以避免损坏RVA或任何相邻动脉。最佳技术是调整脊柱针的定制设计的钩子，正好在RVA孔的右侧上方，然后在微机械手的帮助下，在立体变焦手术显微镜的指导下，通过右孔逐渐将脊柱针的定制设计边缘插入卵黄囊中。一旦脊髓针的钩子进入卵黄囊，逐渐调整RVA下方的钩子，使其边缘正好位于左孔下方。现在是时候抬起脊髓针了。
9. 现在，在显微操作器的帮助下，逐渐抬起动脉，直到多普勒血流表明动脉血流至少减少80%。
10. 一旦多普勒通量达到80%或更高的下降，将脊柱针抬起（向上拉动动脉）5分钟。这将是RVA缺血的时期。
    注意:在缺血期间监测多普勒通量至关重要。如果发现大量波动，请终止测试。
11. 缺血期5分钟后，逐渐松开动脉，恢复正常的血流水平。确保多普勒血流量计读数显示与正常氧期间获得的值相当的值。这将是RVA中再灌注的时期（图4）。
12. 在I / R程序之后，将几滴（2-3）1x PBS滴到胚胎上，并观察2-3分钟。
    注意:使用1x PBS有助于防止胚胎变干。
13. 最后，用胶带重新密封窗口，并将鸡蛋放回鸡蛋孵化器中5小时55分钟。
14. 5小时55分钟后，从鸡蛋孵化器中取出鸡蛋，将其放在蛋架上，重新打开窗口，然后按照下游处理方案进行。

5. 治疗

1. 对于用药物，激活剂或抑制剂治疗动脉，在I / R过程1小时后切除RVA。
2. 对于下游研究，首先将胚胎从蛋壳中取出，将其放在无菌的90毫米培养皿上。
3. 一旦胚胎被释放到培养皿中，在立体变焦手术显微镜的指导下使用眼部虹膜切除RVA。
4. 确保RVA的切除尺寸不超过15±1毫米（距躯干远端），动脉左侧和右侧各5±1毫米，±1毫米。
   注意:可以使用尺子来测量要切除的区域（可选）。
5. 切除RVA后，在含有1x PBS的无菌培养皿中用1x PBS洗涤。
6. 对于所需的治疗，将动脉置于充满500μL林格溶液的1.5mL离心管（灭菌）中。将RVA置于离心管中，并将其置于37°C培养箱中5小时55分钟。
   注意:根据治疗的不同，要么使用林格氏溶液而不进行任何治疗，要么使用所需体积和浓度的药物，激活剂或抑制剂进行治疗。
7. 孵育5小时55分钟后，从37°C实验室培养箱中取出RVA，然后继续进行所需的处理。

Results

多普勒血流成像技术用于评估我们模型的有效性。简而言之，我们将来自对照组的数据与来自RVA组的数据进行了比较，以确定我们创建的成功。 图4A 描绘了与对照动物相关的典型通量，而 图4B 描绘了从RVA获得的结果。数字 1-8 表示与 I/R 阶段关联的各种事件。简而言之，数字1-3对应于正常氧的相位，而3点和4点的通量急剧下降代表了与RVA中血流量减少相关的事件。一旦达到80%或更高的下降，RVA在接下来的5分钟内就会升高。这是缺血的阶段（数字4-5）。在RVA提升5分钟后，RVA被释放，由数字6和7表示。从点7开始的通量代表再灌注阶段，该阶段发生在RVA达到正常血流水平之后，即再灌注阶段。该特定实验证明了I / R建模在3天发育的雏鸡胚胎中的有效性。

为了验证我们模型的实用性，我们通过ELISA，蛋白质印迹，qRT-PCR和凝胶电泳分析研究了蛋白质，RNA和DNA的表达模式。简而言之，我们将3天发育的卵子分为三个实验组:对照组，I / R和治疗+ I / R。在各...

Discussion

缺血再灌注研究的目标是制定预防细胞死亡和促进恢复的治疗策略^29，30。为了克服当前I/R研究的限制，我们设计了一个Hook I/R雏鸡胚胎模型，以产生可靠且可重复的I/R模型。据我们所知，除了研究应激信号（例如，氧化和炎症应激）之外，我们还是在3天雏鸡胚胎中创建的第一个I / R模型，用于常规I / R实验。鉴于发育第3天的大小和可及性的好处³¹，雏鸡胚胎在72小时的发育阶段使用，因为该模型的高产量，使用简单性以及对常规分析的适应性³²。简而言之，在发育第3天， 蛋 鸡是蛋内高度受控，但可访问且相当透明的模型，可用于可视化正常生理学，疾病病理学和实验治疗的效果。其巨大的尺寸使其特别适用于研究胚胎在正常生理学和压力下的形成和行为³³。虽然可以使用较老的雏鸡胚胎（孵育4天或更长时间的雏鸡胚胎），并且我们确实尝试了较晚的时间点，但使用较老的胚胎作为模型系统受到严重限制...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
（-80°C） 冷冻机	海尔，中国	-
1.5mL 离心管	TARSONS，印度	500010X
100mm 培养皿（无菌）	Tarsons，印度	460050
18G 针头（18G &次;1.5 （1.25&次;38mm）	Ramsons， 印度	13990
1mL 注射器	DISPO	VAN-26G
针头 （26G&次;1/2 （10.45x13mm）	DISPO VAN， 印度	30722D
37°C 湿度可调的鸡蛋孵化器	Gentek，印度	GL-100
37°;C 实验室培养箱	SCIENCE TECH，印度	CB 101-14
3-甲基腺嘌呤 （3-MA）	Sigma Aldrich，美国	M9281
3mL 牧场移液器	TARSONS，印度	940050
50mL 烧杯	TARSONS，印度	-
5mL 注射器	DISPO VAN，印度	IP53
70% 乙醇	Merck Millipore，美国	64-17-5
胶带/塑料胶带	Sunrise，	India-Ambra1
引物	Applied Biosystems， 福斯特市， 美国	Hs00387943_m1
抗小鼠 IgG	细胞信号传输技术公司	7076S
抗兔 IgG	克逊免疫研究实验室， 美国	711-035-152
Atg7	R&D Systems，美国	MAB6608
Atg7 引物	Applied Biosystems，福斯特市，美国	Hs00893766_m1
高压灭菌袋	Tarsons，印度	550022
高压灭菌机	本地制造-
Beclin-1	Proteintech，美国	66665-1-IG
β 肌动蛋白	免疫标签，美国	ITT07018
牛血清白蛋白	Himedia，印度孟买	TC194
氯化钙	Himedia，印度孟买	GRM534
过氧化氢酶	免疫标签，美国	ITT5155
清洁湿巾	Kimberly-Clark，印度	370080
裂解的 Caspase3	免疫标签，美国	ITT07022
二钠磷酸氢七水合	Himedia，印度孟买	GRM39611
多普勒血流计	Moors 仪器，英国	moorVMS-LDF1
蛋架	-	-
架	-	-
GAPDH	ImmunoTag，美国	M1000110
GAPDH 引物	Applied Biosystems，福斯特城，美国
甘氨酸	Himedia，印度孟买	MB013
肾盘	HOSPITO-LC3A
/B	Cell Signaling Technology，美国	4108S
甲醇	Rankem 实验室，印度孟买	M0252
显微作仪	Narishige，日本	M-152
N-乙酰基-L-半胱氨酸 （NAC）	Sigma Aldrich， USA	A7250
柚皮素	Sigma Aldrich， USA	67604-48-2
NF-kβ	Thermo Fisher Scientific，美国	51-0500
NLRP3	免疫标签，美国	ITT07438
割鼻钳	本地制造，勒克瑙，印度	-
眼钳	Stoelting，德国	52106-40
眼虹膜	Tufft 手术器械，印度斋浦尔	Hard Age Vannas 微型剪刀倾斜 8 厘米 / 3 1/8 英寸
OHP记号笔	Camlin，
	ImmunoTag， USA	ITT08329
尖锐的锋利边缘剪刀	Stoelting， Germany	52132-11
氯化钾	Himedia， 孟买， 印度	MB043
磷酸二氢钾无水	Himedia， 孟买， 印度	MB050
蛋白酶抑制剂	Abcam， 美国	Ab65621
SOD-1	ImmunoTag， USA	ITT4364
氯化钠	Fisher Scientific， 孟买， 印度	27605
十二烷基硫酸钠	Himedia， 孟买， 印度	GRM886
脊髓针 25GA;3.50 英寸（90.51 X 90 毫米）	拉姆森，印度	GS-2029
立体变焦手术显微镜	日本奥林巴斯	SZ2-STU3
注射器丢弃器	BIOHAZARD	882210
齿形镊子	Stoelting， 德国	52102-30
Tris Base	G Biosciences， 美国	RC1217
Tris 盐酸	Himedia， 孟买， 印度	MB030
Tween 20	G Biosciences， 美国	RC1227
来角鸡 0 天鸡蛋	-	-
Z-Val-Ala-Asp（OMe）-FMK	MP Biomedicals， LLC， USA	FK009