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方法文章

利用三天发育期鸡胚建立钩状缺血-再灌注模型

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DOI：

10.3791/63288

⸱

2022年2月19日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Stem Cell and Restorative Neurology, Department of Biotechnology, Era’s Lucknow Medical College Hospital, Era University, 2Era University, 3Department of Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Era University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用定制的脊髓针钩在3天龄鸡胚中建立缺血-再灌注（I/R）模型的方法，以更深入地理解I/R的发生机制及治疗方法。该模型操作简便、快速且成本低廉。

摘要

缺血与再灌注（I/R）损伤，如心肌梗死、脑卒中和外周血管疾病，是导致疾病和死亡的主要原因之一。许多 体外 和 体内 目前已有多种模型可用于研究疾病或受损组织中的缺血/再灌注（I/R）机制。然而，迄今为止，尚无 在卵内 已有研究报道了缺血/再灌注（I/R）模型，该模型有助于更好地理解I/R的机制并加速药物筛选。本文描述了一种利用改良脊柱穿刺针制成的钩状工具，在3日龄鸡胚中建立I/R模型的方法，以研究I/R的发生发展及治疗机制。本模型可用于在DNA、RNA和蛋白质水平上探究相关异常变化。该方法操作简便、快速且成本低廉。本模型既可独立使用，也可与现有模型联合应用。 体外 和 在体 I/R 模型。

引言

缺血-再灌注组织损伤与多种病理状态相关，包括心肌梗死、缺血性卒中、创伤以及外周血管疾病1,2,3,4,5。这主要是由于对疾病进展缺乏全面的理解，以及缺乏有效的研究模型。当组织特定区域的血液供应被切断时，就会发生缺血性损伤。结果，缺血组织最终会发生坏死，尽管坏死速率因组织类型而异。因此，恢复血液供应可能有助于减轻损伤。然而，已有观察发现，在某些情况下，再灌注造成的组织损伤比单纯缺血更为严重6,7,8。因此，为了开发有效的治疗干预措施，有必要深入了解缺血-再灌注的分子和细胞机制。目前尚无已知的有效治疗方法可用于I/R损伤。这一差距促使研究人员建立了从体外到体内的各种新型实验模型，以应对这一现有难题9,10,11,12,13。

鸡胚胎（Gallus gallus domesticus）因其易于获取、伦理可接受性高、相对体型较大（与其他胚胎相比）、成本低以及生长迅速等特点，被广泛应用于科研领域14。我们采用发育72小时的鸡胚胎，通过脊髓针阻断并再开放右侧卵黄动脉，建立体内缺血-再灌注（in ovo I/R）模型 。该模型被命名为Hook-I/R缺血-再灌注模型（图1）。本研究所采用的模型能够准确模拟与缺血-再灌注损伤密切相关的各种下游过程，包括氧化应激和炎症通路15,16,17。

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方案

印度勒克瑙医学院和医院的机构动物伦理委员会出具了书面豁免声明，指出根据实验动物控制与监督委员会（CPCSEA）的规定，开展这些实验无需正式批准。然而，实验过程中仍遵循标准操作程序，以尽量减少胚胎可能遭受的应激。

1. 缓冲液配制（表1）

  1. 配制林格氏液
    1. 配制林格氏液时，将 0.72 g NaCl（123 mM）、0.017 g CaCl2 （1.53 mM）、0.037 g KCl（4.96 mM）溶于 70 mL 无菌蒸馏水 H2O 中，定容至 100 mL。调节 pH 至 7.4。待其完全溶解后进行高压灭菌。然后经 0.22 µm 滤膜过滤，分装成单次使用量（约 10 mL），室温保存。
  2. 配制生理盐水（0.9% 氯化钠，NaCl）。
    1. 在 70 mL 无菌蒸馏水 H2O 中溶解 0.9 g NaCl（154 mM），定容至 100 mL。在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。必要时用 0.1 N HCl 或 0.1 N NaOH 调节 pH 至 7.4。分装至 15 mL 无菌离心管中，每管 10 mL，室温保存。
  3. 配制 70% 乙醇（v/v）。
    1. 将 70 mL 纯乙醇（分子量 46.07 g/L）与 30 mL 无菌 H2O 混合。按需配制或室温保存。无需灭菌。
  4. 配制 1× 磷酸盐缓冲液（1× PBS）。
    1. 在 70 mL 蒸馏水中加入 0.144 g Na2HPO4·7H2O（5.37 mM）、0.8 g NaCl（136.8 mM）、0.2 g KCl（26.8 mM）、0.2 g KH2PO4 （14.6 mM），配制 100 mL 1× PBS。溶解后定容至 100 mL，在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。必要时滴加数滴 0.1 N HCl 或 0.1 N NaOH，调节 pH 至 7.4。分装至 15 mL 无菌离心管中，每管 10 mL，室温保存。

2. 第1天

  1. 准备卵子消毒所需的所有工具（70% 乙醇、擦拭纸、卵架和 OHP 记号笔）。
  2. 使用纸巾蘸取 70% 乙醇清洁 0 日龄卵。仅使用 0 日龄卵，因为较老的卵可能无法发育成胚胎。
  3. 用 OHP 记号笔在卵上标注当前日期。
  4. 将卵放入孵卵器中，温度设置为 36–37 °C，湿度设置为 60%–65%。继续孵育 24 小时。

3. 第2天

  1. 准备抽取5-6 mL蛋清所需的必要器械（锋利的剪刀、5 mL注射器、18 G针头、注射器销毁器和胶带）。
  2. 用70%乙醇擦拭手术剪，或在用70%乙醇擦拭后使用高压灭菌器进行灭菌。
  3. 从37 °C的蛋孵箱中取出鸡蛋，准备进行分层操作。
  4. 将鸡蛋放置在干净的蛋架上。
  5. 在鸡蛋边缘贴上一小段胶带（尺寸约为1英寸长×宽）。
  6. 使用尖头剪刀在蛋壳边缘开一个小孔。以大约75°的角度插入5 mL注射器。
    注意：5 mL注射器通常配有24 G × 1针头（无菌），但建议将24 G × 1针头更换为18 G × 1.5针头（无菌）。18 G × 1.5针头的规格为1.25 × 38 mm，更有利于蛋清的抽取。
  7. 将针头插入卵黄囊后，缓慢抽出5-6 mL蛋清。
    注意：此举可为胚胎提供一个利于生长的空间。在开窗过程中，抽出蛋清可防止蛋清溢出，同时通过移除5-6 mL蛋清，降低开窗时损伤胚胎的风险。
  8. 抽取蛋清后，用胶带重新封闭开口，并将鸡蛋置于37 °C孵育48小时。

4. 第4天

  1. 按照方案第1节所述配制林格氏液、0.9%生理盐水和1×PBS。然后对这三种溶液进行高压灭菌。灭菌后，将各溶液置于室温下备用。
  2. 从37 °C的孵蛋箱中取出鸡蛋，将蛋壳切割成圆形。在切割蛋壳前，先用胶带覆盖需要切割的区域。
    注意：用胶带覆盖开窗区域可防止蛋壳在非预期位置破裂。如果发生非预期破裂，应立即用胶带封住该区域。在切割部位贴上胶带可防止蛋壳碎片落入卵黄囊上。
  3. 使用尖头剪刀在希望开窗的位置于蛋壳上刺一个小孔，然后开始切割出一个圆形开口。此过程称为“开窗”。
    注意：确保圆形切口足够大，以便从任意方向都能方便地接触胚胎。如有需要，可调整鸡蛋的位置以适应胚胎的方位。
  4. 接下来，使用体视变倍手术显微镜定位右侧卵黄动脉（RVA）。
    注意：鸡胚在发育过程中通常会发生胸段扭转（伴随颈段弯曲等），因此在72小时阶段，头部左侧会紧贴卵黄。而在更尾侧、卵黄动脉从体腔穿出的区域，胚胎扭转程度较小，该部分身体腹侧朝下贴近卵黄。因此，从正上方观察时，胚胎的右侧位于研究者的右侧。
  5. 确定RVA位置后，使用26 G针头在RVA左右两侧各制造两个小孔（图2）。
  6. 将多普勒血流成像探头置于RVA上方。确保多普勒血流成像探头距离缺血部位5 ± 1 mm，并朝向RVA的远端。持续采集血流信号2分30秒（或根据需要更长时间）。此为常氧相读数。
  7. 同时，使用尖嘴钳和有齿镊子，将脊髓穿刺针的尖端手工塑造成钩状（图3）。通过将脊髓穿刺针尖端弯曲约1 mm完成此操作。若弯曲尺寸过大，在缺血/再灌注（I/R）操作过程中插入和取出穿刺针将更加困难。
  8. 使用显微操作仪将脊髓穿刺针直接插入右侧卵黄动脉下方。
    注意：插入脊髓穿刺针时需极为小心，避免损伤RVA或邻近血管。最佳操作方法是：在体视变倍手术显微镜引导下，借助显微操作仪，将定制设计的穿刺针钩端精确调整至RVA右侧孔的正上方，然后逐渐将穿刺针的定制边缘经右孔插入卵黄囊内。当穿刺针钩进入卵黄囊后，逐步调整钩的位置使其位于RVA下方，并确保其边缘精确置于左侧孔下方。此时即可进行抬升操作。
  9. 现在，在显微操作仪辅助下，逐渐抬高动脉，直至多普勒血流信号显示动脉血流减少至少80%。
  10. 当多普勒血流信号下降达到80%或以上时，保持脊髓穿刺针抬升状态（向上牵拉动脉）5分钟。此阶段即为RVA的缺血期。
    注意：在缺血期间必须持续监测多普勒血流信号。若发现显著波动，应立即终止实验。
  11. 5分钟缺血期结束后，逐渐释放动脉以恢复正常的血流水平。确保多普勒血流仪读数恢复至与常氧期相当的水平。此阶段即为RVA的再灌注期（图4）。
  12. 完成I/R操作后，向胚胎滴加少量（2–3滴）1×PBS，并观察2–3分钟。
    注意：使用1×PBS有助于防止胚胎干燥。
  13. 最后，用胶带重新密封开窗部位，并将鸡蛋放回孵蛋箱中继续孵育5小时55分钟。
  14. 5小时55分钟后，从孵蛋箱中取出鸡蛋，放置于蛋架上，重新打开窗口，并按照后续处理方案进行操作。

5. 处理方法

  1. 在对动脉进行药物、激活剂或抑制剂处理时，于I/R过程1小时后切除RVA。
  2. 对于后续研究，首先将胚胎从蛋壳中取出，并置于无菌的90 mm培养皿中。
  3. 一旦胚胎被释放至培养皿中，在体视变倍手术显微镜引导下，使用眼科虹膜剪切除RVA。
  4. 确保RVA的切除范围为距躯干远端15 ± 1 mm，动脉左右两侧各5 ± 1 mm，朝向躯干方向2 ± 1 mm。
    注意：可使用刻度尺测量待切除区域（可选）。
  5. 切除RVA后，将其置于含有1x PBS的无菌培养皿中，用1x PBS清洗。
  6. 进行所需处理时，将动脉放入装有500 µL林格氏液的无菌1.5 mL离心管中。将RVA放入离心管，并置于37 °C培养箱中孵育5小时55分钟。
    注意：根据具体处理要求，可使用未添加任何处理成分的林格氏液，或加入所需体积和浓度的药物、激活剂或抑制剂的林格氏液。
  7. 孵育5小时55分钟后，从37 °C实验室培养箱中取出RVA，继续进行所需的处理步骤。

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结果

采用多普勒血流成像技术评估我们模型的有效性。简言之，我们比较了对照组与RVA组的数据，以确定模型构建的成功程度。图4A展示了对照组动物典型的血流信号，而图4B展示了来自RVA的实验结果。数字1-8代表与缺血/再灌注（I/R）各阶段相关的不同事件。其中，数字1-3对应于常氧阶段；在第3和第4点处血流信号急剧下降，代表RVA中血流减少的相关事件。当血流下降达到80%或以上时，保持RVA抬高状态持续5分钟，此阶段即为缺血期（数字4-5）。在持续抬高5分钟后，释放RVA，该过程由数字6和7表示。从第7点开始的血流信号代表再灌注阶段，即RVA恢复至正常血流水平后的阶段。本实验结果表明，在孵化3天的鸡胚中成功实现了缺血/再灌注（I/R）模型的构建。

为了验证本模型的有效性，我们通过ELISA、蛋白质印迹、qRT-PCR和凝胶电泳分析，研究了蛋白质、RNA和DNA的表达模式。简言之，我们将培养3天的卵分为三组实验组：对照组、I/R组以及治疗+I/R组。在各自的I/R组与对照组之...

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讨论

缺血-再灌注研究的目标是开发出能够防止细胞死亡并促进恢复的治疗策略29,30为克服当前缺血/再灌注研究中的局限，我们设计了一种钩状装置 I/R 鸡胚模型，用于建立可靠且可重复的缺血/再灌注模型。据我们所知，这是首次在发育第3天的鸡胚中创建可用于常规缺血/再灌注实验的模型，此外还可用于研究应激信号（如氧化应激和炎症应激）。鉴于第3天发育阶段鸡胚在体积和操作可及性方面的优势31，采用发育72小时的鸡胚，因为该模型具有产量高、操作简便以及适用于常规分析的优点32简而言之，在发育第3天， 在卵内 鸡胚是一种在蛋内高度可控、易于获取且具有适度透明性的模型，可用于观察正常生理过程、疾病病理学特征以及实验性治疗的效果。其较大的体积使其在研究正常生理状态及应激条件下胚胎的形成与行为方面尤为有用33尽管可以使用较晚发育阶段的鸡胚（孵化4天或更长时间的鸡胚），我们也曾尝试...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

我们感谢 Hari Shankar 在摄像和编辑过程中提供的宝贵意见，感谢 Baqer Hussain 先生提供配音，Asghar Rizvi 先生参与视频编辑，Mohammad Haider 先生参与视频拍摄，以及 Mohammad Danish Siddiqui 先生在实验过程中的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(-80°C) 冷冻箱Haier，中国-
1.5 mL 离心管TARSONS，印度500010X
100 mm 培养皿（无菌）Tarsons，印度460050
18G 针头（18G×1.5（1.25×38 mm）Ramsons，印度13990
1 mL 注射器DISPO VAN-
26G 针头（26G×1/2（10.45×13 mm）DISPO VAN，印度30722D
37°C 恒温孵育箱（湿度可调）Gentek，印度GL-100
37°C 实验室恒温箱SCIENCE TECH，印度CB 101-14
3-甲基腺嘌呤（3-MA）Sigma Aldrich，美国M9281
3 mL 巴氏吸管TARSONS，印度940050
50 mL 烧杯TARSONS，印度-
5 mL 注射器DISPO VAN，印度IP53
70% 乙醇Merck Millipore，美国64-17-5
胶带/透明胶带Sunrise，印度-
Ambra1 引物Applied Biosystems，福斯特城，美国Hs00387943_m1
抗小鼠 IgGCell Signaling Technology，美国7076S
抗兔 IgGJackson Immuno Research Laboratories，美国711-035-152
Atg7R&D Systems，美国MAB6608
Atg7 引物Applied Biosystems，福斯特城，美国Hs00893766_m1
高压灭菌袋Tarsons，印度550022
高压灭菌器本地制造，勒克瑙，印度-
Beclin-1Proteintech，美国66665-1-Ig
β-肌动蛋白ImmunoTag，美国ITT07018
牛血清白蛋白Himedia，孟买，印度TC194
氯化钙Himedia，孟买，印度GRM534
过氧化氢酶ImmunoTag，美国ITT5155
清洁湿巾Kimberly-Clark，印度370080
活化型 Caspase3ImmunoTag，美国ITT07022
七水合磷酸氢二钠Himedia，孟买，印度GRM39611
多普勒血流仪Moors instrument，英国moorVMS-LDF1
蛋架--
蛋架--
GAPDHImmunoTag，美国M1000110
GAPDH 引物Applied Biosystems，福斯特城，美国Hs02758991_g1
甘氨酸Himedia，孟买，印度MB013
肾形盘HOSPITO-
LC3A/BCell Signaling Technology，美国4108S
甲醇Rankem laboratories，孟买，印度M0252
显微操作器Narishige，日本M-152
N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）Sigma Aldrich，美国A7250
柚皮素Sigma Aldrich，美国67604-48-2
NF-κβThermo Fisher Scientific，美国51-0500
NLRP3ImmunoTag，美国ITT07438
尖嘴钳本地制造，勒克瑙，印度-
眼科镊Stoelting，德国52106-40
眼科虹膜剪Tufft Surgical Instruments，斋浦尔，印度Hard Age Vannas 微型弯头剪 8 cm / 3 1/8"
透明胶片记号笔Camlin，印度-
ORP-150ImmunoTag，美国ITT08329
尖头锐边剪刀Stoelting，德国52132-11
氯化钾Himedia，孟买，印度MB043
无水磷酸二氢钾Himedia，孟买，印度MB050
蛋白酶抑制剂Abcam，美国Ab65621
SOD-1ImmunoTag，美国ITT4364
氯化钠Fisher Scientific，孟买，印度27605
十二烷基硫酸钠Himedia，孟买，印度GRM886
25G 脊髓穿刺针；3.50 英寸（90.51 × 90 mm）Ramson，印度GS-2029
立体变焦手术显微镜Olympus，日本SZ2-STU3
注射器销毁盒BIOHAZARD882210
齿镊Stoelting，德国52102-30
Tris 碱G Biosciences，美国RC1217
Tris 盐酸Himedia，孟买，印度MB030
Tween 20G Biosciences，美国RC1227
白来航鸡 0 日龄鸡蛋--
Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMKMP Biomedicals, LLC，美国FK009

参考文献

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鸡胚模型卵内模型钩状缺血模型多普勒血流右卵黄动脉蛋白质印迹自噬标志物炎症细胞因子凋亡通路
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