利用光控抑制剂在活体小鼠着床前胚胎中对微管细胞骨架进行时空分辨的亚细胞操控

摘要

常用的微管抑制剂在基础和应用研究中被广泛使用，其对细胞具有广泛的影响。最近，光控微管抑制剂（photostatins）作为一种可光控的微管抑制剂新类别出现，能够实现对微管的瞬时、可逆且在空间和时间上精确的操控。本逐步实验方案详细描述了在三维活体小鼠着床前胚胎中应用光控微管抑制剂的具体方法。

摘要

微管细胞骨架构成细胞的框架，对细胞内运输、细胞分裂和信号转导至关重要。传统药理学方法通过例如诺考达唑（nocodazole）破坏普遍存在的微管网络，可能对任何细胞造成毁灭性后果。可逆光控微管抑制剂有望克服这些局限，实现药物效应在时空上的精确控制。其中一类此类药物是基于偶氮苯的光开关抑制剂（photostatins, PSTs）。这些化合物在黑暗条件下无活性，而在紫外光照射下可结合至β-微管蛋白的秋水仙素结合位点，从而抑制微管的聚合及其动态转换。本文介绍了将PSTs应用于三维（3D）活体小鼠着床前胚胎中，以在亚细胞水平上干扰微管网络的方法。本实验方案提供了实验设置的详细说明，以及利用活细胞共聚焦显微镜进行PSTs光激活与光失活的参数设定。这确保了实验的可重复性，并使其他研究者能够将该方法应用于各自的科研问题中。像PSTs这类创新性光控分子开关有望成为强大的工具，推动人们对动态细胞内微管网络的理解，并实现对细胞骨架的非侵入性实时操控。此外，PSTs也可能在其他三维结构（如类器官、囊胚样结构或其它物种的胚胎）中具有应用价值。

引言

微管结构在不同细胞类型中差异显著，以支持多种功能^1,2。其动态的生长与缩短特性使其能够快速响应细胞内外信号，适应细胞不断变化的需求。因此，微管可被视为细胞身份的关键“形态学指纹”""。

利用小分子抑制剂对微管细胞骨架进行药理学靶向研究，已在发育生物学、干细胞生物学、癌症生物学和神经生物学领域带来大量基础性发现^3,4,5,6,7。尽管这种方法不可或缺，但仍存在多种局限性，例如毒性和脱靶效应。以最常用的微管靶向试剂之一诺考达唑（nocodazole）为例，它是一种强效的微管去聚合药物⁸。然而，像诺考达唑这样的小分子抑制剂自施用起即具有活性，而由于微管细胞骨架对许多关键细胞功能至关重要，全局性的微管去聚合可能引发脱靶效应，因而不适用于许多实验场景。此外，除非将样品彻底洗去药物，否则诺考达唑处理不可逆，这阻碍了 持续的活细胞成像，从而无法精确追踪单个微管纤维的动态变化。

光激活化合物的开发始于光控释放分子的构建，这标志着以精确且时空可控的方式靶向和监测微管生长抑制效应的新时代的开启。其中一类可逆光控开关药物——光抑制剂（photostatins, PSTs），是通过将康普瑞塔辛A-4中的二苯乙烯结构替换为偶氮苯而开发得到的⁹。PSTs在未受紫外光照射时处于无活性状态，当受到紫外光照射后，其无活性的反式构型通过可逆异构化转变为有活性的顺式构型。顺式-PSTs通过结合β-微管蛋白上的秋水仙碱结合位点，阻断其与α-微管蛋白的相互作用，从而抑制微管生长所必需的二聚化过程，进而抑制微管聚合¹⁰。在一系列PST化合物中，PST-1P脱颖而出，成为先导化合物，因其具有最强的活性、完全的水溶性，并且在光照后能迅速发挥生物学效应。

PSTs 最有效的 trans- 至 cis-异构化发生在 360–420 nm 波长范围内，这为 PST 的激活提供了两种选择。在典型的共聚焦显微镜上，可使用 405 nm 激光线实现对微管生长抑制的最佳空间靶向。通过 405 nm 激光照射精确定位 PST 激活的时间和位置，可在亚细胞水平上实现对微管动态的精确时空控制，并在亚秒级响应时间内完成⁹。或者，使用价格低廉的 LED 紫外光源可实现对整个生物体的照射，从而引起全 organism 范围内的微管结构破坏。对于那些关注抑制起始时间的精确性而非空间靶向的研究人员而言，这可能是一种经济有效的替代方案。PSTs 的另一特性是可通过施加波长在 510–540 nm 范围内的绿光实现按需失活⁹。这使得研究人员能够在 PST 介导的生长抑制之前、期间和之后追踪微管丝状结构的变化。

PSTs 虽然仍属于较新的设计，但已在众多研究中被广泛应用 体外 在不同研究领域的应用¹¹，包括研究变形虫中细胞迁移的新机制¹²，从小鼠新生脑组织分离的神经元中¹³以及翅上皮发育在 黑腹果蝇¹⁴其他光敏性药物已被证明是靶向干扰细胞功能的有力工具。例如，一种漂白菌素类似物， 叠氮布比他汀（azidoblebbistatin）在光照条件下用于增强肌球蛋白抑制作用^15,16这凸显了由于能够对细胞功能进行时空可控的抑制，从而带来新发现的潜力。

在生理条件下，活体三维生物为在整体动物、单细胞或亚细胞水平上操控微管动力学提供了卓越但更为精细的系统。特别是，小鼠着床前胚胎为深入了解细胞内部机制以及生物体内的细胞间关系提供了独特视角¹⁷。通过时间与空间上精确定位的连续激活和失活光控开关蛋白（PSTs），研究人员得以鉴定出间期桥——一种存在于细胞之间的胞质分裂后结构——作为小鼠着床前胚胎中的一种非中心体微管组织中心¹⁶。类似的实验设计还揭示了生长中的微管在小鼠胚胎封闭过程中的作用，从而支持囊胚的形成¹⁸。此外，PSTs 还被应用于完整的斑马鱼胚胎中，通过抑制后脑部分细胞内的微管生长来研究神经元细胞的迁移过程¹⁹。

本方案描述了PST-1P在小鼠植入前胚胎中的实验设置与使用方法。此处提供的操作步骤也可为PST技术在多种研究目标中的应用提供指导，例如染色体分离与细胞分裂、细胞内物质运输以及细胞形态发生与迁移等研究。此外，此类研究将有助于推动PST技术的进一步应用 在类器官系统、囊胚样结构及其他胚胎模型中，例如 秀丽隐杆线虫 和 Xenopus laevis以及可能拓展PSTs的应用范围 体外 授精技术

方案

实验经莫纳什动物伦理委员会批准，批准编号为19143。动物饲养于动物设施（莫纳什动物研究平台）的特定病原体阴性动物房环境中，严格遵守伦理指导原则。

1. 小鼠胚胎着床前的收集

1. 按照先前所述方法对小鼠进行超数排卵并交配^16,18，操作需符合机构动物伦理指南。
   注：用于活体胚胎采集最常用的小鼠品系为 C57BL/6 或 FVB/N 小鼠。本文所示所有数据均使用 FVB/N 小鼠获得。
2. 交配后次日早晨，使用 M2 培养基按文献所述方法²⁰从输卵管中冲洗合子，或使用人输卵管液（HTF）培养基。按照文献所述方法^21,22，利用口控移液装置将合子转移至预先在 37 °C 下温育并平衡于 5% CO₂ 环境中的新鲜钾离子优化简单培养基（KSOM）液滴中，培养基于 35 mm 培养皿中，并覆盖足量矿物油以确保培养基完全覆盖。
3. 按照文献所述方法²⁰对合子进行显微注射，注射物为编码红色荧光标记的微管正端结合蛋白的 cRNA。本实验中，使用经制备与纯化后稀释于显微注射缓冲液中的 End Binding 蛋白 3（EB3）-dTomato cRNA，终浓度为 30 ng/µL^16,18。
   注：建议提前制备 cRNA，并于 -20 °C 保存，待用时取出。
4. 将胚胎置于避光条件下，在 37 °C 和 5% CO₂ 环境中培养，直至胚胎发育至 PST-1P 处理所需的目标发育阶段。
   注：有关不同胚胎阶段所需培养时间的全面参考资料，参见文献²³。本实验所用的 16-细胞期胚胎，应培养至受精后第 3 天（E3）。

2. 药物和成像培养皿的制备

注意：在执行步骤 2.1 至 2.10 时，必须在完全避光或红光条件下操作，以避免 PST-1P 发生意外激活。所有含有 PST 的试管和培养皿均应使用铝箔或遮光罩覆盖。

1. 用超纯水配制浓度为 50 mM 的 PST-1P 储存液。
   注意：PST-1P 的分子量为 440 g/mol。该储存液在 -20 °C 下可稳定保存长达 1 年。PST-1P 可溶于水或水性缓冲液，但在 DMSO 中不易溶解。
2. 从步骤 2.1 中取出，用超纯水配制 800 µM 的 PST-1P 中间工作液。
3. 将 PST-1P 稀释至新鲜 KSOM 培养基中的终浓度为 40 µM。由于典型实验需要约 20 µL 经 PST-1P 处理的 KSOM，因此将 1 µL 的 800 µM PST-1P 加入 19 µL KSOM 中，得到 20 µL 的终体积，以确保提前准备足够的培养基，并仅在红光下操作以保持可见性。
   注意：PST-1P 稀释液的浓度和激活状态可通过分光光度计测定其紫外-可见吸收光谱进行验证，该操作应在建立检测方法时完成。在 1 cm 比色皿中，完全trans构型的 40 µM 稀释液在 380 nm 处的吸光度（A₃₈₀）应约为 0.8。cis 和 trans 构型在 455 nm 处具有相同的吸光度（A₄₅₅）。当 A₃₈₀ 与 A₄₅₅ 的比值约为 9:1 时，稀释液为非激活状态（完全 trans）；当 A₃₈₀:A₄₅₅ 比值为 1:2 时，稀释液为完全激活状态（完全 cis）。中间比值反映激活的中间状态。
4. 为准备用于活细胞成像的腔室载玻片，用移液器将 10 µL 经 PST-1P 处理的 KSOM 滴加至一个孔的中央，形成半球形液滴（图 1A）。
5. 轻轻加入足量矿物油覆盖液滴，确保不使培养基扩散，以防止液滴蒸发。
6. 将腔室载玻片置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中预热并进行 CO₂ 平衡，至少 3 小时，最长可过夜。
7. 在步骤 2.6 的平衡结束后，准备一个 35 mm 培养皿，内含 10 µL 经 PST-1P 处理、预热并平衡的 KSOM 作为洗涤步骤。此液滴无需覆盖矿物油。
8. 通过口吸移液法将胚胎转移至步骤 2.7 中的经 PST-1P 处理的 KSOM 液滴中。
   注意：建议在步骤 2.7 和 2.8 中采用口吸移液法转移胚胎，但此操作为可选。
9. 立即通过口吸移液法将胚胎转移至步骤 2.4–2.6 所准备的成像腔室载玻片中央的经 PST-1P 处理的 KSOM 液滴中（图 1A）。
10. 将胚胎在成像腔室载玻片中、37 °C 与 5% CO₂ 条件下，在经 PST-1P 处理的 KSOM 中孵育至少 1 小时后再进行成像。如有可能，应将腔室载玻片置于配备环境控制舱的显微镜内，保持 37 °C 与 5% CO₂，并在完全黑暗条件下进行，以确保所有 PST-1P 处于非激活的 trans 构型，并使胚胎沉降至培养皿底部。

3. 活细胞成像与PST-1P光激活

注意：步骤 3.1–3.13 需在配备雪崩光电二极管探测器（APDs）和暗环境室的激光扫描共聚焦显微镜上进行。这些说明具体针对使用下述采集软件的成像系统设置 材料表；但也可应用于其他共聚焦显微镜系统。

1. 使用规定的浸油介质，准备一个63x/1.2 NA的水油浸物镜。
2. 使用红光手电筒辅助定位，推进物镜使其接触浸油介质。在此阶段，避免使用白光或明场照明来寻找胚胎，因为这可能会提前激活PST-1P。
3. 通过目镜并在红光照明下，找到介质液滴的边缘，并将物镜正对准该位置。这有助于用户建立方位感并找到焦平面。
4. 接下来，通过目镜或在支持软件实时扫描模式下，使用红光波长滤光片或561 nm激光在液滴中定位胚胎。
5. 使用载物台控制器和实时扫描模式，设定采集整个胚胎z轴层扫图像的起始点和终止点。
6. 调整激光功率设置（通常情况下，对于高灵敏度探测器如APD，561 nm激光功率低于5%即可）、数字偏移（通常设为-0.900），以优化EB3-dTomato彗星信号的显示效果并最小化背景噪声，针孔设为2 µm，像素分辨率为512 x 512，像素驻留时间为3.15 µs。
7. 以1 µm的切片间隔采集整个胚胎的z轴层扫图像，以评估整个生物体中微管生长的区域（图1B）。
8. 利用步骤3.7获得的3D z轴层扫图像，确定EB3-dTomato追踪实验的兴趣区域（ROI）。将放大倍数增加至3倍，并在特定的亚细胞兴趣区域周围绘制一个矩形ROI。
9. 使用典型的成像参数值，对单个z平面采集延时录像：561 nm激光功率设为5%，数字偏移为-0.900，像素分辨率为512 x 512，针孔设为3 µm，像素驻留时间为3.15 µs，放大倍数为3倍，时间间隔为500 ms。
   注：120个时间帧将提供一段1分钟的追踪视频，通常足以用于数据分析。只要荧光探针的漂白程度最小，采集时间可进一步延长（图1C）。
10. 为激活PST-1P，切换至405 nm激光，并以以下参数采集另一段延时录像：405 nm激光功率设为10%，像素分辨率为512 x 512，针孔完全打开，像素驻留时间为3.15 µs，放大倍数为3倍，时间间隔为500 ms，共采集20帧（图1D）。
11. 切换回561 nm激光，并按照步骤3.9重复采集，以确认PST-1P激活后EB3-dTomato彗星信号的消失（图1E）。确保此采集在激活后尽快进行。
    注：步骤3.10可重复进行，以实现对EB3-dTomato彗星信号更长时间的抑制。然而，必须密切监测胚胎，避免紫外线造成任何损伤。
12. 为将PST-1P逆转回其非活性的trans状态，启用514 nm激光并设为10%功率。以以下参数采集一段延时录像：514 nm激光功率为10%，像素分辨率为512 x 512，针孔完全打开，像素驻留时间为3.15 µs，放大倍数为3倍，时间间隔为500 ms，共20帧（图1F）。
13. 重复步骤3.11，以观察EB3-dTomato彗星信号的恢复情况（图1G）。

4. 图像数据分析

1. 为分析和定量研究PSTs对微管聚合的抑制作用，研究人员可根据具体需求选用合适的软件程序。推荐使用的软件应具备追踪工具，可手动或自动追踪EB3-dTomato彗星的运动、方向和速度^16,18。

图1：活体三维小鼠着床前胚胎中PST-1P光激活与失活的示意图。所有实验均在完全黑暗（黑色背景）或仅红光照射条件下进行。（A）表达EB3-dTomato的小鼠着床前胚胎培养至16细胞阶段，随后转移至含有40 µM PST-1P的KSOM液滴中，并置于成像用载玻片腔室中。（B）对整个胚胎进行三维成像，通过观察EB3-dTomato彗星状信号的分布来评估微管的生长情况。（C）实验开始时，使用延时成像技术在亚细胞区域追踪EB3-dTomato彗星状信号。（D）随后在相同亚细胞区域使用405 nm激光对PST-1P进行光激活，导致EB3-dTomato彗星状信号消失（E）。如有需要，可通过连续照射405 nm光进一步增强PST-1P的激活效果。（F-G）为将PST-1P逆转回其非活性状态并恢复EB3-dTomato彗星状信号，需在相同亚细胞区域施加514 nm激光。如有需要，可重复进行多轮光激活与失活操作。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

根据实验方案，将带有红色荧光蛋白dTomato标记的EB3 cRNA（EB3-dTomato）显微注射到小鼠着床前胚胎中。由于EB3可结合于聚合中的微管正端，因此能够实现生长中微管的可视化²⁴。

实验在受精后第3天（E3）进行，此时小鼠胚胎由16个细胞组成。根据拟研究的科学问题，也可使用其他着床前发育阶段的胚胎。为证明采用405 nm激光激活方案可实现最小程度的光漂白，展示了一个未经处理的胚胎对照实验（图2A i）。根据获取的胚胎三维图像，选择一个EB3-dTomato密度显著的感兴趣区域（ROI）。本示例中，使用单个z平面覆盖整个细胞，以实现EB3-dTomato的高分辨率成像。然而，可根据需要选择胚胎的不同区域（例如，皮质区、核周区、有丝分裂细胞、内层或外层细胞）。在405 nm激光照射前，EB3-dTomato表达图像显示除细胞核区域外，整个细胞质中均存在高密度的EB3-dTomato信号（图2...

讨论

微管网络对细胞的基本内部功能至关重要。因此，在活体生物中调控微管动态存在较大挑战，因为对该网络的任何干扰通常都会对细胞功能的各个方面产生广泛影响。光控微管靶向化合物的出现为在亚细胞水平上精确操控细胞骨架提供了可能，并能更精确地控制微管生长抑制的诱导与逆转过程⁹。本实验方案展示了如何在小鼠早期胚胎中，通过光激活的PST-1P在亚细胞尺度上并以时间精确的方式抑制微管聚合。此外，这种抑制作用可被逆转，从而便于研究微管网络的短期扰动效应。

本方案已针对活体小鼠着床前胚胎中PSTs的应用进行了优化，可作为将其应用扩展至其他多种培养系统的基础。PSTs的新用户在应用过程中可能会遇到一些需要排查的问题，本文提供了若干相应的解决步骤。

应评估PST的细胞毒性，并选择一种能够显著抑制微管生长但对细胞毒性最小的工作浓度。近期一篇预印本中详细描述了优化PST及其他光控开关分子工作浓度的完整实验方案¹¹。简而言之，PST的新使用者可在黑暗条件下通过药物的系...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
吸液管	Sigma-Aldrich	A5177	用于口吸装置
培养皿载片 - LabTek	Thermo Fisher Scientific	NUN155411
编码 EB3-dTomato 的 cRNA	N/A	N/A	根据生产商说明书，使用 mMessage in vitro 转录试剂盒制备
培养皿 - 35 mm	Thermo Fisher Scientific	150560
人绒毛膜促性腺激素	Sigma-Aldrich	C8554
人输卵管液（HTF）培养基	Cosmo-Bio	CSR-R-B071
Imaris 图像分析软件	Bitplane
浸油 W 2010	Carl Zeiss	444969-0000-000	与显微镜浸油物镜配合使用
LED 手电筒 - 红光	Celestron	93588
M2 培养基	Sigma-Aldrich	M7167
小鼠 - 野生型 FVB/N，雄性和雌性	N/A	N/A	雌性 8–9 周龄，雄性 2–6 月龄
微量毛细移液管 - Kimble	Sigma-Aldrich	Z543306	用于口吸装置
显微注射缓冲液	N/A	N/A	5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4
矿物油	Origio	ART-4008-5P
mMessage In vitro 转录试剂盒	Thermo Fisher Scientific	AM1340
NanoDrop 分光光度计	Thermo Fisher Scientific
钾离子优化简单培养基（KSOM）培养基	Cosmo-Bio	CSR-R-B074
孕马血清促性腺激素	Prospec Bio	HOR-272
PST-1P	N/A	N/A	Borowiak, M. et al., 光控微管动力学抑制剂实现光学调控有丝分裂与细胞死亡. Cell. 162 (2), 403–411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
RNA 纯化试剂盒	Sangon	B511361-0100
超纯水	Sigma-Aldrich	W1503
ZEN Black 软件	Carl Zeiss