通过将CBir1 TCR转基因CD4+ T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导肠道炎症

摘要

本方案描述了一种针对肠道微生物群抗原特异性T细胞的过继转移结肠炎模型。从CBir1 TCR转基因小鼠中分离CD4⁺ T细胞，这些细胞特异性识别一种免疫优势的肠道微生物群抗原CBir1鞭毛蛋白，并将其转移至受体Rag1^-/-小鼠，从而引发肠道炎症。

摘要

随着发病率的上升，炎症性肠病（IBD）作为一种影响胃肠道的慢性疾病，给个人和社会带来了重大的健康和经济负担。因此，深入探究IBD发病机制及发展过程中的相关机制至关重要。本文介绍了一种针对肠道微生物群抗原特异性的T细胞转移性结肠炎模型。CBir1鞭毛蛋白已被确认为实验性结肠炎及克罗恩病患者中具有免疫优势的肠道细菌抗原。将特异性识别CBir1鞭毛蛋白的CBir1 TCR转基因初始CD4+ T细胞过继转移至免疫缺陷的Rag1-/-小鼠后，可诱导产生慢性结肠炎。通过组织病理学评估疾病严重程度，并分析结肠固有层中CD4+ T细胞的表型。该模型 closely resembles the development of IBD, which provides an ideal murine model for investigating the mechanisms driving the pathogenesis of IBD and testing the potential drugs for treating IBD.ϊCD4⁺ 特异性针对CBir1鞭毛蛋白的T细胞，在过继转移至免疫缺陷小鼠后可诱导慢性结肠炎 Rag1^-/- 小鼠。疾病严重程度通过组织病理学进行评估。结肠固有层中的CD4⁺ 结肠固有层中T细胞表型也被确定。该模型与炎症性肠病（IBD）的发展过程高度相似，为研究IBD发病机制的驱动因素以及筛选潜在的IBD治疗药物提供了一个理想的鼠类模型。

引言

炎症性肠病（IBD）主要包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），其特征是胃肠道的慢性、反复发作与缓解的炎症，全球有数百万人受到影响¹。IBD 的发生和发展涉及多种因素，包括遗传易感性、肠道微生物群、免疫反应、饮食和生活方式²。然而，IBD 的确切发病机制尚未完全阐明。

一个特别关注的领域是肠道微生物群与宿主免疫反应之间的相互作用在调控肠道炎症中的作用³。肠道微生物群提供了一系列免疫刺激分子和抗原，可激活免疫反应⁴。效应T细胞与调节性T细胞（Tregs）之间的平衡对于维持肠道稳态至关重要，而针对肠道微生物群抗原的过度肠道黏膜CD4⁺ T细胞反应则会导致肠道炎症^5,6,7。作为优势免疫原性肠道微生物群抗原，CBir1鞭毛蛋白已被证实与人类克罗恩病（CD）的发病机制相关^8,9。此外，将CBir1 TCR转基因（Tg）T细胞转移至免疫缺陷小鼠可诱导肠道炎症

方案

所有动物实验均按照德克萨斯大学医学分部动物使用与护理委员会的规定进行。CBir1 TCR Tg 小鼠由伯明翰阿拉巴马大学的 Charles Elson 博士提供。CBir1 TCR Tg 小鼠可为雌性或雄性，年龄应为 8–12 周。Rag1^-/- 小鼠（C57BL/6 背景）购自杰克逊实验室¹⁰。Rag1^-/- 小鼠需性别和年龄匹配，可使用雄性或雌性，年龄应为 8–12 周。整个实验流程详见图 1。

1. 受体小鼠的准备

1. 在相同的SPF级动物实验室内，准备C57BL/6背景的Rag1^-/-小鼠，并通过功效分析计算每组所需小鼠数量¹¹。
   注意：Rag1^-/-小鼠缺乏成熟的T细胞和B细胞¹⁰。
2. 通过耳标法对小鼠进行标记。
3. 在T细胞移植当天对小鼠进行称重。

2. 试剂与溶液的准备

结果

约 5 x 10⁶ CBir1 TCR Tg 初始 CD4⁺ 从成年 CBir1 TCR Tg 小鼠脾脏中分离 T 细胞。CBir1 TCR Tg 初始 CD4⁺ T细胞诱导受体慢性结肠炎 Rag1^-/- 小鼠。细胞转移后，通过监测临床症状评估肠道炎症的进展，包括体重减轻、粪便性状和蜷缩姿势。正如预期，小鼠在细胞转移后约三周开始出现体重下降，至细胞转移后六周时体重降至原始体重的约80%–85%。图3）。此外，小鼠在细胞转移后约3-4周出现腹泻，并在发生重度结肠炎时表现出弓背姿势。处死小鼠后展示结肠的大体形态，并通过组织病理学评分评估结肠炎严重程度。接受CBir1 TCR Tg初始CD4⁺ T细胞在过继转移6周后表现出结肠长度缩短图 4A）。受体小鼠在细胞移植后4周表现出更多的肠道固有层细胞浸润（图 4C)，杯状细胞减少及肠上皮细胞增生.......

讨论

尽管每一步骤对于该结肠炎模型的可重复性都至关重要，但其中存在若干关键步骤。受体 Rag^-/- 小鼠应接受足量的可存活 naϊveϊCD4⁺ T细胞以诱导肠道炎症。我们使用脾脏来分离初始CD4⁺ T细胞而非肠系膜淋巴结。由于初始CD4⁺ MLN 中的 T 细胞数量远低于脾脏。CD62L 在初始 T 细胞中高表达，而 CD44 和 CD25 是 T 细胞的活化标志物^13,14本研究中，我们首先使用抗CD4磁珠分离CD4⁺ 来自脾脏的T细胞。然后我们使用抗-CD4、抗-CD62L和抗-CD25抗体组合来分离 naive CD4⁺ T细胞^13,14研究人员可使用其他标记物对初始CD4⁺ T 细胞。CD45RB^您好.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm 真空驱动一次性瓶顶滤器	MilliporeSigma	SCGPS05RE
100倍青霉素-链霉素溶液	Corning	30-002-CI
100-µm 细胞筛	BD Biosciences	352360
3 mL 移液吸管	Fisherbrand	13-711-9CM
抗小鼠 CD16/32 抗体	Biolegend	101302
抗小鼠 CD25-Percp/Cy5.5 抗体	Biolegend	102030
抗小鼠 CD3-Percp/Cy5.5 抗体	Biolegend	100327
抗小鼠 CD4 APC 抗体	Biolegend	100516
抗小鼠 CD4 磁性微粒	BD Biosciences	551539
抗小鼠 CD4-BV421 抗体	Biolegend	100544
抗小鼠 CD62L-PE 抗体	Biolegend	104408
抗小鼠 Foxp3-PE 抗体	ThermoFisher	12-5773-82
抗小鼠 IFNγ-FITC 抗体	Biolegend	505806
抗小鼠 IL-17A-PE/Cy7 抗体	Biolegend	506922
自动细胞计数仪	Bio-rad	TC20
布雷菲德菌素 A	BD Biosciences	555029
牛血清白蛋白（BSA）	Fisher Bioreagents	BP1600-1
C 管	Miltenyi	130-093-237
细胞分离磁铁架	BD Biosciences	552311
胶原酶 IV	Sigma-Aldrich	C5138
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
组织解离仪	Miltenyi	130-096-427
脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）	Sigma-Aldrich
EDTA	Corning	46-034-CI
EDTA（0.5 M，pH 8.0）	Corning	46-034-CI
胎牛血清（FBS）	R&D Systems	S11550
流式细胞仪	BD Biosciences	LSD Fortessa
加热灯	CoverShield	BR40
苏木精-伊红（H&E）染色试剂盒	Abcam	ab245880
胰岛素注射器	BD Biosciences	329412
离子霉素	ThermoFisher	I24222
活/死可固定近红外死细胞染色试剂盒	ThermoFisher	L10119
MaxQ 6000 恒温/制冷可堆叠摇床	ThermoFisher	SHKE6000
NH4Cl	Thermo Scientific	A687-500
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）	Sigma-Aldrich	P8139
RPMI 1640 培养基	Cytiva HyClone	SH3002702
分选仪	BD Biosciences	Arial Fusion
组织自动处理机	ThermoFisher	STP120
组织包埋/处理盒	Fisher Healthcare	22048142
Tris 碱	Thermo Scientific	BP154-1
True-Nuclear 转录因子缓冲液套装（含破膜缓冲液）	Biolegend	424401