方法文章

通过将CBir1 TCR转基因CD4+ T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导肠道炎症

DOI：

10.3791/63293

⸱

2021年12月16日

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种针对肠道微生物群抗原特异性T细胞的过继转移结肠炎模型。从CBir1 TCR转基因小鼠中分离CD4+ T细胞，这些细胞特异性识别一种免疫优势的肠道微生物群抗原CBir1鞭毛蛋白，并将其转移至受体Rag1-/-小鼠，从而引发肠道炎症。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

随着发病率的上升，炎症性肠病（IBD）作为一种影响胃肠道的慢性疾病，给个人和社会带来了重大的健康和经济负担。因此，深入探究IBD发病机制及发展过程中的相关机制至关重要。本文介绍了一种针对肠道微生物群抗原特异性的T细胞转移性结肠炎模型。CBir1鞭毛蛋白已被确认为实验性结肠炎及克罗恩病患者中具有免疫优势的肠道细菌抗原。将特异性识别CBir1鞭毛蛋白的CBir1 TCR转基因初始CD4+ T细胞过继转移至免疫缺陷的Rag1-/-小鼠后，可诱导产生慢性结肠炎。通过组织病理学评估疾病严重程度，并分析结肠固有层中CD4+ T细胞的表型。该模型 closely resembles the development of IBD, which provides an ideal murine model for investigating the mechanisms driving the pathogenesis of IBD and testing the potential drugs for treating IBD.ϊCD4+ 特异性针对CBir1鞭毛蛋白的T细胞，在过继转移至免疫缺陷小鼠后可诱导慢性结肠炎 Rag1-/- 小鼠。疾病严重程度通过组织病理学进行评估。结肠固有层中的CD4+ 结肠固有层中T细胞表型也被确定。该模型与炎症性肠病（IBD）的发展过程高度相似，为研究IBD发病机制的驱动因素以及筛选潜在的IBD治疗药物提供了一个理想的鼠类模型。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

炎症性肠病（IBD）主要包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），其特征是胃肠道的慢性、反复发作与缓解的炎症，全球有数百万人受到影响1。IBD 的发生和发展涉及多种因素，包括遗传易感性、肠道微生物群、免疫反应、饮食和生活方式2。然而，IBD 的确切发病机制尚未完全阐明。

一个特别关注的领域是肠道微生物群与宿主免疫反应之间的相互作用在调控肠道炎症中的作用3。肠道微生物群提供了一系列免疫刺激分子和抗原，可激活免疫反应4。效应T细胞与调节性T细胞（Tregs）之间的平衡对于维持肠道稳态至关重要，而针对肠道微生物群抗原的过度肠道黏膜CD4+ T细胞反应则会导致肠道炎症5,6,7。作为优势免疫原性肠道微生物群抗原，CBir1鞭毛蛋白已被证实与人类克罗恩病（CD）的发病机制相关8,9。此外，将CBir1 TCR转基因（Tg）T细胞转移至免疫缺陷小鼠可诱导肠道炎症6，其病理特征与人类炎症性肠病（IBD）高度相似，表明该T细胞转移模型有助于研究人类IBD的发病机制。

本研究详细描述了在免疫缺陷的Rag1-/-小鼠中通过过继转移CBir1 TCR转基因初始CD4+ T细胞诱导结肠炎的实验方案。 Rag1-/- 通过过继转移CBir1 TCR转基因naïve CD4+ T细胞至小鼠ϊCD4+ T细胞并评估疾病严重程度。此外，还展示了预期结果，并讨论了实验过程中的关键步骤及故障排除方法，这将有助于研究人员探究肠道炎症的发病机制，并测试治疗炎症性肠病的潜在药物。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有动物实验均按照德克萨斯大学医学分部动物使用与护理委员会的规定进行。CBir1 TCR Tg 小鼠由伯明翰阿拉巴马大学的 Charles Elson 博士提供。CBir1 TCR Tg 小鼠可为雌性或雄性，年龄应为 8–12 周。Rag1-/- 小鼠（C57BL/6 背景）购自杰克逊实验室10。Rag1-/- 小鼠需性别和年龄匹配，可使用雄性或雌性，年龄应为 8–12 周。整个实验流程详见图 1。

1. 受体小鼠的准备

  1. 在相同的SPF级动物实验室内，准备C57BL/6背景的Rag1-/-小鼠，并通过功效分析计算每组所需小鼠数量11。
    注意：Rag1-/-小鼠缺乏成熟的T细胞和B细胞10。
  2. 通过耳标法对小鼠进行标记。
  3. 在T细胞移植当天对小鼠进行称重。

2. 试剂与溶液的准备

注意：所用试剂具有毒性或生物危害性，操作时需采取预防措施和安全防护。

  1. 配制洗涤缓冲液：将 5 mL 100x 青霉素-链霉素加入 500 mL RPMI 1640 培养基中，充分混匀后于 4 ℃ 保存 °C.
  2. 配制 Tris-NH4Cl裂解缓冲液
    1. 配制溶液A：将2.06 g Tris碱溶解于100 mL去离子水（ddH₂O）中。2O）并用 HCl 调节 pH 值至 7.2。
    2. 制备溶液B：溶解7.47 g NH4Cl，加入800 mL ddH₂O中2O.
    3. 将A和B充分混合。测量pH值，若不在7.2则进行调节。
    4. 将总体积调至 1000 mL。高压灭菌后，于 4 °C.
  3. 制备分离缓冲液。
    1. 加入 2.5 g BSA 和 500 µ将0.5 M、pH 8.0的EDTA溶液加入500 mL 1×PBS中，充分混匀。
    2. 通过0.22 μm滤膜过滤溶液 µm 真空驱动一次性瓶顶滤器（参见 材料表）。于4℃保存 °C.
  4. 准备FACS缓冲液。加入1 mL FBS和50 µ将 0.5 M、pH 8.0 的 EDTA 溶液加入 50 mL 洗涤缓冲液（按步骤 2.1 配制）中，充分混匀，4 ℃ 保存 °C.
  5. 配制完全培养基。在45 mL洗涤缓冲液中加入5 mL胎牛血清，充分混匀，4℃保存 °C.
  6. 制备 EDTA-PBS 缓冲液。
    1. 计算所需 EDTA-PBS 缓冲液的体积。体积（mL）= 小鼠数量 × 20。
    2. 在 PBS 中加入适量的 FBS、EDTA 和 HEPES（PBS 中含 2% FBS、0.5 mM EDTA、10 mM HEPES）（参见 材料表).
    3. 充分混匀并在37℃预热 °C 水浴
  7. 配制消化缓冲液。
    1. 计算所需消化缓冲液的体积。体积（mL）= 小鼠数量 × 10。
    2. 在洗涤缓冲液中加入适量的胎牛血清（FBS）、IV型胶原酶（Collagenase IV）和脱氧核糖核酸酶I（DNase I）（终浓度分别为2% FBS、0.5 mg/mL Collagenase IV 和 10 U/mL DNase I）（参见 材料表).
    3. 充分混匀并在37℃预热 °C 水浴
  8. 制备Percoll溶液。
    1. 制备100% Percoll。在45 mL原始Percoll中加入5 mL 10x PBS（见 材料表).
    2. 在洗涤缓冲液中配制2% FBS。将1 mL FBS加入49 mL洗涤缓冲液中。
    3. 计算40% Percoll溶液和75% Percoll溶液的体积。40% Percoll溶液体积（mL）= 小鼠数量 × 4；75% Percoll溶液体积（mL）= 小鼠数量 × 2。
      注意：2.1–2.5 步骤中制备的试剂/溶液将用于步骤 3–4，2.6–2.8 步骤中制备的试剂/溶液将用于步骤 9。步骤 9 中使用的所有试剂/溶液均应新鲜配制。建议在所有步骤中额外多配制 5% 的缓冲液。

3. 脾脏中CBir1 TCR转基因CD4+ T细胞的分离

  1. 通过颈椎脱位结合 CO2 安乐死法（30%-70% 气体-空气置换率）处死 CBir1 TCR Tg 小鼠。用 70% 乙醇润湿小鼠体表。
  2. 在左侧腹部做约 1 cm 的切口，将皮肤从腹肌组织上拉开，再在腹肌组织上做约 3 cm 的切口，使用无菌剪刀和镊子取出脾脏。将脾脏置于含有 5 mL 预冷洗涤缓冲液（按步骤 2.1 配制）的培养皿中。
  3. 用两片无菌玻璃片的粗糙面研磨脾脏。将细胞悬液通过 100 µm 细胞筛过滤至 50 mL 离心管中（参见 材料表）。用 5 mL 预冷洗涤缓冲液冲洗玻璃片和培养皿，并将冲洗液转移至离心管中。
  4. 在 4 °C 条件下，以 350 x g 离心 8 分钟。弃去上清液，每只小鼠脾脏加入 5 mL 预热的 Tris-NH4Cl 裂解缓冲液（按步骤 2.2 配制），重悬细胞。室温孵育 10 分钟。向管中加入 10 mL 预冷洗涤缓冲液。
  5. 在 4 °C 条件下，以 350 x g 离心 8 分钟。弃去上清液，每管加入 10 mL 预冷分离缓冲液（按步骤 2.3 配制）重悬细胞。
  6. 对细胞进行计数。取 10 µL 细胞悬液与 10 µL 台盼蓝充分混合。取 10 µL 混合液滴加到载玻片上，插入自动细胞计数仪（参见 材料表）中，获取活细胞数量12。
    注意：在此步骤中，每只供体小鼠大约可获得 1 x 108 个细胞。
  7. 将步骤 3.6 剩余的细胞悬液在 4 °C 条件下以 350 x g 离心 8 分钟。弃去所有上清液。
  8. 充分涡旋振荡抗小鼠 CD4 磁性颗粒（参见 材料表），每 107 个细胞直接加入 50 µL 磁性颗粒，并与细胞沉淀充分混匀。4 °C 孵育 30 分钟。
    注意：此处也可使用其他商业化的 CD4+ T 细胞富集试剂盒。
  9. 将细胞-磁珠悬液转移至无菌收集管中。向管中加入 3.5 mL 预冷分离缓冲液。
  10. 将管置于细胞分离磁铁（参见 材料表）上，室温放置 8 分钟。使用 3 mL 移液管小心吸除上清液。
  11. 从细胞分离磁铁（参见 材料表）上取下管，用 3.5 mL 预冷分离缓冲液重悬细胞，再将管放回磁铁上，室温放置 4 分钟。使用 3 mL 移液管小心吸除上清液。
  12. 重复步骤 3.11。
  13. 用 1 mL 预冷 FACS 缓冲液（按步骤 2.4 配制）重悬细胞。

4. CBir1 TCR Tg 初始CD4+ T细胞的纯化ϊCD4+ T细胞

  1. 在完成步骤 3.6 后对细胞进行计数。
  2. 如果细胞浓度为 >107/mL，加入适量FACS缓冲液以确保细胞浓度≤ 107/mL
    注：~1 × 107 此步骤中，可从一只供体小鼠获得细胞。
  3. 用10 μL表面标志物抗体染色 µL 抗小鼠 CD4-APC，10 µL 抗小鼠 CD25-Percp/Cy5.5，以及 10 µL 抗小鼠 CD62L-PE13,14 （参见 材料表。轻轻混匀，4℃孵育30分钟 °在暗处
  4. 用 2 mL 预冷的 FACS 缓冲液洗涤细胞。将细胞悬液在 350 x g 4℃下8分钟 °C. 使用3 mL移液管吸除所有上清液。
  5. 重复步骤 4.4。
  6. 将细胞重悬至浓度为 40 x 106/mL 预冷的 FACS 缓冲液中
    注意：为防止分选仪堵塞，需将细胞通过70 μm滤网过滤。 µm 细胞筛
  7. 加入0.1 µg/mL 的 DAPI
    注意：DAPI 用于排除死细胞。
  8. 准备含有4 mL完全培养基（按步骤2.5配制）的15 mL离心管，用于收集分选后的细胞。
  9. 将细胞上样至分选仪。分选单个活的naïveϊCD4+ T 细胞（DAPI- CD4+ CD25- CD62L+ 细胞）在纯度模式下（喷嘴尺寸：70 µm；压力：70 PSI；事件速率：8000-12000 事件/秒；效率：高于 90%）图2).
    注意：NaϊCD4+ T细胞高表达CD62L，并且缺乏活化标志物CD2513,14.
  10. 将细胞悬液在 350 x g 4℃下8分钟 °C. 使用3 mL移液管吸除所有上清液。
  11. 将细胞重悬于 500 µL 的 1× PBS。
  12. 在步骤 3.6 后计数细胞
    注：约5 × 106 此步骤中，可从一只供体小鼠获得细胞。

5. 细胞转移至受体小鼠

  1. 重悬 CBir1 TCR Tg 初始 CD4+ T 细胞ϊCD4+ T细胞至5 x 106/mL 浓度，通过加入 1x PBS 实现。
  2. 将以下内容预热 Rag-/- 在加热灯下的小鼠（参见 材料表）4分钟，然后使用小鼠固定器固定小鼠。
  3. 经静脉转移 200 µ将细胞悬液注入小鼠尾静脉 Rag-/- 使用1 mL胰岛素注射器（27 G）的小鼠（参见 材料表).
    注：一只供体小鼠的细胞足以转移至约五只受体小鼠。

6. 监测结肠炎进展期间的临床症状

  1. 每周称量小鼠体重，一旦小鼠开始出现体重下降，将观察频率增加至每周两次 >原始重量的5%。
  2. 观察小鼠在轻柔刺激下的反应/活动情况。
  3. 观察其他临床异常情况，例如姿势和粪便性状。

7. 结肠组织采集与组织病理学评分

  1. 采用颈椎脱位法处死受体小鼠，并配合使用 CO2 在体重减轻的时间点 >原始体重的20%或细胞转移后6周。用70%乙醇润湿小鼠。
  2. 在腹中线处进行约1 cm的腹侧皮肤切口，将皮肤从腹肌组织上分离，于腹肌组织上作约3 cm切口，暴露盲肠，使用无菌剪刀和镊子完整取出结肠。将结肠置于培养皿中，用预冷的PBS润湿。
  3. 沿纵向切开结肠，并用预冷的 PBS 冲洗。纵向截取三分之一的结肠。
  4. 将结肠条置于纸巾上，管腔面朝上。使用牙签进行瑞士卷式卷曲。15.
  5. 将结肠组织放入包埋盒中，并将包埋盒置于10%中性缓冲福尔马林溶液中固定24小时16，随后进行脱水 使用自动处理器（参见 材料表）及石蜡包埋。
  6. 切5 µ使用切片机对组织样本进行切片，将切片置于载玻片上，然后进行苏木精和伊红（H&E）染色&E) 染色17 （参见 材料表).
  7. 通过合并六项参数的评分，得出组织病理学总评分，最高为12分。各参数评分标准如下：固有层炎症（正常，0；轻度，1；中度，2；重度，3）；杯状细胞丢失（正常，0；轻度，1；中度，2；重度，3）；隐窝异常（正常，0；增生，1；结构紊乱，2；隐窝丢失，3）；隐窝脓肿（无，0；有，1）；黏膜糜烂与溃疡（正常，0；轻度，1；中度，2；重度，3）；黏膜下层改变（无，0；累及黏膜下层，1；透壁性改变，2）。18.

8. 肠道固有层细胞的分离与染色

  1. 步骤 7.3 之后，将另外 2/3 的结肠切成 0.5–1 cm 的小段，并用预冷的 PBS 清洗。
  2. 将结肠段转移至含有 20 mL 预热 EDTA-PBS 缓冲液的 50 mL 离心管中，在 37 °C、250 rpm 振荡条件下孵育 30 分钟。
  3. 涡旋振荡管子，通过无菌筛网（直径：0.01 英寸）滤去上清液，并将结肠段在 50 mL 管中用 20 mL 预冷 PBS 重悬。
  4. 重复步骤 8.3 两次。
  5. 将结肠段放入含有 10 mL 预热消化缓冲液的 C 管中（见材料表）。
  6. 将管子置于解离仪（见材料表）上，运行程序“37C_m_LPDK_1”孵育 25 分钟。
    注意：“37C_m_LPDK_1”是解离仪中的标准预设程序，用于搅拌样品并维持 37 °C 温度。
  7. 检查组织是否完全消化，即消化缓冲液中无任何组织块残留。若未完全消化，则重复运行“37C_m_LPDK_1”程序。
  8. 通过金属筛网和 100 µL 滤器收集上清液，并用 10 mL 预冷 PBS 冲洗。
  9. 在 4 °C 条件下，以 350 × g 离心细胞悬液 8 分钟，吸除所有上清液。
  10. 用 4 mL 40% Percoll 溶液重悬细胞并充分混匀（按步骤 2.8 配制）。
  11. 将重悬的细胞转移至含有 2 mL 75% Percoll 溶液的 15 mL 离心管中。
  12. 在 20 °C 条件下，以 850 × g 离心 20 分钟（加速度梯度：0；刹车梯度：0）。
  13. 使用 3 mL 移液管小心去除上层脂肪，并将细胞层转移至含有 20 mL 洗涤缓冲液的 50 mL 管中。
  14. 在 4 °C 条件下，以 350 × g 离心细胞悬液 8 分钟，弃去所有上清液，并用 1 mL 完全培养基重悬细胞。
  15. 按照步骤 3.6 对细胞进行计数。
  16. 将细胞接种至 24 孔板中，加入 50 ng/mL 佛波酯-12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）和 750 ng/mL 离子霉素激活 2 小时，随后加入 5 µg/mL 布雷菲德菌素 A 孵育 3 小时（见材料表）。
    注意：所用试剂具有毒性，操作时需采取适当的预防措施和安全防护。
  17. 将细胞转移至流式管中，加入 2 mL FACS 缓冲液，在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 8 分钟，弃去上清液。
  18. 在室温下，用含 12.5 µg/mL 抗小鼠 CD16/3219 的 FACS 缓冲液（见材料表）孵育细胞 5 分钟，以阻断 Fc 受体。
  19. 进行活/死细胞染色及表面标志物染色。
    1. 用 2 mL FACS 缓冲液洗涤细胞，在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 8 分钟，弃去上清液。
    2. 在避光条件下，用优化浓度的活细胞染料及表面标志物抗体（如抗小鼠 CD3 和抗小鼠 CD4 抗体）20（见材料表）在 FACS 缓冲液中 4 °C 染色 30 分钟。
      注意：所用试剂具有毒性，操作时需采取适当的预防措施和安全防护。
  20. 进行胞内及核内染色。
    1. 加入 2 mL FACS 缓冲液，在 4 °C 条件下以 350 × g 离心细胞悬液 8 分钟，弃去上清液。
    2. 用 200 µL 转录因子固定工作液（见材料表）重悬细胞，在室温下固定和透化 40 分钟。
    3. 加入 2 mL 透化缓冲液，在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 8 分钟，弃去上清液。
    4. 在室温下，用透化缓冲液中的胞内及核内标志物抗体（如抗小鼠 IFNγ、抗小鼠 IL-17A 和抗小鼠 Foxp3 抗体）20（见材料表）孵育 30 分钟至 1 小时。
    5. 加入 2 mL 透化缓冲液，在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 8 分钟，弃去上清液。
    6. 加入 1 mL FACS 缓冲液，在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 8 分钟，弃去上清液。
  21. 用 200 µL FACS 缓冲液重悬细胞，并在流式细胞仪上检测样品（见材料表）。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

约 5 x 106 CBir1 TCR Tg 初始 CD4+ 从成年 CBir1 TCR Tg 小鼠脾脏中分离 T 细胞。CBir1 TCR Tg 初始 CD4+ T细胞诱导受体慢性结肠炎 Rag1-/- 小鼠。细胞转移后，通过监测体重减轻、粪便性状和蜷缩姿势等临床症状来评估肠道炎症的进展。与预期一致，小鼠在细胞转移后约三周开始出现体重下降，至细胞转移后六周时体重降至原始体重的约80%–85%（图3）。此外，小鼠在细胞转移后约3-4周出现腹泻，并在发生重度结肠炎时表现出蜷缩姿势。处死小鼠后观察结肠的大体形态，并通过组织病理学评分评估结肠炎严重程度。接受CBir1 TCR Tg初始CD4+ T细胞在过继转移6周后表现出结肠长度缩短图4A。受体小鼠在细胞移植后4周表现出更多的肠黏膜固有层细胞浸润（图4C），杯状细胞减少和肠道上皮细胞增生，...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尽管每一步骤对于该结肠炎模型的可重复性都至关重要，但其中存在若干关键步骤。受体 Rag-/- 小鼠应接受足量的可存活 naϊveϊCD4+ T细胞以诱导肠道炎症。我们使用脾脏来分离初始CD4+ T细胞而非肠系膜淋巴结。由于初始CD4+ MLN 中的 T 细胞数量远低于脾脏。CD62L 在初始 T 细胞中高表达，而 CD44 和 CD25 是 T 细胞的活化标志物13,14本研究中，我们首先使用抗CD4磁珠分离CD4+ 来自脾脏的T细胞。然后我们使用抗-CD4、抗-CD62L和抗-CD25抗体组合来分离 naive CD4+ T细胞13,14研究人员可使用其他标记物对初始CD4+ T 细胞。CD45RB您好...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有作者均无任何财务、专业或个人利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作部分得到了美国国立卫生研究院基金项目 DK125011、AI150210 和 DK124132、德克萨斯大学系统 STARs 奖项（Y.C.）以及位于加尔维斯顿的德克萨斯大学医学分部 James W. McLaughlin 研究员基金（W.Y.）的支持。图1使用 BioRender.com 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 真空驱动一次性瓶顶滤器MilliporeSigmaSCGPS05RE
100倍青霉素-链霉素溶液Corning30-002-CI
100-µm 细胞筛BD Biosciences352360
3 mL 移液吸管Fisherbrand13-711-9CM
抗小鼠 CD16/32 抗体Biolegend101302
抗小鼠 CD25-Percp/Cy5.5 抗体Biolegend102030
抗小鼠 CD3-Percp/Cy5.5 抗体Biolegend100327
抗小鼠 CD4 APC 抗体Biolegend100516
抗小鼠 CD4 磁性微粒BD Biosciences551539
抗小鼠 CD4-BV421 抗体Biolegend100544
抗小鼠 CD62L-PE 抗体Biolegend104408
抗小鼠 Foxp3-PE 抗体ThermoFisher12-5773-82
抗小鼠 IFNγ-FITC 抗体Biolegend505806
抗小鼠 IL-17A-PE/Cy7 抗体Biolegend506922
自动细胞计数仪Bio-radTC20
布雷菲德菌素 ABD Biosciences555029
牛血清白蛋白（BSA）Fisher BioreagentsBP1600-1
C 管Miltenyi130-093-237
细胞分离磁铁架BD Biosciences552311
胶原酶 IVSigma-AldrichC5138
DAPISigma-AldrichD9542
组织解离仪Miltenyi130-096-427
脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）Sigma-Aldrich
EDTACorning46-034-CI
EDTA（0.5 M，pH 8.0）Corning46-034-CI
胎牛血清（FBS）R&D SystemsS11550
流式细胞仪BD BiosciencesLSD Fortessa
加热灯CoverShieldBR40
苏木精-伊红（H&E）染色试剂盒Abcamab245880
胰岛素注射器BD Biosciences329412
离子霉素ThermoFisherI24222
活/死可固定近红外死细胞染色试剂盒ThermoFisherL10119
MaxQ 6000 恒温/制冷可堆叠摇床ThermoFisherSHKE6000
NH4ClThermo ScientificA687-500
PercollGE Healthcare17-0891-01
佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）Sigma-AldrichP8139
RPMI 1640 培养基Cytiva HyCloneSH3002702
分选仪BD BiosciencesArial Fusion
组织自动处理机ThermoFisherSTP120
组织包埋/处理盒Fisher Healthcare22048142
Tris 碱Thermo ScientificBP154-1
True-Nuclear 转录因子缓冲液套装（含破膜缓冲液）Biolegend424401

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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