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方法文章

使用旋转细胞培养系统在模拟微重力条件下培养淋巴细胞

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DOI：

10.3791/63296

⸱

2022年8月25日

 ,  , 
1Laboratory Medicine and Pathobiology, Temerty Faculty of Medicine, University of Toronto, 2Krembil Research Institute, Toronto Western Hospital, University Health Network, 3Pathology and Lab Medicine, Hematopathology, Mount Sinai Hospital, Sinai Health Systems, 4Medical Oncology and Hematology, Princess Margaret Cancer Centre

本文内容

摘要

本指南逐步介绍如何使用市售的旋转式细胞培养系统，利用专用的一次性培养容器在模拟微重力条件下培养淋巴细胞。该培养方法可应用于任何类型的悬浮细胞培养。

摘要

鉴于目前在太空开展生物研究存在诸多限制，可在地球上采用若干方法对细胞培养施加模拟微重力（SMG）。这些方法在原理、技术手段以及适用于悬浮细胞培养的适用性方面各不相同。本文描述了一种利用 commercially available rotary cell culture system（也称为二维回转器或旋转壁式生物反应器，RWV）对淋巴细胞施加模拟微重力的细胞培养方法。该方法基于时间平均重力矢量抵消原理，通过绕水平轴旋转细胞来实现微重力环境的模拟。在此系统中培养的细胞可被收获并用于多种不同的实验分析，以评估模拟微重力对细胞功能和生理状态的影响。尽管具体培养技术可能因所用细胞类型或细胞系的不同而略有调整，但本文所述方法适用于任何类型的悬浮细胞培养。

引言

航天飞行已被证实会影响人体生理的多个方面，包括免疫系统。许多研究已表明，航天飞行在体内以及模拟微重力（SMG）在体外均会导致免疫失调in vivo 和暴露于模拟微重力（SMG）in vitro1,2,3,4。影响人体生理的太空环境的一个主要方面是微重力。微重力是指由于太空环境中引力极小而产生的"失重"状态5。随着人类准备开展前往月球和火星的更长期太空任务，需要进行更多研究，以减轻宇航员面临的严重健康风险。

科学研究所用的真实微重力环境可在国际空间站（ISS）或进入轨道的纳卫星上实现；然而，这些方案的实施可能极其昂贵且复杂。鉴于目前在太空中开展生物研究存在诸多限制，地球上有多种方法可用于诱导真实微重力和模拟微重力（SMG）。一些大型设施可在地球上产生短暂的真实微重力，包括落塔、抛物线飞行和探空火箭。然而，这些方法并不十分适用于研究微重力对生物系统的影响，主要原因是其微重力作用时间较短（即数秒至20分钟）。这些方法在其他文献中有更详细的讨论5,6。适用于生物细胞培养的方法包括小型设备，如二维回转器（2D clinostat）或旋转壁式生物反应器（RWV）装置，以及三维回转器（3D clinostat）或随机定位装置（RPM）。这些设备可置于维持在37 °C和5% CO2条件下的细胞培养孵育箱内，通过水平轴（二维）或两个相互垂直的轴（三维）旋转细胞培养体系5。然而，必须强调的是，这些培养方法产生的是模拟微重力（SMG），而非真实微重力；在生物学研究背景下，真实微重力最可行的获取方式仍是在太空环境中实现。

本文的目的是概述使用市售的RWV装置（材料表）对淋巴细胞施加模拟微重力（SMG）的步骤，该装置属于2D旋转式生物反应器（clinostat）类别。尽管设备制造商已提供了一般操作规程，但本文旨在更详细地介绍其中的故障排查与优化步骤。本文还阐述了该装置在悬浮细胞培养（特别是淋巴细胞）中产生模拟微重力作用的理论基础。在此背景下，悬浮细胞培养是指细胞在添加补充物的培养基中自由生长，不附着于任何额外支架结构。许多类型的细胞均可在悬浮培养条件下生长，其中包括淋巴细胞。淋巴细胞是免疫系统的细胞，包括T细胞、B细胞和自然杀伤（NK）细胞，主要存在于淋巴器官和血液中7。

本文所述的 RWV 2D 慢速旋转式生物反应器基于时间平均重力矢量抵消原理5,6,8,9，通过使细胞培养物绕水平轴旋转，从而随机化重力矢量。该过程通过将培养容器的旋转速度与细胞的沉降速度相匹配来实现。只要培养容器的旋转速度与细胞的沉降速度良好匹配，细胞便能维持在自由下落状态，无法发生沉降，类似于空间环境中的情况。在初始加速阶段之后，培养容器内的培养基随时间逐渐达到"刚体旋转"状态。这种水平旋转还会在细胞培养容器内诱导产生层流。由于层流对细胞产生的剪切应力远小于湍流，因此形成了"低剪切"环境。然而，由于慢速旋转系统并非完美，仍会引入一些微小的层流流动，对细胞施加极小的剪切应力。因此，悬浮在培养基中的细胞在旋转过程中会被这种流动带动。在水平旋转期间，重力矢量作用于细胞，使其进入振荡轨迹，如图1所示。另一个微小的剪切应力来源是细胞在培养基中"下落"时在细胞周围引发的层流。当培养容器绕水平轴旋转时，细胞所受的重力矢量也随之旋转。随着时间推移，这一旋转的重力矢量平均趋近于零；此现象称为时间平均重力矢量抵消，并诱导产生模拟微重力（SMG）状态5,6,8,9。该装置已被用于研究 SMG 对多种类型细胞的影响，其中部分研究见参考文献10,11,12。更多实例可在设备制造商的网站上找到。

该RWV装置使用由设备制造商提供的专用"高长径比容器"（HARVs）。每个HARV可容纳10 mL细胞培养液；此外，也有50 mL的HARV可供使用。可根据后续实验分析所需的细胞数量，选择使用10 mL或50 mL的HARV，具体选择依据将在讨论部分进一步说明。HARV由聚碳酸酯制成，并包含一个硅胶氧合膜，以支持细胞培养过程中的气体交换。这有助于维持培养基的pH值，并促进高效的细胞呼吸。容器正面设有一个主加样口和两个带盖的注射器接口（图2A）。通过主加样口将细胞培养液加入容器后，需将两个注射器连接至容器上，以协助去除气泡。使用10 mL容器时，两个3 mL注射器较为合适。其中一个注射器在连接时保持空置且活塞完全压下，另一个则预先装入3 mL细胞培养液（图2E）。这两个注射器配合使用，以清除容器内的气泡，这对维持SMG处理至关重要。通常建议设置两个阴性对照，分别称为"培养瓶"对照和"1G"对照。"培养瓶"对照指在标准T25悬浮细胞培养瓶中培养的细胞；而1G对照指在专用的10 mL培养容器中培养的细胞，该容器仅置于培养箱中（即不接受SMG处理）。有关对照的更多细节，请参见讨论部分。

本文所述方法适用于任何希望研究模拟微重力（SMG）对淋巴细胞影响的研究人员，特别是通过使用NK92细胞系来重点研究自然杀伤（NK）细胞13。这些研究结果可能有助于我们更深入地理解并减轻太空飞行对人类免疫系统的不利影响。

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方案

注意：以下步骤应在无菌生物安全柜内完成。

1. 细胞培养容器的准备

  1. 将培养容器从塑料包装中取出。在容器边缘标记每个容器，注明所使用的细胞类型/细胞系、是对照组（1G）还是处理组（SMG），以及其他相关信息。
  2. 固定容器，小心打开加液口，避免触碰加液口帽的插销/O型圈。在填充容器时，将帽放置于乙醇垫上，插销/O型圈朝上。不要取下注射器端口的帽。
    注意：若不慎触碰到插销/O型圈，请用70%乙醇喷洒帽的插销部分，并在填充过程中保持朝上静置数分钟。当准备重新关闭加液口时，使用一张干净的纸巾取回瓶帽，在放回容器前彻底擦干。
  3. 使用无菌移液管向容器中加入10 mL适用于该细胞培养的完全培养基，并小心地将帽重新盖回加液口。
    注意：本实验中使用的是NK92自然杀伤细胞系，该细胞系在GM1培养基中培养，此前已在一项使用NK92细胞作为细胞治疗的临床试验中得到验证14。所用培养基取决于具体培养的细胞系或细胞类型。请查阅供应商网站以获取所用细胞系或细胞类型的正确培养基配方。
  4. 确保注射器端口帽和加液口均已牢固关闭，将装填好的容器置于37 °C、5% CO2的培养箱中，同时进行后续操作以对容器进行细胞培养前的预处理。
    ​注意：此预处理步骤有助于减少大气泡的形成，便于在后续第6步中更轻松地排出气泡。

2. 用于SMG处理设置的储备细胞培养物的制备

  1. 不使用时，应将目标细胞储存在低于 -130 °C 的环境中，或理想情况下储存在液氮气相中。
  2. 在计划处理开始前至少 1 周，解冻细胞并根据供应商网站上提供的适当细胞培养基配方进行培养。规划好设置处理所需的细胞数量（详见后续步骤），并确保提前启动培养，以保证细胞有足够的时间增殖并适应培养环境。
  3. 将细胞培养物置于 37 °C、 5% CO2 的培养箱中。有关标准细胞培养操作的更多细节可参见其他文献15。
  4. 在计划进行 SMG 处理的当天，测定初始细胞培养物的起始浓度和细胞活力。
    1. 采用您偏好的方法测定初始细胞培养物的浓度（例如血细胞计数板、ViCell、流式细胞术等）。记录活细胞浓度（个/mL）和细胞活力（%），确保细胞活力理想情况下高于 85%。使用血细胞计数板的操作方案可参见其他文献16。
  5. 根据特定细胞类型/细胞系的最佳细胞浓度范围、倍增时间以及 SMG 处理的持续时间，确定适用于 SMG 处理的细胞接种密度/浓度。详见讨论部分的进一步说明。
    注：根据经验，NK92 细胞的最佳浓度范围为 0.3 × 106–1.2 × 106 个细胞/mL。通常这些细胞的倍增时间为 48–72 小时，每 2–3 天需换液一次。鉴于处理时间为 72 小时，细胞接种密度应选择其最佳范围的下限，即 0.4–0.5 × 106 个细胞/mL。供应商也建议在从新鲜冻存管复苏 NK92 细胞时采用此接种密度。
  6. 确定用于设置处理组和对照组所需的细胞储备培养物体积。
    注：每个实验组需要 10 mL 细胞培养物。若设置三个实验组（即一个处理组："SMG"，以及两个阴性对照组："Flask" 和 "1G"），另需 10 mL 细胞培养物用于分装至 15 mL 离心管中，以加载 HARV 注射器。总计需要 40 mL，具体用量可能因实验设计而异。
  7. 确定设置处理所需的细胞总数。
    1. 通过将选定的接种密度（个细胞/mL）乘以所需总体积（mL）来计算所需细胞总数。
      注：根据 NK92 细胞的操作经验，如上所述需准备 40 mL 储备细胞培养物，接种浓度为 0.4–0.5 × 106 个细胞/mL。因此，完成典型处理设置需要 16–20 × 106 个 NK92 细胞。对于 NK92 细胞系，为在整个处理过程中维持高细胞活力，使用略多的细胞优于略少的细胞。
  8. 确定需离心的初始细胞培养物体积。
    1. 由于细胞浓度以个细胞/mL 表示，将实验所需细胞总数（个细胞）除以测得的细胞培养物起始浓度（个细胞/mL），即可得到所需体积。
      注：例如，若需要 16 × 106 个细胞，而培养物起始浓度为 0.8 × 106 个细胞/mL，则应离心 20 mL 培养物。
  9. 制备最终的细胞储备培养物。
    1. 将适量细胞在 50 mL 锥形管中以 300 × g 离心 8 分钟。
    2. 小心将上清液倒入废液容器中，轻轻弹击管壁，使沉淀在残留的小体积液体中初步重悬。
    3. 用适量预热至 37 °C 的完全培养基重悬细胞，使培养物达到目标接种密度。该体积已在步骤 2.6 中计算得出。
    4. 盖紧 50 mL 管盖，轻轻倒置数次，充分混匀细胞悬液。
      ​注：若设置完整实验所需体积超过 50 mL，最佳做法是将所需全部细胞在 50 mL 锥形管中离心，并用所需体积的一半重悬。然后充分混匀，并在另一个 50 mL 锥形管中进行 1:2 稀释。例如，若需要 100 mL 培养物（浓度为 0.4 × 106 个细胞/mL），则在 50 mL 管中离心 40 × 106 个细胞，用 50 mL 培养基重悬，取 25 mL 转移至另一 50 mL 管中，再分别向两管中各加入 25 mL 新鲜培养基补足体积。

3. 使用储备细胞培养物接种容器

  1. 从培养箱中取出已加培养基的容器。
  2. 若使用"Flask"对照组，请将上述制备的储备细胞培养物10 mL加入T25悬浮培养瓶中。同时，将10 mL储备细胞培养物加入另一个15 mL锥形管中，用于后续加载至注射器。
  3. 拧开注射器端口盖帽并取下，确保旋塞处于开启位置（图2C）。
  4. 固定容器，小心打开加样口，切勿触碰加样口盖的插销或O型圈。将盖子放置在乙醇垫上，插销/O型圈朝上，以便在填充过程中保持无菌。小心拧下注射器端口的盖帽。
  5. 确保旋塞处于开启位置（图2C）。小心将容器中的培养基倒入废液容器，或使用移液管移除，或使用连接至真空系统的无菌玻璃巴斯德吸管抽吸，过程中避免接触氧合膜。
  6. 将装有储备细胞培养物的50 mL锥形管盖紧，轻轻倒置数次，充分混匀内容物。
  7. 使用一支新的无菌移液管从50 mL管中吸取10 mL细胞培养储备液。拿起容器并倾斜，使加样口朝上，然后通过加样口小心地将细胞培养储备液注入容器中。
    注：操作时需谨慎观察液体体积，避免在倾斜容器时液体从注射器端口溢出。
  8. 加样时应尽量将液体加至加样口边缘顶部但不溢出；随着加样进行，逐渐将容器放回水平位置，以防溢出。切勿让移液管接触氧合膜，因其极为脆弱。
    注：容器加样过程可能需要练习；请耐心缓慢操作。若加样口处形成气泡膜，会影响加样。若出现此情况，可轻轻敲击容器以破坏气泡膜形成的密封。
  9. 容器加样完成后，小心将加样口盖帽重新装回，注意不要触碰插销/O型圈。
  10. 安装注射器。
    注：容器正面有两个注射器端口（图2A）。其中一个连接空注射器，另一个连接装有细胞培养物的注射器（图2E）。
    1. 首先，将3 mL空注射器连接至其中一个注射器端口，确保注射器活塞完全压下。
      注：在将注射器连接至容器前，可在生物安全柜内反复抽推几次，因其初始较紧，需预先润滑以确保顺畅。
    2. 将装有10 mL分装细胞培养物的15 mL锥形管盖紧，轻轻倒置数次，充分混匀内容物。
    3. 接着，小心将第二个3 mL注射器半浸入细胞培养物中吸取部分培养液。为尽量减少注射器顶部的气泡，先将吸取的液体完全排出回管中，再重新吸取3 mL培养物。
    4. 将装满培养物的注射器连接至剩余的注射器端口，然后使用乙醇垫小心对注射器及加样口周围进行消毒。注意避免乙醇接触氧合膜。此时容器已准备好进行除泡操作。
      注：由于15 mL管较深，为第二个容器加载第二个装满的注射器时较为困难。在吸取过程中倾斜锥形管有助于维持注射器与细胞培养物之间的密封。
    5. 对剩余的容器重复步骤3.3–3.10。若最后一个容器的50 mL锥形管中细胞培养物略显不足（例如9.5 mL而非10 mL），可从用于加载注射器的15 mL锥形管中回收剩余培养物补足。
      注： 以下步骤无需在无菌生物安全柜内进行，因为此时容器已成为封闭的无菌系统。

4. 从容器中去除气泡

注意：在此装置中气泡的产生是不可避免的，必须在整个处理过程中持续去除（图3）。有关此问题的更多细节，请参见讨论部分。

  1. 确保注射器端口的旋塞处于关闭位置（图2D），以限制细胞和气泡从注射器迁移到培养腔中。这一点在后续处理过程中尤为重要（下文将讨论）。为收集初始气泡，将培养腔倒置并轻轻敲击其侧面数次。
  2. 迅速将培养腔翻转回正立朝上位置，然后略微倾斜使其开口方向略微朝外，使所有气泡上浮至培养腔的上方一侧（图3B）。
  3. 将气泡引导至空注射器端口下方，并观察其开始进入端口。打开两个注射器端口的旋塞（图2C）。
  4. 轻轻敲击培养腔，促使气泡上浮进入空注射器。缓慢用空注射器吸取较大的气泡，同时小心推动装有液体的注射器活塞，以维持培养腔内的压力，防止氧合膜破裂。
    注意：较大的气泡需要主动吸取，而小气泡和微气泡则可通过将其引导至注射器端口并轻敲培养腔的方式促使其上浮进入注射器。在处理数小时后，必须最大程度减少注射器内细胞与培养腔内细胞之间的"交叉污染"。这是因为注射器中的细胞所获得的氧合程度以及模拟微重力（SMG）暴露条件与培养腔中的细胞不同。
  5. 重复步骤4.2–4.4数次，确保所有气泡均被清除。必须从培养腔中彻底去除所有气泡，包括微气泡。
    注意：当将培养腔朝向光源（如窗户、灯光等）时，可通过氧合膜（培养腔背面）清晰观察到气泡。在执行步骤4.2和4.3时，观察气泡从培养腔背面移动的过程，有助于识别较难看见的气泡。
  6. 当气泡被有效清除后，关闭注射器端口的旋塞。在处理过程中保持注射器连接，以便后续再次清除气泡，并确保两个注射器内的液体体积大致相等。

5. 将容器连接至旋转底座

  1. 用70%乙醇仔细擦拭旋转底座表面和带状电缆。
  2. 确保随附的带状电缆已连接至电源。将旋转底座放入培养箱内，并将带状电缆连接到底座上。确保电源放置在靠近但位于培养箱外部的位置。 图4 为便于说明，图中展示了旋转底座和电源。
  3. 将SMG处理容器的螺纹与底座上的旋转销对齐，然后逆时针轻轻转动旋转销，以固定容器。确保容器已牢固安装。通过向水盘中加入足量经高压灭菌的反渗透（RO）水，确保培养箱内湿度接近100%。
  4. 选择合适的转速（rpm）。调节转速以匹配细胞的沉降速度，使细胞不会 "穿过培养基" 除了终点外，最终沿一条小的轨道路径旋转。该现象在示意图中被可视化呈现 图1.
    注意：该公司建议淋巴细胞的旋转速度从8-10 rpm开始。本实验中NK92细胞以11 rpm旋转，如先前发表的论文所示。17根据细胞大小，较大细胞应提高转速，较小细胞则应降低转速。若所用细胞在培养过程中 tendency 形成团块，也适用相同原则。有关此问题的更多细节，请参见讨论部分。

6. 治疗

  1. 根据所检测的细胞功能/生理学参数，选择适合研究应用的处理时间。有关此问题的更多细节，请参见讨论部分。
    注意：本实验中，NK92细胞接受了72 h的SMG处理，该时间依据先前研究结果确定18,19。处理过程中不可避免地会产生气泡，需及时清除。可短暂停止并重新启动旋转以辅助除泡。安全移除SMG容器的方法见步骤7.1。
  2. 在开始处理的第一天，每隔数小时重复步骤4.2–4.6检查一次气泡形成情况。第一天之后，根据需要（至少每天一次）检查容器，重复步骤4.2–4.6，直至处理结束。

7. 从容器中收获细胞

  1. 当预定的处理时间结束后，停止旋转并拆卸装置。通过轻轻握住SMG处理容器使其保持静止，同时将设备的旋转销顺时针转动，从而取下SMG处理容器。
  2. 将对照组锥形瓶、对照1G容器和经处理的SMG容器转移至无菌生物安全柜中。
  3. 依次处理每个容器（仅限1G和SMG容器，不包括锥形瓶），将其倒置使开口朝下，轻轻敲击使所有细胞重悬。然后将容器侧放，使加样口朝下，再次轻敲容器，促使细胞向加样口集中，以便高效吸取。
  4. 逐一处理每个容器。拧下两个端口上的注射器，并将其丢弃至生物危害废物容器中。打开注射器端口上的旋塞阀。
  5. 小心取下加样口的盖帽，使用无菌的10 mL血清移液管吸取内容物，在排空过程中适当倾斜容器。将"Flask"、"1G"和"SMG"组的内容物分别转移至预先标记的15 mL离心管中。
  6. 盖紧每根离心管，轻轻颠倒数次以确保充分混匀。采用合适的方法测定所得细胞培养物的浓度和活率，为后续实验分析做好准备。

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结果

如果满足以下条件，则认为该培养方法成功：1）对照组之间的细胞增殖情况大致一致（理想情况下所有实验组也应如此）；2）根据接种密度、处理时间以及细胞类型/细胞系的倍增时间，细胞增殖处于适当水平；3）收获细胞的存活率在85%或以上（表1）。理想情况下，所得细胞的健康状态应与标准细胞培养条件下的细胞相当，特别是用于后续实验和检测时（即存活率不低于85%）。若出现相反情况，则认为该培养方法不成功，即细胞发生死亡、对照组间增殖差异显著，或细胞存活率较低（约70%或以下）（表1）。微重力模拟处理组（SMG处理组）的增殖情况可能与对照组存在差异，也可能无明显差异，具体取决于SMG处理对细胞生理状态的影响。然而截至目前，尚未发现此类问题，控制组与处理组之间的细胞增殖情况大致相当（表1）。如前所述，这些参数对于后续检测和实验的成功至关重要，两个对照组所得细胞的表现应相对相似。

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讨论

随着人类为前往月球和火星的长期太空任务做准备，需要开展更多研究以减轻宇航员面临的严重健康风险。影响人体生理的一个主要空间环境因素是微重力。本文介绍了一种细胞培养方法，利用 commercially available rotary cell culture system（商用旋转细胞培养系统）使淋巴细胞暴露于模拟微重力（SMG）条件下。

本方案包含若干关键步骤，可能需要根据所使用的细胞类型或细胞系进行优化。这些步骤包括：1）根据细胞的倍增时间及模拟微重力（SMG）处理时长选择合适的接种密度；2）确定最佳处理时长、转速及适当的对照组。选择处于所研究细胞类型或细胞系适宜浓度范围中段的接种密度通常即可满足要求。然而，若接种密度过低，可能导致细胞增殖能力与存活率下降（表1）；若密度过高，则可能引起营养物质过早耗尽，导致细胞存活率降低。所选接种密度还取决于所研究细胞的倍增时间：倍增时间较短的细胞可采用较低密度接种，而倍增时间较长的细胞则可能需要以较高密度接种。接种密度与处理时长还需根据后续实验检测所需细胞数量来确定。根据经验，将高活力（90%以上）的NK92...

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致谢

本工作由加拿大航天局（CSA）研究基金（17ILSRA3，免疫谱型）资助。作者谨此致谢并感谢多伦多大学的Roxanne Fournier博士、林肯纪念大学的Randal Gregg博士以及亚利桑那大学的Preteesh Mylabathula在本实验方案初期故障排查过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
一次性高纵横比培养容器（HARV）（10 mL）SyntheconD-410经伽马射线灭菌的培养容器（每盒4个）
鲁尔锁扣式注射器（3 mL）BD309657用于连接10 mL HARV
NK92 细胞系ATCCCRL-2407
旋转式细胞培养系统（RCCS）SyntheconRCCS-4D旋转壁式生物反应器；二维回转式模拟微重力装置
Sarsedt 15 mL 锥形离心管Fisher Scientific50-809-220
Sarsedt 50 mL 锥形离心管Fisher Scientific50-809-218
Sarsedt 无菌血清移液管Fisher Scientific86.1254.001
T25 悬浮细胞培养瓶Sarsedt83.3910.502用于培养瓶对照

参考文献

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