本方案描述了一种改进的方法，可提高人多能干细胞（hPSCs）在平面单层培养中衍生的胰腺前体细胞共表达PDX1和NKX6.1转录因子的效率。该方法通过更换新鲜基质、调控细胞密度以及解离内胚层细胞来实现。
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摘要
摘要
人类多能干细胞（hPSCs）是研究早期胰腺发育以及探索糖尿病遗传因素的优良工具。由hPSCs衍生的胰岛素分泌细胞可用于细胞治疗和疾病建模， 然而， 功能特性有限。当人多能干细胞（hPSC）来源的胰腺前体细胞（β细胞及其他内分泌细胞的前体）共表达两种转录因子PDX1和NKX6.1时，可定向分化为具有功能的胰岛素分泌型β细胞 体外 和 体内人多能干细胞（hPSC）分化的胰腺前体细胞目前正作为临床试验的一部分，用于1型糖尿病患者的细胞治疗。然而，现有方案产生的NKX6.1阳性胰腺前体细胞比例较低，导致同时生成大量无功能的内分泌细胞，而能够响应葡萄糖并分泌胰岛素的细胞数量稀少。因此，本研究开发了一种改进的二维单层培养方案，以最大化诱导hPSC来源的胰腺前体细胞中PDX1与NKX6.1的共表达。通过调控细胞密度、新鲜基质的供应以及hPSC来源的内胚层细胞的解离条件，显著提高了所生成胰腺前体细胞中PDX1和NKX6.1的表达水平，并减少了向肝细胞谱系的非目标分化。该研究强调，在细胞分化过程中调控其物理环境可显著影响 体外 分化可影响谱系特化及基因表达。因此，本优化后的实验方案有助于规模化生成共表达PDX1与NKX6.1的前体细胞，用于细胞治疗与疾病建模。
引言
糖尿病是一种复杂的代谢性疾病，影响着全球数百万人。补充胰岛素被认为是治疗糖尿病的唯一方法。更严重的病例则采用β细胞替代疗法，通过移植整个尸体胰腺或胰岛来实现1,2。然而，移植疗法面临诸多问题，例如组织来源的数量和质量受限、移植手术具有侵入性，以及需要长期使用免疫抑制剂。因此，迫切需要探索新型且可替代的β细胞替代治疗策略2,3。近年来，人类多能干细胞（hPSCs）已成为研究人类胰腺生物学的重要工具，同时也被视为一种可持续且可能更具个体化潜力的移植治疗新来源4,5,6,7。hPSCs包括人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导性多能干细胞（hiPSCs），具有强大的自我更新能力，可分化为人体所有类型的组织。hESCs来源于胚胎的内细胞团，而hiPSCs则是通过对任何体细胞进行重编程获得的4,8。
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方案
本研究已获得相应机构研究伦理委员会的批准，并遵循1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版或类似的伦理标准进行。研究方案已获哈马德医疗集团（HMC）机构审查委员会（IRB）（编号16260/16）和卡塔尔生物医学研究所（QBRI）（编号2016-003）批准。本工作适用于H1、H9和HUES8等人胚胎干细胞（hESCs）。血液样本来自哈马德医疗集团（HMC）医院的健康个体，并已获得完全知情同意。诱导多能干细胞（iPSCs）由对照组健康个体的外周血单个核细胞（PBMCs）生成23。
1. 培养基的制备
- 准备人多能干细胞（hPSC）培养基
- 使用 commercially available medium（用于维持和扩增人胚胎干细胞的市售培养基），添加 100 单位/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素（参见材料表），配制 hPSC 培养基。分装后长期保存于 -20 °C，或短期保存于 4 °C 以备即用。
- 配制第 1 阶段分化培养基（用于定型内胚层（DE））。
- 以 MCDB 131 培养基为基础，添加 0.5% 无脂肪酸牛血清白蛋白（FFA-BSA）、1.5 g/L 碳酸氢钠（NaHCO3）、10 mM 葡萄糖、2 mM ....
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结果
结果表明，优化后的方案P2-D（图1A）通过上调PDX1和NKX6.1的共表达，提高了胰腺前体细胞的分化效率（图2A、B和图3A）。特别是，内胚层细胞的解离以及将其重新接种至新鲜基底膜基质上，同时延长第3阶段的培养时间，可增强人多能干细胞来源的胰腺前体细胞中NKX6.1的表达（优化方案P2-D）（图2和 图3A），相较于未进行细胞解离的方案（P1-ND，该方案改编自先前发表的研究27）。本研究改进的方案相比“P1-D”（方案1，S3 = 2天，进行解离）和“P2-ND”（方案2，S3 = 4天，未解离）产生了最高比例的PDX1+/NKX6.1+前体细胞，详细结果此前已有发表21。使.......
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讨论
本研究描述了一种改进的方案，用于从人多能干细胞（hPSCs）高效共表达PDX1和NKX6.1的胰腺前体细胞。将hPSC来源的内胚层细胞以半密度重铺于新鲜基质上进行解离和再接种，可显著提高hPSC来源胰腺前体细胞中PDX1和NKX6.1的表达水平。
尽管各阶段所用的生长因子组合与P1-ND高度相似27，但研究显示，延长第3阶段的处理时间，加入FGF和视黄酸信号通路激活以及BMP和hedgehog信号通路抑制，可提高NKX6.1的表达，这与Nostro等人的研究结果相反27。尽管在胚胎发育过程中胰腺中PDX1的表达受FGF和视黄酸信号的正向调控，并受到BMP和hedgehog信号抑制的影响27,29,30，但本研究结果表明，延长该信号组合处理时间同样可上调NKX6.1的表达。然而，延长第3阶段处理的效果得益.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由卡塔尔国家研究基金（QNRF）资助（项目编号：NPRP10-1221-160041）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 锥形离心管 | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24 孔平底带盖细胞培养板 | Costar | 3524 | |
| 50 mL 锥形离心管 | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6 孔多孔细胞培养板 | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | 用 4 mM HCl 重悬 |
| 抗 NKX6.1 抗体，小鼠单克隆 | DSHB | F55A12-C | 流式细胞术稀释至 1:100，免疫染色稀释至 1:2000 |
| 抗 PDX1 抗体，豚鼠多克隆 | Abcam | ab47308 | 流式细胞术稀释至 1:100，免疫染色稀释至 1:1000 |
| B27（不含维生素 A） | ThermoFisher | 12587010 | |
| 牛血清白蛋白，热激片段，无脂肪酸 | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | 用 DMSO 重悬 |
| DMEM，高糖 | ThermoFisher | 41965047 | |
| 驴抗小鼠 IgG (H + L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| 驴抗兔 IgG (H + L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | 用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬 |
| FGF10 | R&D | 345-FG | 用 PBS 重悬 |
| 葡萄糖 | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| 倒置显微镜 | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR 血清替代物 | Gibco | 10828-028 | |
| L-抗坏血酸（维生素 C） | Sigma | A92902 | 用蒸馏水重悬 |
| Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质 | Corning | 354230 | 将解冻后的原液分装，并于 -20°C 冻存 |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| 小鼠抗 SOX17 | ORIGENE | CF500096 | 流式细胞术稀释至 1:100，免疫染色稀释至 1:2000 |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | 将基础培养基与补充剂混合。分装后可长期保存于 -20 °C，或短期保存于 4 °C 以备即用 |
| Nalgene 滤器，0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| 烟酰胺 | Sigma | 72340 | 用蒸馏水重悬 |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | 用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬 |
| 4% 甲醛 PBS 溶液 | ChemCruz | sc-281692 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | ThermoFisher | 15140122 | |
| 便携式真空吸液器 | |||
| 兔抗 FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | 流式细胞术稀释至 1:100，免疫染色稀释至 1:500 |
| 视黄酸 | Sigma Aldrich | R2625 | 用 DMSO 重悬 |
| ROCK 抑制剂（Y-27632） | ReproCell | 04-0012-02 | 用 DMSO 重悬 |
| 带盖圆底聚苯乙烯 FACS 管，无菌 | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | 用 DMSO 重悬 |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | 将基础培养基与补充剂混合。分装后可长期保存于 -20 °C，或短期保存于 4 °C 以备即用 |
| TALI 细胞分析载片 | Invitrogen | T10794 | |
| Tali 图像型细胞计数仪（自动细胞计数器） | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
参考文献
- Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
- Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J.
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重印与许可
