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人多能干细胞在二维培养系统中向胰腺β细胞前体的分化

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DOI：

10.3791/63298

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2021年12月16日

 , 
1College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation, 2Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF)

本文内容

摘要

本方案描述了一种改进的方法，可提高人多能干细胞（hPSCs）在平面单层培养中衍生的胰腺前体细胞共表达PDX1和NKX6.1转录因子的效率。该方法通过更换新鲜基质、调控细胞密度以及解离内胚层细胞来实现。

摘要

人类多能干细胞（hPSCs）是研究早期胰腺发育以及探索糖尿病遗传因素的优良工具。由hPSCs衍生的胰岛素分泌细胞可用于细胞治疗和疾病建模， 然而， 功能特性有限。当人多能干细胞（hPSC）来源的胰腺前体细胞（β细胞及其他内分泌细胞的前体）共表达两种转录因子PDX1和NKX6.1时，可定向分化为具有功能的胰岛素分泌型β细胞 体外 和 体内人多能干细胞（hPSC）分化的胰腺前体细胞目前正作为临床试验的一部分，用于1型糖尿病患者的细胞治疗。然而，现有方案产生的NKX6.1阳性胰腺前体细胞比例较低，导致同时生成大量无功能的内分泌细胞，而能够响应葡萄糖并分泌胰岛素的细胞数量稀少。因此，本研究开发了一种改进的二维单层培养方案，以最大化诱导hPSC来源的胰腺前体细胞中PDX1与NKX6.1的共表达。通过调控细胞密度、新鲜基质的供应以及hPSC来源的内胚层细胞的解离条件，显著提高了所生成胰腺前体细胞中PDX1和NKX6.1的表达水平，并减少了向肝细胞谱系的非目标分化。该研究强调，在细胞分化过程中调控其物理环境可显著影响 体外 分化可影响谱系特化及基因表达。因此，本优化后的实验方案有助于规模化生成共表达PDX1与NKX6.1的前体细胞，用于细胞治疗与疾病建模。

引言

糖尿病是一种复杂的代谢性疾病，影响着全球数百万人。补充胰岛素被认为是治疗糖尿病的唯一方法。更严重的病例则采用β细胞替代疗法，通过移植整个尸体胰腺或胰岛来实现1,2。然而，移植疗法面临诸多问题，例如组织来源的数量和质量受限、移植手术具有侵入性，以及需要长期使用免疫抑制剂。因此，迫切需要探索新型且可替代的β细胞替代治疗策略2,3。近年来，人类多能干细胞（hPSCs）已成为研究人类胰腺生物学的重要工具，同时也被视为一种可持续且可能更具个体化潜力的移植治疗新来源4,5,6,7。hPSCs包括人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导性多能干细胞（hiPSCs），具有强大的自我更新能力，可分化为人体所有类型的组织。hESCs来源于胚胎的内细胞团，而hiPSCs则是通过对任何体细胞进行重编程获得的4,8。

定向分化方案经过优化，可将人多能干细胞（hPSCs）依次引导通过胰腺发育的各个阶段，从而生成胰岛β细胞 体外这些方案可生成由人多能干细胞（hPSC）衍生的胰岛类器官。尽管这些方案在提高其中胰腺β细胞比例方面已有显著改进，但其效率仍存在高度变异性，胰岛类器官中NKX6.1+/INSULIN+或C-PEPTIDE+细胞的比例通常无法提升至40%以上。5,9,10,11,12,13然而，这些生成的β细胞在转录和代谢特征以及对葡萄糖的反应方面，与成人人类β细胞并不完全相同。4,5,14hPSC 分化而来的 β 细胞与成人胰岛相比，缺乏关键 β 细胞标志物的基因表达，如 PCSK2、PAX6、UCN3、MAFA、G6PC2 和 KCNK35此外，由hPSC分化而来的β细胞在响应葡萄糖时钙信号减弱。这些细胞中混有同时产生的多激素细胞，后者无法在葡萄糖浓度升高时分泌适量的胰岛素。5另一方面，由人多能干细胞（hPSC）衍生的胰腺前体细胞（即胰岛前体细胞）可更高效地生成 体外 与β细胞相比，且在移植后 体内，可成熟为具有功能的、分泌胰岛素的β细胞15,16目前，临床试验主要致力于验证其在1型糖尿病（T1D）受试者移植后的安全性和有效性。

值得注意的是，在同一胰腺前体细胞中转录因子PDX1（胰腺和十二指肠同源框1）和NKX6.1（NKX6同源框1）的表达对于向β细胞谱系分化至关重要5。未能表达NKX6.1的胰腺前体细胞将分化为多激素内分泌细胞或无功能的β细胞17,18。因此，在胰腺前体细胞阶段实现PDX1和NKX6.1的高共表达，是最终生成大量功能性β细胞的关键。研究表明，在类胚体或三维培养体系中，分化细胞发生聚集，可增强胰腺前体细胞中PDX1和NKX6.1的表达，PDX1+/NKX6.1+细胞群体的比例可达40%–80%12,19。然而，与悬浮培养相比，二维分化培养在多种细胞系的应用中更具成本效益、可行性更高且操作更便捷5。我们近期的研究表明，单层分化培养可获得超过90%的PDX1+/NKX6.1+共表达人多能干细胞（hPSC）来源的胰腺前体细胞20,21,22。该方法赋予所生成的胰腺前体细胞较强的增殖能力，并可防止向其他谱系（如肝细胞谱系）分化21。因此，本方案展示了一种高效的人多能干细胞向共表达PDX1和NKX6.1的胰腺β细胞前体分化的技术。该方法通过解离hPSC来源的内胚层并调控细胞密度，随后延长FGF和类视黄醇信号通路的激活并抑制Hedgehog信号通路，以促进PDX1和NKX6.1的共表达（图1）。该技术可用于规模化生成hPSC来源的胰腺β细胞前体，服务于移植治疗及疾病建模研究。

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方案

本研究已获得相应机构研究伦理委员会的批准，并遵循1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版或类似的伦理标准进行。研究方案已获哈马德医疗集团（HMC）机构审查委员会（IRB）（编号16260/16）和卡塔尔生物医学研究所（QBRI）（编号2016-003）批准。本工作适用于H1、H9和HUES8等人胚胎干细胞（hESCs）。血液样本来自哈马德医疗集团（HMC）医院的健康个体，并已获得完全知情同意。诱导多能干细胞（iPSCs）由对照组健康个体的外周血单个核细胞（PBMCs）生成23。

1. 培养基的制备

  1. 准备人多能干细胞（hPSC）培养基
    1. 使用 commercially available medium（用于维持和扩增人胚胎干细胞的市售培养基），添加 100 单位/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素（参见材料表），配制 hPSC 培养基。分装后长期保存于 -20 °C，或短期保存于 4 °C 以备即用。
  2. 配制第 1 阶段分化培养基（用于定型内胚层（DE））。
    1. 以 MCDB 131 培养基为基础，添加 0.5% 无脂肪酸牛血清白蛋白（FFA-BSA）、1.5 g/L 碳酸氢钠（NaHCO3）、10 mM 葡萄糖、2 mM Glutamax、100 单位/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素，配制基础培养基（参见材料表）。使用 0.2 µm 滤器过滤所配制的培养基，并于 4 °C 保存。
    2. 将步骤 1.2.1 配制的基础培养基预热至 37 °C，然后添加 2 µM CHIR99021、100 ng/mL Activin A、10 µM Rock 抑制剂（Y-27632）和 0.25 mM 维生素 C，配制成含 CHIR99021 的第 1 阶段培养基（参见材料表）。充分混匀后用铝箔包裹，避光保存。
      注：该培养基仅在分化第一天使用。
    3. 将基础培养基预热至 37 °C，添加 100 ng/mL Activin A 和 0.25 mM 维生素 C，充分混匀，配制成不含 CHIR99021 的第 1 阶段培养基。
      注：可选择性地向该培养基中添加 5 ng/mL 碱性 FGF（或 FGF2）。该培养基用于第 1 阶段其余天数。
  3. 配制第 2 阶段分化培养基（用于原始肠管；PGT）。
    1. 将基础培养基预热至 37 °C，添加 50 ng/mL FGF10、50 ng/mL NOGGIN、0.25 µM CHIR99021、10 µM Y-27632（Rock 抑制剂）和 0.25 mM 维生素 C，配制成含 Rock 抑制剂的第 2 阶段分化培养基。
      注：该培养基用于内胚层细胞解离当天。
    2. 按照步骤 1.3.1 的相同方法配制第 2 阶段分化培养基，但不添加 Rock 抑制剂。
      注：该培养基用于第 2 阶段的第二天。
  4. 配制第 3 阶段分化培养基（用于后部前肠）。
    1. 配制含 4.5 g/L 葡萄糖的 DMEM 培养基，然后添加 1% 青霉素-链霉素和 2 mM Glutamax，作为第 3 和第 4 阶段的基础培养基。
    2. 将步骤 1.4.1 配制的 DMEM 培养基预热，添加 2 µM 视黄酸、0.25 µM SANT-1、50 ng/mL FGF10、50 ng/mL NOGGIN、0.25 mM 维生素 C 和 1% 不含维生素 A 的 B27 添加剂（参见材料表）。
      注：该培养基用于 P2-D（方案 2，优化，解离）的第 3 阶段 4 天，以及 P1-ND（方案 1，非优化，非解离）的第 3 阶段 2 天。
  5. 配制第 4 阶段分化培养基（用于胰腺前体细胞）。
    1. 在含 4.5 g/L 葡萄糖的 DMEM 培养基中添加 100 ng/mL EGF、10 mM 烟酰胺、50 ng/mL NOGGIN、0.25 mM 维生素 C 和 1% 不含维生素 A 的 B27 添加剂（参见材料表）。该培养基用于第 4 阶段的所有天数。
      注：所有试剂应保存在适当温度下，细胞因子和敏感试剂需分装保存。在更换分化培养基时，将分装的试剂解冻后加入基础培养基中。不同分化培养基的组成详见表 1。

2. 准备包被基底膜基质的培养皿

  1. 在冰上解冻市售基底膜基质（见材料表），分装后于 -20 °C 冻存。
  2. 包被组织培养皿前，将冻存的分装基质在冰上解冻。取适量基底膜基质溶液加入预冷的 KO-DMEM/F-12 培养基（KnockOut DMEM/F-12）（见材料表），稀释至所需浓度，并充分混匀。将稀释后的基质溶液于 4 °C 保存，以备立即使用。
  3. 用稀释后的基底膜基质溶液覆盖组织培养处理过的培养板表面（见材料表），于 37 °C 孵育至少 60 分钟后再接种细胞。进行胰腺分化实验时，使用 1:50 的基底膜基质溶液与 KO-DMEM/F-12 的稀释比例；扩增未分化 hPSCs 时，使用 1:80 的稀释比例。

3. 未分化人多能干细胞的培养

  1. 当hPSC细胞集落达到70%–80%融合度时进行传代。
  2. 传代时，用预热的PBS洗涤hPSC一次，使用组织培养罩内的便携式真空抽吸装置吸除液体，然后加入含0.5 mM EDTA的PBS溶液覆盖集落表面。在37 °C、5% CO2条件下孵育1分钟，或直至集落边缘从培养皿表面脱离。
  3. 移除EDTA溶液，使用P1000移液器将正在脱落的集落收集至hPSC培养基中。在室温下以128 × g离心4分钟。弃去上清液，向细胞中加入含有10 µM Y-27632（ROCK抑制剂）的hPSC培养基23,24。
    ​注意：将hPSC以至少1:3的比例传代至经1:80基底膜基质包被的培养皿中。然而，对于分化实验，应将hPSC接种于1:50包被的培养皿上。

4. 人多能干细胞中定型内胚层（DE）分化的诱导（第一阶段）

  1. 当hPSC集落达到70%-80%融合度时，在生物安全柜内用预热的PBS洗涤两次，并使用便携式真空抽吸器抽吸，以开始第1阶段分化。
  2. 向集落中加入含有CHIR99021（来自步骤1.2.2）的第1阶段分化培养基，每6孔板加入2 mL，于37 °C孵育24 h。
  3. 次日，用不含CHIR99021的第1阶段分化培养基（步骤1.2.3）替换旧培养基。
  4. 每隔24 h，在生物安全柜内使用便携式真空抽吸器吸除旧培养基，并更换为新鲜的不含CHIR99021的第1阶段分化培养基。
    ​注意：第1阶段最长可延长至4天。具体时长取决于所使用的hPSC细胞系，应相应优化。

5. 人多能干细胞分化为定型内胚层（第一阶段）的免疫荧光分析

  1. 进行免疫荧光染色时，在组织培养超净台内使用便携式真空抽吸装置吸除孔板中的废弃培养基，并用预热的 PBS 洗涤两次。轻轻摇晃孔板以去除细胞碎片。
  2. 用 4% 多聚甲醛（PFA）覆盖孔板表面，以固定定型内胚层（DE）细胞；例如，向 24 孔板的每个孔中加入 250 µL PFA。将孔板置于 20 × g 的二维摇床上固定 20 分钟。
  3. 固定完成后，用含 0.5% Tween 的 Tris 缓冲盐水（TBST）洗涤 DE 细胞（参见材料表），并将孔板置于 20 × g 摇床上振荡 10 分钟。重复此步骤一次。
  4. 通过加入足量含 0.5% Triton X-100 的磷酸盐缓冲盐水（PBST）对固定后的细胞进行通透处理；例如，向 24 孔板的每个孔中加入 1 mL PBST，并将孔板放回 20 × g 摇床上振荡 20 分钟。
  5. 新鲜配制含 5%-6% BSA 的 PBST 作为封闭缓冲液，并加入通透后的细胞中。将孔板置于摇床上，在封闭液中孵育至少 1 小时。
  6. 将针对 SOX17 和 FOXA2 的一抗混合稀释（参见材料表），稀释于含 2%-3% BSA 的 PBST 溶液中。将混合后的一抗加入已封闭的细胞孔中，并将孔板置于 4 °C 条件下，在低速轻柔振荡环境中过夜孵育。
    NOTE: SOX17 和 FOXA2 是公认的定型内胚层标志物25,26。
  7. 次日，使用便携式真空过滤装置吸除一抗溶液，并用 TBST 在摇床上洗涤孔板三次，每次洗涤 10 分钟。
  8. 将 Alexa Fluor 488 和 568 标记的二抗（参见材料表）按 1:500 比例稀释于 PBST 中，所选二抗需针对一抗的宿主物种。
  9. 将混合的二抗溶液加入染色孔中，并用铝箔包裹孔板以避光。将孔板置于摇床上，室温孵育 1 小时。
  10. 使用便携式真空过滤装置吸除二抗溶液，并在摇床上用 TBST 洗涤染色孔，每次 10 分钟，共洗涤三次，每次均用铝箔覆盖孔板以避光。
  11. 在 PBS 中新鲜配制 1 µg/mL 的 Hoechst 33342 溶液用于细胞核染色。将 Hoechst 溶液加入各孔中，并将孔板置于摇床上振荡 2-3 分钟。
  12. 使用便携式真空过滤装置吸除 Hoechst 溶液，并用 PBS 洗涤孔板两次。
  13. 最后，向染色后的细胞孔中加入 PBS，并在避光条件下使用倒置荧光显微镜（参见材料表）进行成像。未进行成像时，应始终用铝箔覆盖孔板，以尽量减少荧光染料的光漂白。
    ​NOTE: 也可采用流式细胞术评估定型内胚层分化效率，方法见步骤 9.2。

6. 由人多能干细胞（hPSCs）生成原始肠管（PGT）（第二阶段）

注意：如果步骤 5.13 中的免疫荧光分析结果显示 SOX17 与 FOXA2 的共表达率达到 80% 或以上，则实验进入第 2 阶段；如果效率 <80%，则将第 1 阶段持续时间延长至 4 天。

  1. 在第2阶段的第1天，使用TrypLE或Accutase（见材料表）对hPSC来源的内胚层细胞进行消化，以用于优化的P2-D方案。用预热的PBS洗涤贴壁细胞，然后在37 °C、5% CO2条件下，每6孔板孔加入1 mL预热的TrypLE或Accutase溶液，孵育3–5分钟，直至细胞开始彼此分离。
  2. 将孔中脱落的细胞片或单层细胞进一步解离，然后使用不含细胞因子但含有至少0.5%胎牛血清（FBS）或KnockOut血清（KOSR）的基础Stage 1/2培养基（见材料表），将细胞收集至15 mL聚丙烯离心管中。
  3. 在4 °C下以800 × g离心5分钟，弃去上清液。加入1 mL无菌PBS，将细胞沉淀重悬为单细胞悬液。
  4. 使用自动细胞计数仪（见材料表），将推荐体积的细胞悬液加入计数板室中进行细胞计数。将重悬的细胞在4 °C下以800 × g离心5分钟，弃去上清液。
  5. 将细胞沉淀重悬于适量体积的Stage 2分化培养基中，加入Rho激酶抑制剂（Rock inhibitor），细胞密度为2.5–3.5 × 105 个细胞/cm2。
    注意：对于大多数细胞系，此细胞数量相当于1:2的传代比例，具体取决于细胞增殖速率。最终每孔加入总体积为2 mL的含重悬细胞的培养基，接种于6孔板的一个孔中。
  6. 将重悬的细胞接种至已涂覆1:50基底膜基质的培养板（按步骤2制备）上，置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。
  7. 24小时后，更换为不含Rho激酶抑制剂的Stage 2分化培养基（按步骤1.3.2制备）。

7. 由 hPSCs 生成后部前肠（第 3 阶段）

  1. 在生物安全柜内使用便携式真空抽吸装置吸除第二阶段废弃培养基，并用预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
  2. 向细胞中加入步骤1.4配制的第三阶段分化培养基，于37 °C、5% CO2条件下孵育。
  3. 24小时后，更换为新鲜配制的第三阶段分化培养基。P2-D方案（优化方案）共重复此步骤4天，而非解离的P1-ND方案仅重复2天。

8. 由hPSCs生成胰腺前体细胞（第4阶段）

  1. 经过3阶段处理4天后，用预热的PBS洗涤细胞，轻轻摇晃培养板，并使用便携式真空抽吸器抽吸。然后向细胞中加入步骤1.5配制的4阶段分化培养基。
  2. 24小时后，用新配制的4阶段培养基更换用过的培养基。重复此步骤，共持续4天。

9. 评估由人多能干细胞生成胰腺前体细胞的分化效率

  1. 对人多能干细胞（hPSC）分化的胰腺前体细胞（第4阶段）进行免疫荧光分析，检测PDX1和NKX6.1的表达。
    注意：PDX1和NKX6.1是公认的胰腺前体细胞标志物17,18。
    1. 按照步骤5进行固定、通透、封闭以及抗体孵育和洗涤。
    2. 使用PDX1和NKX6.1抗体组合（见材料表）对hPSC分化的胰腺前体细胞进行染色，抗体用含2%-3% BSA的PBST稀释。
    3. 使用适当比例为1:500的Alexa Fluor 488和568标记的二抗（见材料表）。
  2. 对hPSC分化的胰腺前体细胞进行流式细胞术分析，检测PDX1和NKX6.1的表达。
    注意：对所获得的hPSC来源胰腺前体细胞中的胰腺标志物进行流式细胞术分析，可定量分析共表达PDX1和NKX6.1的细胞比例。
    1. 第4阶段结束时，用预热的PBS洗涤细胞两次，加入足量TrypLE或Accutase覆盖孔底表面，例如每孔6孔板加入1 mL TrypLE或Accutase。将培养板放入培养箱中孵育5-7分钟，或直至细胞从表面脱落。
    2. 使用P1000移液器在孔内将贴壁的细胞片层吹打分散，然后收集至15 mL聚丙烯离心管中。
    3. 在4 °C条件下以800 × g离心5分钟，沉淀hPSC来源的胰腺前体细胞，弃去上清液。用PBS重悬细胞并吹打成单细胞悬液进行洗涤。使用自动细胞计数仪（见材料表）计数细胞，并记录每毫升的细胞浓度。
    4. 在4 °C条件下以800 × g离心5分钟，弃去上清液。向沉淀中加入200 µL预冷的PBS并吹打重悬。
    5. 将离心管置于低至中等转速（室温下约400 × g）的涡旋振荡器上，逐滴加入2 mL预冷的80%乙醇。盖紧管盖，将离心管略微倾斜放置于4 °C摇床中过夜。
    6. 在4 °C条件下以800 × g离心5分钟，用PBS洗涤细胞，吹打以分散任何固定的细胞团块。
    7. 用含5%-6% BSA的PBST溶液在室温下封闭固定后的细胞至少1小时，或在4 °C摇床上过夜。
    8. 按照以下步骤对胰腺前体细胞标志物进行染色。
      1. 将每种条件下的200,000个细胞（包括根据一抗宿主物种IgG亚类设置的同型对照、未染色对照和仅二抗对照）分装至96孔V型底板或1.5 mL离心管中。
      2. 在4 °C条件下以800 × g离心5分钟，迅速翻转平板以弃去上清液，避免丢失细胞沉淀。将一抗用含3% BSA的溶液稀释后加入（见材料表）。
        注意：一抗的稀释比例可在1:50至1:200之间。
      3. 将染色后的细胞在室温下于摇床上低速轻柔振荡孵育至少2小时，或在4 °C过夜。
      4. 用TBST通过反复吹打洗涤染色细胞三次。离心并按步骤9.2.8.2的方法弃去上清液。
      5. 加入用PBS配制的1:500稀释比例的二抗（Alexa Fluor 488和647标记的抗体）（见材料表），室温孵育30分钟。
      6. 用TBST通过反复吹打至少洗涤染色细胞两次。离心并按步骤9.2.8.2的方法弃去上清液。
      7. 将染色后的细胞重悬于至少100 µL PBS中，转移至避光的FACS管中（见材料表），并在流式细胞仪上检测样本。

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结果

结果表明，优化后的方案 P2-D（图1A) 通过上调PDX1和NKX6.1的共表达，提高了胰腺前体细胞的分化效率（图 2A，B，以及 图 3A）。特别是结果表明，将内胚层细胞解离后重新接种于新鲜基底膜基质上，并延长第3阶段的培养时间，可增强人多能干细胞衍生的胰腺前体细胞中NKX6.1的表达（优化方案，P2-D）。图2 和 图3A），与先前已发表研究中修改而来的非解离方案（P1-ND）相比27. 本改进方案产生的 PDX1+/NKX6.1+ 祖细胞比例较其他方法更高 "P1-D" （方案1，S3 = 2天，解离）和 "P2-ND" （方案2，S3=4天，未解离），详细结果此前已发表

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讨论

本研究描述了一种改进的方案，用于从人多能干细胞（hPSCs）高效共表达PDX1和NKX6.1的胰腺前体细胞。将hPSC来源的内胚层细胞以半密度重铺于新鲜基质上进行解离和再接种，可显著提高hPSC来源胰腺前体细胞中PDX1和NKX6.1的表达水平。

尽管各阶段所用的生长因子组合与P1-ND高度相似27，但研究显示，延长第3阶段的处理时间，加入FGF和视黄酸信号通路激活以及BMP和hedgehog信号通路抑制，可提高NKX6.1的表达，这与Nostro等人的研究结果相反27。尽管在胚胎发育过程中胰腺中PDX1的表达受FGF和视黄酸信号的正向调控，并受到BMP和hedgehog信号抑制的影响27,29,30，但本研究结果表明，延长该信号组合处理时间同样可上调NKX6.1的表达。然而，延长第3阶段处理的效果得益...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由卡塔尔国家研究基金（QNRF）资助（项目编号：NPRP10-1221-160041）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 锥形离心管Thermo Scientific339651
20X TBS Tween 20Thermo Scientific28360
24 孔平底带盖细胞培养板Costar3524
50 mL 锥形离心管Thermo Scientific339652
6 孔多孔细胞培养板Thermo Scientific140685
AccutaseStem Cell Technologies0-7920
Activin AR&D338-AC用 4 mM HCl 重悬
抗 NKX6.1 抗体，小鼠单克隆DSHBF55A12-C流式细胞术稀释至 1:100，免疫染色稀释至 1:2000
抗 PDX1 抗体，豚鼠多克隆Abcamab47308流式细胞术稀释至 1:100，免疫染色稀释至 1:1000
B27（不含维生素 A）ThermoFisher12587010
牛血清白蛋白，热激片段，无脂肪酸SigmaA7030
CHIR 99021Tocris4423用 DMSO 重悬
DMEM，高糖ThermoFisher41965047
驴抗小鼠 IgG (H + L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568InvitrogenA10037
驴抗兔 IgG (H + L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488A-21206
DPBS 1XThermoFisher14190144
EGFThermoFisherPHG0313用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬
FGF10R&D345-FG用 PBS 重悬
葡萄糖Sigma AldrichG8644
Hoechst 33258Sigma23491-45-4
倒置显微镜OlympusIX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X)Gibco12660-012
KnockOut SR 血清替代物Gibco10828-028
L-抗坏血酸（维生素 C）SigmaA92902用蒸馏水重悬
Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质Corning354230将解冻后的原液分装，并于 -20°C 冻存
MCDB131ThermoFisher10372019
小鼠抗 SOX17ORIGENECF500096流式细胞术稀释至 1:100，免疫染色稀释至 1:2000
mTeSR PlusStem Cell Technologies85850将基础培养基与补充剂混合。分装后可长期保存于 -20 °C，或短期保存于 4 °C 以备即用
Nalgene 滤器，0.2 µm PESThermoFisher566-0020
烟酰胺Sigma72340用蒸馏水重悬
NOGGINR&D6057-NG用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬
4% 甲醛 PBS 溶液ChemCruzsc-281692
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）ThermoFisher15140122
便携式真空吸液器
兔抗 FOXA2Cell signaling technology3143流式细胞术稀释至 1:100，免疫染色稀释至 1:500
视黄酸Sigma AldrichR2625用 DMSO 重悬
ROCK 抑制剂（Y-27632）ReproCell04-0012-02用 DMSO 重悬
带盖圆底聚苯乙烯 FACS 管，无菌Stellar ScientificFSC-9010
SANT-1Sigma AldrichS4572用 DMSO 重悬
碳酸氢钠SigmaS5761-500G
StemFlexThermoFisherA3349401将基础培养基与补充剂混合。分装后可长期保存于 -20 °C，或短期保存于 4 °C 以备即用
TALI 细胞分析载片InvitrogenT10794
Tali 图像型细胞计数仪（自动细胞计数器）InvitrogenT10796
Triton X-100Sigma9002-93-1
TrypLE 100 mLThermoFisher12563011
Tween 20SigmaP2287
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0Invitrogen15575-038

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