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方法文章

利用聚乙烯亚胺纳米颗粒在多种肾病小鼠模型中向肾脏递送外源性人工合成的miRNA模拟物

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DOI：

10.3791/63302

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2022年5月10日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在此，我们将外源性人工合成的miRNA模拟物递送至肾脏 通过 在多种肾脏疾病小鼠模型中，通过尾静脉注射非病毒载体和聚乙烯亚胺纳米颗粒，导致肾脏中靶向miRNA显著过表达，从而抑制了多种小鼠模型中肾脏疾病的进展。

摘要

microRNAs （miRNAs）是一类小分子非编码RNA（21-25个碱基），不翻译为蛋白质，可通过使多种信使RNA（mRNAs）失稳并抑制其翻译，在多种肾脏疾病中调控大量靶基因。因此，通过外源性人工合成的miRNA模拟物改变miRNA表达水平，可能成为抑制多种肾脏疾病进展的一种有效治疗策略。然而，由于血清RNA酶会迅速降解经系统给药的外源性miRNA模拟物 体内然而，将miRNA递送至肾脏仍面临挑战。因此，需要能够保护外源性miRNA模拟物免受RNA酶降解并有效递送至肾脏的载体。许多研究采用病毒载体将外源性miRNA模拟物或抑制剂递送至肾脏，但病毒载体可能引发干扰素反应和/或导致基因组不稳定。因此，病毒载体的开发也阻碍了外源性miRNA模拟物或抑制剂的临床应用。为克服病毒载体相关的这些问题，我们开发了一种非病毒载体方法，即通过尾静脉注射聚乙烯亚胺纳米颗粒（PEI-NPs）将miRNA模拟物递送至肾脏，该方法在多种小鼠肾脏疾病模型中均实现了靶向miRNA的显著过表达。

引言

miRNA是一类小分子非编码RNA（21-25个碱基），不能被翻译成蛋白质，可通过使多种肾脏疾病中的靶标信使RNA（mRNA）失稳并抑制其翻译，从而抑制大量靶标mRNA1,2。因此，利用外源性人工合成的miRNA模拟物或抑制剂进行基因治疗，可能是抑制多种肾脏疾病进展的一种潜在新策略3,4,5。

尽管miRNA模拟物或抑制剂在基因治疗中具有广阔前景，但将其递送至靶器官仍是开发其临床潜力的体内实验中的一大难题。由于人工合成的miRNA模拟物或抑制剂易被血清RNase迅速降解，其在体内全身给药后的半衰期显著缩短6。此外，在缺乏合适载体的情况下，miRNA模拟物或抑制剂穿越细胞膜并转染至细胞质的效率通常很低7,8。这些证据表明，有必要开发针对肾脏的miRNA模拟物或抑制剂递送系统，以推动其在临床中的应用，并为各类肾病患者提供新的治疗选择。

病毒载体已被用作将外源性miRNA模拟物或抑制剂递送至肾脏的载体9,10。尽管病毒载体在生物安全性和转染效率方面已有改进，但仍可能引发干扰素反应和/或导致基因组不稳定11,12。为克服这些问题，我们开发了一种基于聚乙烯亚胺纳米颗粒（PEI-NPs）的非病毒载体系统，用于在多种小鼠肾脏疾病模型中向肾脏递送miRNA模拟物13,14,15。

PEI-NPs 是基于线性聚合物的纳米颗粒，可有效将包括miRNA模拟物在内的寡核苷酸递送至肾脏，由于其长期安全性和生物相容性，被认为更适合用于制备非病毒载体13,16,17。

本研究展示了利用PEI-NPs进行系统性外源miRNA模拟物递送的效果 通过 通过单侧输尿管梗阻（UUO）建立肾纤维化模型小鼠，并进行尾静脉注射。此外，我们展示了利用PEI-NPs进行系统性外源miRNA模拟物递送的效果 通过 糖尿病肾病模型小鼠（db/db 小鼠：C57BLKS/J）尾静脉注射 Iar -+Leprdb/+Leprdb以及通过肾缺血-再灌注损伤（IRI）构建的急性肾损伤模型小鼠。

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方案

所有动物实验方案均经日本医科大学动物伦理委员会批准，并依照日本医科大学实验动物使用与护理指南进行。本研究展示了通过UUO小鼠模型将miRNA模拟物递送至肾脏，从而实现其过表达的方法。本研究已获得日本医科大学伦理委员会批准［批准编号：19-12（肾纤维化）、17-024（急性肾损伤，AKI）和19-11（糖尿病肾病）］。

1. PEI-NPs-miRNA-mimic 复合物的制备

注意：此处描述的是为一只小鼠制备 PEI-NPs-miRNA-mimic13,14,15 和 PEI-NPs-control-miRNA（作为阴性对照）的方法。

  1. 准备以下物品：
    1. 准备 10 µL 线性 PEI-NPs。
    2. 准备 50 µL 溶解于无核酸酶水中的人工合成 miRNA，浓度为 100 µM（5 nmol miRNA 溶解于 50 µL 无核酸酶水中）。
    3. 准备 50 µL 溶解于无核酸酶水中的人工合成对照（非靶向）miRNA，浓度为 100 µM（5 nmol miRNA 溶解于 50 µL 无核酸酶水中）。
    4. 准备 5% 和 10% 葡萄糖溶液。确保备有 1.5 mL 微量离心管和涡旋混合器。
  2. 在 1.5 mL 微量离心管中，将 10 µL PEI-NPs 溶解于 90 µL 5% 葡萄糖溶液中。然后轻轻涡旋混匀，并短暂离心。
  3. 在 1.5 mL 微量离心管中，将 50 µL 溶解于无核酸酶水中的人工合成 miRNA（5 nmol，浓度为 100 µM）与 50 µL 10% 葡萄糖溶液混合。然后轻轻涡旋混匀，并短暂离心。此步骤得到溶于 5% 葡萄糖溶液中的 miRNA。
  4. 将 100 µL 溶于 5% 葡萄糖溶液的 PEI-NPs 与 100 µL 溶于 5% 葡萄糖溶液的 miRNA 模拟物（5 nmol）混合。然后轻轻涡旋混匀，并短暂离心。
  5. 将混合物在室温（RT）下孵育 15 分钟，以形成稳定的 PEI-NPs-miRNA 模拟物复合物。该溶液中 PEI-NPs 与 miRNA 模拟物（5 nmol）的氮（N）与磷酸根（P）摩尔比（N/P 比）为 6（图 1）。
    注意：PEI-NPs-对照 miRNA 复合物可采用本方案中所述的步骤 1.1–1.5 制备，适用于本文所述的所有肾脏疾病小鼠模型（UUO、糖尿病肾病和急性肾损伤）。一次注射的 PEI-NP-miRNA 模拟物体积相当于 5 nmol miRNA 模拟物与 PEI-NPs 在 N/P 比为 6 时的结合量。每种 PEI-NP-miRNA 模拟物的注射持续时间和频率取决于其应用的疾病模型。

2. 通过PEI-NP确认miRNA模拟物在UUO小鼠肾脏中的有效递送 通过 利用荧光显微镜进行尾静脉注射

注意：此处详细阐述了将人工纯化的miRNA模拟物递送至肾脏的方法，表明该方法可用于建立多种肾脏疾病的治疗策略。简言之，通过尾静脉向单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠注射含有100 µL PEI-NPs的氰3号羧酸（Cy3）标记miRNA模拟物。通过荧光显微镜确认其在肾脏中的递送效果。本文描述了单只小鼠所用的PEI-NPs-氰3号羧酸（Cy3）标记miRNA模拟物（寡核苷酸）的制备方法。该方法可在多种小鼠模型（如UUO小鼠、糖尿病肾病小鼠以及由缺血-再灌注损伤（IRI）诱导的急性肾损伤（AKI）小鼠）中高效地将miRNA模拟物递送至肾脏。本视频演示中采用的是UUO小鼠模型。UUO模型的建立方法此前已有报道13。请在UUO手术后六天内执行以下操作步骤。

  1. 准备以下物品：
    1. 制备2 µL PEI-NPs和100 µL Cy3标记的双链寡核苷酸[Cy3标记的miRNA模拟物（1 nmol；10 µM）]。
    2. 配制5%和10%的葡萄糖溶液。确保备有1.5 mL微量离心管和涡旋振荡器。
    3. 使用带小孔的50 mL塑料离心管以分离UUO小鼠的尾静脉。
    4. 用于荧光显微镜观察，准备最佳切割温度（OCT）包埋剂、冷冻切片机、液氮、磷酸盐缓冲液（PBS）、带27 G针头的1.0 mL注射器以及硅烷涂层载玻片。
      注意：荧光素标记的 Lotus tetragonolobus 凝集素（近端小管标志物）和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）可用于近端小管和细胞核的可选染色。
  2. 在1.5 mL微量离心管中，将2 µL PEI-NPs溶解于98 µL 10%葡萄糖溶液中。随后轻轻涡旋混匀，并离心沉降。
  3. 向100 µL 10%葡萄糖溶液中的PEI-NPs（步骤2.2制备）中加入100 µL Cy3标记的miRNA模拟物，轻轻涡旋混匀后离心。
  4. 在室温下孵育混合物15分钟，以制备稳定的PEI-NPs-Cy3标记的miRNA模拟物复合物。
  5. 将UUO小鼠头部朝前放入50 mL离心管中，无需麻醉，然后将尾巴穿过管盖上预先打好的孔。
  6. 用1 mL注射器配27 G针头，吸取200 µL PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic复合物。
  7. 注射 PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic（200 µL） 通过 使用带有27 G针头的1.0 mL注射器注射至小鼠尾静脉。
    注意：用浸有70%-80%乙醇的棉球擦拭尾静脉，以扩张尾静脉并消毒注射区域。
  8. 注射200 µL PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic复合物1小时后，使用适合小型动物的麻醉装置，通过异氟烷（4%-5%）对小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏反射消失确认麻醉深度。手术过程中以异氟烷（3%）维持麻醉状态。
  9. 接下来，使用手术剪和镊子切开皮肤、肌肉和肋骨，暴露心脏。切开右心房后，向左心室注入PBS，以灌注全身血液，直至肾脏颜色变为淡黄色（表明整个小鼠体内已完全灌注PBS）。
    注意：心脏灌注的目的是有效清除全身的血液。
  10. 停止异氟烷麻醉，取出小鼠肾脏并用PBS洗涤。随后剥离肾脏的肾包膜，并用PBS再次洗涤肾脏两次。
  11. 将肾组织样本包埋于OCT包埋剂中，并在液氮中冷冻。
  12. 使用冷冻切片机制备切片（5 µm 厚）。将切片贴附于硅烷涂层载玻片上，并用 4% 多聚甲醛固定。
    注意：肾脏组织可选择性地使用荧光素标记的 Lotus tetragonolobus 凝集素（2 mg/mL）室温孵育2小时标记近端小管，随后DAPI（30 nM，溶于PBS）室温孵育15分钟标记细胞核。
  13. 用 PBS 轻柔洗涤载玻片两次。
  14. 使用荧光显微镜在100倍和400倍放大倍数下，结合适当的成像软件观察荧光染色结果。

3. 通过PEI-NP向肾脏递送miRNA模拟物后目标miRNA变化的验证 通过 尾静脉注射

  1. 采用定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）确认目标miRNA的变化。
    注：qRT-PCR的详细步骤请参考已发表的文献18,19,20。下文所示代表性结果所使用的qRT-PCR系统已被制造商更新，因此qRT-PCR操作应依据制造商最新的操作说明进行。

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结果

以下所述用于肾纤维化、糖尿病肾病和急性肾损伤（AKI）的靶向miRNA，是基于基因治疗应用的微阵列、qRT-PCR和/或数据库研究筛选而得。更多细节请参见先前发表的文献13,14,15。

使用PEI-NPs递送miRNA-146a-5p模拟物在肾纤维化小鼠中的效应13
荧光显微镜分析显示，经尾静脉注射的PEI-NPs可将miRNA模拟物递送至肾小管间质区域。在由UUO诱导的肾纤维化小鼠中，该区域包括肾小管上皮细胞，这些细胞在肾脏中形态不规则。图 2A 箭头）以及肾小球（图2A）。qRT-PCR分析显示，注射PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimi...

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讨论

利用本论文所述方案，PEI-NPs 可将 miRNA 模拟物递送至肾脏，诱导靶向 miRNA 过表达，从而产生治疗效果 体内 包括肾纤维化、糖尿病肾病和急性肾损伤在内的多种肾脏疾病的小鼠模型。

制备PEI-NPs与miRNA模拟物复合物的方法非常简单。当两者混合时，PEI-NPs所带正电荷的表面即可捕获miRNA模拟物13,14,15,16,17（图1）。此外，作为基于线性聚乙烯亚胺的非病毒载体，PEI-NPs可避免使用病毒载体所带来的问题，例如由基因组不稳定引发的干扰素反应和致癌风险11,

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作部分由日本学术振兴会科学研究费补助金（JSPS KAKENHI，课题编号：21K08233）资助。感谢Edanz（https://jp.edanz.com/ac）对本文手稿的编辑工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于细胞核染色的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚Thermo Fisher ScientificD-1306
Buffer RPEQiagen79216洗涤缓冲液2
Buffer RWTQiagen1067933洗涤缓冲液1
对照miRNA模拟物（人工合成miRNA）Thermo Fisher Scientific未指定5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’（正义链）
5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′（反义链）
Cy3标记的双链寡核苷酸Takara Bio Inc.MIR7900
荧光素标记的刀豆四棱豆凝集素Vector Laboratories IncFL-1321
in vivo-jetPEIPolyplus101000021
用于qRT-PCR的MicroAmp光学96孔反应板Thermo Fisher Scientific431681396孔反应板
MicroAmp光学粘性封膜Thermo Fisher Scientific431197196孔反应板用粘性封膜
miRNA-146a-5p模拟物（人工合成miRNA）Thermo Fisher Scientific未指定5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU
UT-3′（正义链） 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′（反义链）
miRNA-146a-5p引物QiagenMS00001638不可用，因Qiagen已更换qRT-PCR试剂盒（自2021年5月起由miScript miRNA PCR系统更换为miRCURY LNA miRNA PCR系统）
miRNA-181b-5p模拟物（人工合成miRNA）Gene design未指定5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG
GUU-3’
miRNA-181b-5p引物QiagenMS00006083不可用，因Qiagen已更换qRT-PCR试剂盒（自2021年5月起由miScript miRNA PCR系统更换为miRCURY LNA miRNA PCR系统）
miRNA-5100-模拟物（人工合成miRNA）Gene design未指定5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′
miRNA-5100-引物QiagenMS00042952不可用，因Qiagen已更换qRT-PCR试剂盒（自2021年5月起由miScript miRNA PCR系统更换为miRCURY LNA miRNA PCR系统）
miRNeasy Mini试剂盒Qiagen217004置于2.0 mL收集管中的膜锚定式离心柱
miScript II RT试剂盒Qiagen218161不可用，因Qiagen已更换qRT-PCR试剂盒（自2021年5月起由miScript miRNA PCR系统更换为miRCURY LNA miRNA PCR系统）
miScript SYBR Green PCR试剂盒Qiagen218073不可用，因Qiagen已更换qRT-PCR试剂盒（自2021年5月起由miScript miRNA PCR系统更换为miRCURY LNA miRNA PCR系统）
QIA shredderQiagen79654置于2.0 mL收集管中的生物聚合物离心柱
QIAzol裂解试剂Qiagen79306基于苯酚/胍的裂解试剂
QuantStudio 12K Flex实时荧光定量PCR系统Thermo Fisher Scientific4472380实时荧光定量PCR仪器
QuantStudio 12K Flex软件版本1.2.1Thermo Fisher Scientific4472380实时荧光定量PCR仪器软件
无RNase水Qiagen129112
RNU6-2引物QiagenMS00033740不可用，因Qiagen已更换qRT-PCR试剂盒（自2021年5月起由miScript miRNA PCR系统更换为miRCURY LNA miRNA PCR系统）
Tissue-Tek OCT（最佳切割温度化合物）Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.未指定

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