在此，我们将外源性人工合成的miRNA模拟物递送至肾脏 通过 在多种肾脏疾病小鼠模型中，通过尾静脉注射非病毒载体和聚乙烯亚胺纳米颗粒，导致肾脏中靶向miRNA显著过表达，从而抑制了多种小鼠模型中肾脏疾病的进展。
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方法文章
利用聚乙烯亚胺纳米颗粒在多种肾病小鼠模型中向肾脏递送外源性人工合成的miRNA模拟物
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
microRNAs （miRNAs）是一类小分子非编码RNA（21-25个碱基），不翻译为蛋白质，可通过使多种信使RNA（mRNAs）失稳并抑制其翻译，在多种肾脏疾病中调控大量靶基因。因此，通过外源性人工合成的miRNA模拟物改变miRNA表达水平，可能成为抑制多种肾脏疾病进展的一种有效治疗策略。然而，由于血清RNA酶会迅速降解经系统给药的外源性miRNA模拟物 体内然而，将miRNA递送至肾脏仍面临挑战。因此，需要能够保护外源性miRNA模拟物免受RNA酶降解并有效递送至肾脏的载体。许多研究采用病毒载体将外源性miRNA模拟物或抑制剂递送至肾脏，但病毒载体可能引发干扰素反应和/或导致基因组不稳定。因此，病毒载体的开发也阻碍了外源性miRNA模拟物或抑制剂的临床应用。为克服病毒载体相关的这些问题，我们开发了一种非病毒载体方法，即通过尾静脉注射聚乙烯亚胺纳米颗粒（PEI-NPs）将miRNA模拟物递送至肾脏，该方法在多种小鼠肾脏疾病模型中均实现了靶向miRNA的显著过表达。
引言
miRNA是一类小分子非编码RNA（21-25个碱基），不能被翻译成蛋白质，可通过使多种肾脏疾病中的靶标信使RNA（mRNA）失稳并抑制其翻译，从而抑制大量靶标mRNA1,2。因此，利用外源性人工合成的miRNA模拟物或抑制剂进行基因治疗，可能是抑制多种肾脏疾病进展的一种潜在新策略3,4,5。
尽管miRNA模拟物或抑制剂在基因治疗中具有广阔前景，但将其递送至靶器官仍是开发其临床潜力的体内实验中的一大难题。由于人工合成的miRNA模拟物或抑制剂易被血清RNase迅速降解，其在体内全身给药后的半衰期显著缩短6。此外，在缺乏合适载体的情况下，miRNA模拟物或抑制剂穿越细胞膜并转染至细胞质的效率通常很低7,8。这些证据表明，有必要开发针对肾脏的miRNA模拟物或抑制剂递送系统，以推动其在临床中的应用，并为各类肾病患者提供新的治疗选择。
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方案
所有动物实验方案均经日本医科大学动物伦理委员会批准，并依照日本医科大学实验动物使用与护理指南进行。本研究展示了通过UUO小鼠模型将miRNA模拟物递送至肾脏，从而实现其过表达的方法。本研究已获得日本医科大学伦理委员会批准［批准编号：19-12（肾纤维化）、17-024（急性肾损伤，AKI）和19-11（糖尿病肾病）］。
1. PEI-NPs-miRNA-mimic 复合物的制备
注意：此处描述的是为一只小鼠制备 PEI-NPs-miRNA-mimic13,14,15 和 PEI-NPs-control-miRNA（作为阴性对照）的方法。
- 准备以下物品：
- 准备 10 µL 线性 PEI-NPs。
- 准备 50 µL 溶解于无核酸酶水中的人工合成 miRNA，浓度为 100 µM（5 nmol miRNA 溶解于 50 µL 无核酸酶水中）。
- 准备 50 µL 溶解于无核酸酶水中的人工合成对照（非靶向）miRNA，浓度为 100 µM（5 nmol miRNA 溶解于 50 µL 无核酸酶水中）。
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结果
以下所述用于肾纤维化、糖尿病肾病和急性肾损伤（AKI）的靶向miRNA，是基于基因治疗应用的微阵列、qRT-PCR和/或数据库研究筛选而得。更多细节请参见先前发表的文献13,14,15。
使用PEI-NPs递送miRNA-146a-5p模拟物在肾纤维化小鼠中的效应13
荧光显微镜分析显示，经尾静脉注射的PEI-NPs可将miRNA模拟物递送至肾小管间质区域。在由UUO诱导的肾纤维化小鼠中，该区域包括肾小管上皮细胞，这些细胞在肾脏中形态不规则。图 2A 箭头）以及肾小球（图2A）。qRT-PCR分析显示，注射PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimi.......
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讨论
利用本论文所述方案，PEI-NPs 可将 miRNA 模拟物递送至肾脏，诱导靶向 miRNA 过表达，从而产生治疗效果 体内 包括肾纤维化、糖尿病肾病和急性肾损伤在内的多种肾脏疾病的小鼠模型。
制备PEI-NPs与miRNA模拟物复合物的方法非常简单。当两者混合时，PEI-NPs所带正电荷的表面即可捕获miRNA模拟物13,14,15,16,17（图1）。此外，作为基于线性聚乙烯亚胺的非病毒载体，PEI-NPs可避免使用病毒载体所带来的问题，例如由基因组不稳定引发的干扰素反应和致癌风险11,
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作部分由日本学术振兴会科学研究费补助金（JSPS KAKENHI，课题编号：21K08233）资助。感谢Edanz（https://jp.edanz.com/ac）对本文手稿的编辑工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 用于细胞核染色的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚 | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | 洗涤缓冲液2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | 洗涤缓冲液1 |
| 对照miRNA模拟物（人工合成miRNA） | Thermo Fisher Scientific | 未指定 | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’（正义链） 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′（反义链） |
| Cy3标记的双链寡核苷酸 | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| 荧光素标记的刀豆四棱豆凝集素 | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| in vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| 用于qRT-PCR的MicroAmp光学96孔反应板 | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96孔反应板 |
| MicroAmp光学粘性封膜 | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 96孔反应板用粘性封膜 |
| miRNA-146a-5p模拟物（人工合成miRNA） | Thermo Fisher Scientific | 未指定 | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′（正义链） 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′（反义链） |
| miRNA-146a-5p引物 | Qiagen | MS00001638 | 不可用，因Qiagen已更换qRT-PCR试剂盒（自2021年5月起由miScript miRNA PCR系统更换为miRCURY LNA miRNA PCR系统） |
| miRNA-181b-5p模拟物（人工合成miRNA） | Gene design | 未指定 | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p引物 | Qiagen | MS00006083 | 不可用，因Qiagen已更换qRT-PCR试剂盒（自2021年5月起由miScript miRNA PCR系统更换为miRCURY LNA miRNA PCR系统） |
| miRNA-5100-模拟物（人工合成miRNA） | Gene design | 未指定 | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-引物 | Qiagen | MS00042952 | 不可用，因Qiagen已更换qRT-PCR试剂盒（自2021年5月起由miScript miRNA PCR系统更换为miRCURY LNA miRNA PCR系统） |
| miRNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 217004 | 置于2.0 mL收集管中的膜锚定式离心柱 |
| miScript II RT试剂盒 | Qiagen | 218161 | 不可用，因Qiagen已更换qRT-PCR试剂盒（自2021年5月起由miScript miRNA PCR系统更换为miRCURY LNA miRNA PCR系统） |
| miScript SYBR Green PCR试剂盒 | Qiagen | 218073 | 不可用，因Qiagen已更换qRT-PCR试剂盒（自2021年5月起由miScript miRNA PCR系统更换为miRCURY LNA miRNA PCR系统） |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | 置于2.0 mL收集管中的生物聚合物离心柱 |
| QIAzol裂解试剂 | Qiagen | 79306 | 基于苯酚/胍的裂解试剂 |
| QuantStudio 12K Flex实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | 实时荧光定量PCR仪器 |
| QuantStudio 12K Flex软件版本1.2.1 | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | 实时荧光定量PCR仪器软件 |
| 无RNase水 | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2引物 | Qiagen | MS00033740 | 不可用，因Qiagen已更换qRT-PCR试剂盒（自2021年5月起由miScript miRNA PCR系统更换为miRCURY LNA miRNA PCR系统） |
| Tissue-Tek OCT（最佳切割温度化合物） | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | 未指定 |
参考文献
- Mohr, A. M., Mott, J. L. Overview of microRNA biology. Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).
- Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
- Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T.
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重印与许可
