一种用于研究炎症过程中白细胞与内皮细胞相互作用的微生理系统

摘要

在本方案中，采用了一种仿生微流控检测方法，该方法能够重现生理相关的微血管环境，并完整再现白细胞黏附/迁移级联过程，用于研究炎症疾病中的白细胞-内皮细胞相互作用。

摘要

白细胞-内皮细胞相互作用在脓毒症等炎症性疾病中起着重要作用。在炎症过程中，活化的白细胞过度迁移穿过血管内皮进入关键器官，可能导致器官功能衰竭。已开发并验证了一种具有生理相关性的仿生微流控检测方法（bMFA），该方法结合多种实验与计算技术，能够重现白细胞滚动、黏附及迁移的全过程，用于研究白细胞与内皮细胞之间的相互作用。微血管网络来源于 体内 使用地理信息系统（GIS）方法对啮齿类动物的图像进行数字化处理，并在载玻片上利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行微加工制备。为研究剪切速率和血管拓扑结构对白细胞-内皮细胞相互作用的影响，建立了计算流体动力学（CFD）模型，以生成网络内剪切速率和流速的相应分布图。脑微血管网络分析（bMFA）可实现对白细胞-内皮细胞相互作用的定量分析，包括滚动速度、在不同剪切速率下黏附的白细胞数量、迁移的白细胞数量、内皮细胞通透性、黏附分子表达及其他重要变量。此外，通过使用人类相关样本（如人源内皮细胞和白细胞），bMFA为潜在治疗药物的快速筛选提供了工具，从而提高其临床可转化性。

引言

炎症是机体对感染和损伤的宿主反应，其中内皮细胞在炎症反应中发挥重要作用^1,2,3。炎症调控失常是多种疾病病理过程的根本原因，例如脓毒症、心血管疾病、哮喘、炎症性肠病、癌症 以及 COVID-19。白细胞与内皮细胞的相互作用在这些炎症性疾病中起核心作用。在炎症过程中，病原体释放的 PAMPs（病原体相关分子模式）或受损组织释放的 DAMPs（损伤相关分子模式）会激活免疫细胞，促使其释放细胞因子/趋化因子及其他促炎介质，从而导致内皮细胞活化，引起血管内皮屏障功能改变和通透性增加^3,4。炎症期间内皮细胞的活化增强，导致白细胞与内皮细胞的相互作用加剧，促使活化的白细胞大量迁移穿过血管内皮进入关键器官^1,5,6,7。

白细胞的募集由化学性质多样的趋化因子启动，这些趋化因子包括生物活性脂质、细胞因子、趋化因子 以及补体成分^8,9。白细胞募集是一个多步骤过程，包含五个独立阶段：1）白细胞边缘化及捕获/黏附，2）滚动，3）牢固黏附，4）铺展与爬行，以及5）渗出/迁移（图1）。该过程的每一步均需要白细胞与内皮细胞之间的相互通讯，以协调这一动态现象^1,9。最终，停滞的白细胞通过一个由趋化因子依赖性信号、黏附事件和血流动力学剪切力共同调控的多步骤过程，穿越内皮层进入炎症组织^1,9,10,11,12。

鉴于剪切应力在调控内皮细胞功能中的核心作用以及白细胞与内皮细胞相互作用的重要性¹³，多个 体外 在过去的几十年中，为了在更可控的环境中研究白细胞迁移级联反应的各个方面，已开发出多种模型¹⁴研究白细胞与内皮细胞相互作用的传统流体装置可分为两大类¹⁴：a）用于研究白细胞滚动、黏附的装置 以及在剪切力条件下研究黏附分子及其配体在黏附级联反应中作用的平行板流动腔室等装置；b）用于在静态条件下研究白细胞迁移的装置，如Transwell小室。平行板流动腔室等系统已被用于研究黏附分子及其配体在剪切力作用下黏附级联中的功能¹⁵然而，一个显著的缺点是，这些简化的理想化装置（例如，直通道）无法重现实际的尺度和几何结构 体内 微血管系统（例如，连续的血管分支、血管形态） 以及由此产生的流动条件（例如，分叉处的汇聚或发散流动）。因此，这些装置 只能模拟黏附而不能模拟跨膜迁移。Transwell 小室只能在 静态条件，未考虑 体内 几何特征和流动条件。因此，这些传统模型无法模拟活体组织的微环境，也无法在单次实验中解析黏附和迁移级联过程⁶.

为解决这一局限性，我们开发并广泛验证了一种新型三维仿生微流控检测方法（bMFA）（图2），该方法可在芯片上真实再现体内微血管网络^16,17,18。该装置的微加工方案此前已有发表¹⁷ ，此处仅作简要描述。采用改进的地理信息系统（GIS）方法对小鼠提睾肌的微血管系统进行数字化¹⁹。随后，基于数字化的微血管网络，利用软光刻技术在聚二甲基硅氧烷（PDMS）上构建合成微血管网络^{14,17,20,21,22}。简而言之，将数字化网络图像打印至聚酯薄膜（Mylar film）上，用作掩模，在硅晶圆表面的SU-8正性光刻胶上进行图案化，以制备器件的母模。通过微加工形成的微柱（直径10 µm，高3 µm）用于构建高3 µm、宽100 µm的孔道，该尺寸为白细胞迁移的最佳孔径^23,24,25，用于连接血管通道与组织腔室。按照制造商说明配制PDMS，并浇注于制备好的母模上。随后对PDMS进行脱气处理，并在烘箱中（65 °C）过夜固化，以在PDMS中形成互补的微通道。固化后，将PDMS从SU-8母模上剥离，并打孔作为进样口和出样口。然后，通过等离子体处理将PDMS键合至玻璃载片上。微流控装置的表面由天然玻璃和PDMS组成。为促进细胞的黏附、铺展 和增殖，需进行细胞外基质（ECM）包被。bMFA包含一个微血管网络和一个通过高3 µm、宽100 µm的孔道相连的组织腔室（图2）。该微流控系统可在生理相关的三维环境中，于一个完整的、包含相互连接血管和分叉结构的微血管网络中，再现白细胞黏附/迁移的全过程，包括在单一系统中实现白细胞的循环、边缘化、滚动、黏附 以及向血管外组织腔室的迁移^{14,16,17,21,26}。

需要注意的是，即使bMFA入口处的流速保持恒定，网络内不同位置的流动条件仍会有所变化，且无法通过简单的数学公式进行计算。为此建立了一个基于计算流体动力学（CFD）的模型，用于计算网络中不同位置的多种流动参数（如剪切应力、剪切速率、流速等）。该CFD模型被用于模拟bMFA中的染料灌注模式及流动参数。与实验结果的交叉验证表明，该计算模型能够准确预测网络中的流动阻力。图3)¹⁷. 该CFD模型随后被用于估算bMFA中每条血管内的速度和剪切率分布图4），从而可分析剪切流和几何结构对白细胞滚动、黏附和迁移的影响¹⁶白细胞优先黏附于分叉处及低剪切力区域 体内，这些白细胞黏附的空间模式已在bMFA中利用中性粒细胞成功展示（图5)¹⁶本文描述了利用人肺微血管内皮细胞（HLMVEC）和人中性粒细胞在炎症条件下研究白细胞-内皮细胞相互作用的脑膜类器官微流控装置（bMFA）制备方案。微生理系统（如bMFA）可用于研究内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等不同细胞类型之间的相互作用。 和肿瘤细胞^{18,27,28,29,30}可将来自不同器官（如肺与脑）和不同物种（如人与小鼠内皮细胞）的原代内皮细胞以及内皮细胞系接种至bMFA中^21,27,31,32可利用bMFA研究多种细胞反应、细胞间相互作用、屏障功能及药物递送 和药物毒性。

方案

根据坦普尔大学机构审查委员会（美国宾夕法尼亚州费城）批准的知情同意书，从健康的成年献血者（男性和女性，年龄在21至60岁之间）获取肝素抗凝人血，用于中性粒细胞分离。

1. 使用人纤维连接蛋白对装置进行预处理和包被

注意：脑微流控装置（bMFA）有两个连接至血管腔室的入口端口和两个出口端口。此外，它还有一个连接至组织腔室的端口（图2）。

1. 插入外径为0.06的管路" 内径为0.02") (材料表s) 除一个进样口外，使用尖头镊子将所有端口密封。用鳄嘴夹夹紧两个出样口和组织舱端口。确保每段管路长度约为1英寸。
2. 将人纤维连接蛋白原液（1 mg/mL）用 PBS 稀释至 100 µg/mL。取 1 mL 注射器，吸入配制好的纤维连接蛋白溶液。将注射器连接至 24 G 钝头针和一段长约 4 英寸的导管。
   注意：为防止交联，切勿过度混匀或吹打人纤维连接蛋白。对于不同类型的细胞，可使用其他细胞外基质（ECM），如胶原蛋白。
3. 将导管插入开放的入口端口，推动推杆，直至人纤维连接蛋白从另一个入口端口流出，然后夹闭该端口。对剩余的各个端口重复此操作，直至所有通道、组织腔室及导管均充满人纤维连接蛋白溶液。移除针头，但保留插入的4英寸长导管，并保持未夹闭状态。
   注意：在夹闭管道之前，务必确保管道内已充满纤连蛋白。
4. 用于脱气时，将未夹紧的管路连接至 通过气动引燃器连接压缩氮气罐，将压力调节至约5 psi，运行约15分钟。
5. 15 分钟后，在显微镜下检查，确保装置内无气泡残留。若通道或组织舱室内存在气泡，需将装置重新连接至气动引液仪再次脱气，即重复步骤 1.4。
   注意：本实验方案中所有涉及显微镜观察的步骤均使用倒置显微镜。
6. 从气动引物中取出装置，在37 °C下孵育1小时，然后用预热的HLMVEC培养基冲洗所有通道和组织腔室材料表），与步骤1.3类似。原代小鼠成纤维细胞（bMFA）现可用于细胞接种。
   ​注意：在从端口拔出或插入管路前，应先用移液器在进样口管路基部滴加一滴水，以防止空气进入装置。

2. 使用人肺微血管内皮细胞接种bMFA

1. 根据供应商提供的方案，在T-25培养瓶中将人肺微血管内皮细胞（HLMVEC）培养至60%–80%融合度。
2. 吸除细胞培养瓶中的HLMVEC培养基，用PBS洗涤两次。
3. 向T-25培养瓶中加入2 mL预热的胰蛋白酶-EDTA溶液（37 °C），在培养箱（37 °C，5% CO₂）中孵育3–5分钟，直至大多数细胞从瓶壁脱落。
   注意：不同细胞类型及胰蛋白酶-EDTA浓度可能导致孵育时间有所差异。
4. 向培养瓶中加入2 mL胰蛋白酶中和液（TNS，37 °C），以中和胰蛋白酶-EDTA。
5. 轻轻敲击培养瓶以促进细胞完全解离，随后将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中。
6. 在150 × g 条件下离心5分钟，使内皮细胞沉淀；弃去上清液，将细胞重悬于3 mL新鲜培养基中，并使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。
7. 再次在150 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液，将细胞重悬至所需接种密度（20 × 10⁶/mL）。
   注意：根据细胞类型和融合度的不同，通常可从两个T-25培养瓶中收集约2 × 10⁶个内皮细胞；以20 × 10⁶/mL的接种密度计算，100 µL细胞悬液（含2 × 10⁶个内皮细胞）足以接种5个装置。
8. 将1 mL注射器安装至可编程注射泵上，并将导管连接至钝头针。
9. 吸取约20 µL细胞悬液进入导管，确保细胞悬液仅存在于导管内，而不进入注射器筒身。
10. 取下装置出口端的夹子，将导管连接至装置的一个入口；注意避免将气泡引入微通道中。
11. 启动泵，设定流速为4–8 µL/min，并在显微镜下观察装置内细胞流动情况。
12. 当微通道完全充满细胞后，停止泵运行，夹闭出口端，并剪断入口导管。
    注意：操作过程中应小心，避免向装置内引入气泡。
13. 将装置置于培养箱中，在5% CO₂、37 °C条件下孵育4小时。
14. 孵育4小时后，准备另一支装有新鲜细胞培养基的注射器，将其安装在注射泵上，连接至装置的进样口 ，并取下出口端的夹子。
15. 以4–8 µL/min的流速将新鲜培养基注入装置，持续约5分钟，以冲洗未贴壁或漂浮的细胞。

3. 流动条件下细胞培养 48 小时

1. 准备一支装有新鲜细胞培养基的注射器。将注射器安装到注射泵上，连接注射器至一个进样口 ，并保持出样口开放。将装置放入培养箱中（5% CO₂，37 °C）。
2. 根据表1中所述的说明，设置注射泵程序，以在流动条件下培养内皮细胞。
3. 在流动条件下培养48小时后，在显微镜下检查bMFA。人肺微血管内皮细胞（HLMVEC）应覆盖血管通道，形成完整的管腔（图6）。
   注意：不同细胞类型可能需要不同的流动条件。

4. 细胞因子和/或治疗处理

注意：本节以使用bMFA研究肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和一种新型抗炎抑制剂（蛋白激酶C delta-TAT肽抑制剂，PKCδ-i）处理细胞的影响为例^{18,27,32,33,34,35,36}。

1. 使用上述方案（第1-3节）制备三个不同的bMFA装置。
2. 将三支1 mL注射器分别装入细胞培养基、 (TNF-α) (10 ng/mL)、TNF-α (10 ng/mL) + PKCδ抑制剂 (5 µM)。
   注意：细胞因子需用细胞培养基重新配制。
3. 将三支注射器分别连接至三个bMFA装置。以0.1 µL/min的流速，用缓冲液、TNF-α或TNF-α加抑制剂处理HLMVEC细胞，持续4小时。
   ​注意：根据具体研究需求，可使用其他细胞因子或细胞因子组合（例如TNF-α + 白细胞介素1β (IL1-β) + 干扰素-γ (IFN-γ)）处理内皮细胞。

5. 人中性粒细胞的分离

1. 所有试剂均在室温（RT）下使用。试剂包括白细胞分离介质、含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 1× HEPES 缓冲液（表 2）、6% 右旋糖酐生理盐水（0.9% NaCl）、3.6% NaCl 溶液以及去离子水（DI 水）。
2. 将 20 mL 白细胞分离介质移入 50 mL 锥形管中，小心地将 25 mL 血液叠加在白细胞分离介质上方。在室温下以 427 × g 离心 40 分钟。
   注意：此步骤应缓慢且小心操作，避免血液与白细胞分离介质混合。
3. 吸除上清液，保留红细胞（RBC）层上方约 5 mL 液体。位于 RBC 层上方的白色絮状层主要为中性粒细胞。
4. 加入 HEPES 缓冲液，使总体积加倍（现有体积 : HEPES 缓冲液 = 1 : 1）。
5. 加入 6% 右旋糖酐，其体积为最终总体积的 20%（即：当前体积 / 4 = 所需加入的 6% 右旋糖酐体积）。
6. 轻轻倒置混匀数次，充分混合后静置使红细胞沉降（约 25 分钟）。
7. 小心吸取上层富含中性粒细胞的液体，转移至新的 50 mL 管中，注意避免混入已沉降的红细胞。
8. 在室温下以 315 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 8 mL HEPES 缓冲液中。
9. 为裂解残留的红细胞，加入 24 mL 去离子水，轻轻混匀 50 秒。立即加入 8 mL 3.6% NaCl 溶液，混匀后在室温下以 315 × g 离心 10 分钟。
10. 弃去上清液，用 15 mL HEPES 缓冲液洗涤细胞沉淀，并以 315 × g 离心 5 分钟。将沉淀重悬于 HEPES 缓冲液中。

6. 使用 bMFA 进行中性粒细胞黏附和迁移实验

1. 将分离的人中性粒细胞（1500万）重悬于999 µL HEPES缓冲液中。
2. 向中性粒细胞悬液中加入1 µL CFDA-SE（羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯）染料储备液（10 mM），使CFDA-SE工作浓度达到10 µM，室温孵育10分钟。以315 × g 离心5分钟，用HEPES缓冲液洗涤细胞两次。
3. 使用血细胞计数板计数中性粒细胞，并分别以200万中性粒细胞/mL的密度重悬于细胞培养基中，分别加入TNF-α（10 ng/mL）以及TNF-α（10 ng/mL）+ PKCδ-i（5 μM）；实验开始前室温孵育15分钟。
4. 准备一支注射器，内含1 µM N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）——本研究的趋化因子，溶于细胞培养基中。取bMFA装置，打开一个入口端口和一个出口端口。
   注意：这些实验条件用于模拟脓毒症状态，即存在全身性炎症反应并伴有高水平循环细胞因子/趋化因子的情况。此外，fMLP是一种来源于革兰氏阴性菌的肽，用于模拟细菌在肺组织（即组织腔室）中的存在。
5. 移除组织腔室端口的管路，插入含fMLP的管路。除仅用细胞培养基处理的bMFA外，向所有bMFA的组织腔室注入约20 µL fMLP。然后切断管路并用夹子夹闭。
6. 用约200 µL中性粒细胞悬液填充注射器，并将注射器安装到注射泵上。
7. 将装置置于倒置显微镜载物台上（材料表）。
8. 启动泵，设定流速为1 µL/min，等待中性粒细胞悬液从管路末端形成一小滴。将管路插入入口端口。装置设置详见图7。

7. 采集图像

1. 在显微镜图像分析软件（材料表）中使用“扫描大图像”功能，在实验开始后10分钟获取bMFA中的黏附图谱（图8）。大多数中性粒细胞在前10分钟内进入bMFA。
   注意：在不拍摄图像时关闭荧光光源，以减少光漂白。
2. 在接下来的一小时内，每隔5分钟拍摄一次组织腔室的延时图像（每5分钟1张图像）（图8B、C），用于迁移分析，以获得迁移图谱。

8. 数字图像分析

1. 对于黏附图谱，计数每条血管中黏附的中性粒细胞数量。针对每个分叉处，创建一个直径等于血管直径两倍的圆形感兴趣区域（ROI），并计数该区域内黏附的中性粒细胞数量。
2. 使用手动计数或自动的目标计数功能，定量每条血管及每个分叉区域中黏附的中性粒细胞数量。
3. 利用基于CFD模拟生成的网络剪切率图谱¹⁷，确定每条血管中的剪切率。随后将特定血管中黏附的中性粒细胞数量与该血管的剪切率进行对应作图，从而建立bMFA中的剪切率图谱，如图9A所示。
4. 若中性粒细胞已穿过内皮进入组织腔室，则计为已迁移细胞。分别在10分钟、15分钟、30分钟和60分钟时计数迁移的中性粒细胞数量。绘制迁移中性粒细胞数量随时间变化的曲线，如图9B所示。

结果

在bMFA中经剪切流培养48小时后，内皮细胞覆盖了血管通道的表面，并沿流动方向排列（图6）。共聚焦显微镜结果显示，血管通道的所有表面均被内皮细胞覆盖，在bMFA中形成了完整的三维管腔结构¹⁸。

通过该方案，可获得中性粒细胞黏附图谱，显示在bMFA中中性粒细胞与内皮细胞之间存在显著的黏附现象（图8）。将该黏附图谱中中性粒细胞的空间分布与CFD模型生成的剪切速率图进行关联分析，表明中性粒细胞的黏附具有剪切依赖性，且更倾向于在低剪切速率区域和分叉区域发生黏附（图9A）。中性粒细胞对TNF-α激活的内皮细胞的黏附显著增加。对延时成像图像的分析表明，TNF-α激活内皮细胞可增强中性粒细胞对趋化因子fMLP的迁移反应（图9B）。如上所述，bMFA可用于快速评估新型治疗药物在炎症性疾病治疗中的有效性。例如，使用P...

讨论

bMFA 重现了地形特征和流动条件 体内 微血管网络，可用于研究白细胞与内皮细胞的相互作用以及内皮功能 体外 在生理条件接近真实的情况下，小鼠或人类微血管系统的微血管网络结构具有自相似性和分形特征，且雷诺数 << 1，表明血管几何结构对流动模式无显著影响。因此，bFMA可用于研究不同物种（包括人类）的白细胞-内皮细胞相互作用，尽管bMFA的制造基于小鼠 cremaster 肌肉微血管结构的映射。

脑膜迁移分析（bMFA）能够在单次实验中实时评估中性粒细胞迁移级联的各个步骤，包括滚动、牢固黏附、铺展 以及中性粒细胞向组织腔室的迁移。该方法可使用原代人源细胞和具有临床相关性的样本，以提高研究结果的可转化性，并快速筛选潜在治疗药物。与传统的流体系统（如平行板流动腔）相比，bMFA因其微小的管道尺寸以及可在单次实验中研究完整的中性粒细胞迁移级联过程，试剂用量减少了95%以上³⁷。然而，这种微小尺寸也要求操作者处理极小体积的试剂，操作难度较高，需要大量实践经验。本实验方案最常见的问题是bMFA中出现...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	Fisher Scientific	14-823-30
仿生微流控检测（bMFA）	SynVivo	SMN1-C001	仅在 SynVivo 提供
钝头针	Jensen Global	JG24-0.5
氯化钙	Fisher Scientific	C70-500
CFDA, SE	ThermoFisher	C1157
葡聚糖，250,000，粉末	Spectrum Chemical Mfg. Corp	DE-130
Ficoll-Paque Premium	GE Health Care	17-5442-02	白细胞分离介质
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506
HEPES	Fisher Scientific	AAJ1692630
人纤维连接蛋白	Fisher Scientific	33-016-015	针对不同细胞系使用厂商推荐的细胞外基质
微血管内皮细胞生长培养基-2 BulletKit	Lonza	cc-3202	人肺微血管内皮细胞培养基（HLMVEC）
人肺微血管内皮细胞	Lonza	cc-2527	使用厂商推荐的胰蛋白酶-EDTA 和 TNS
氯化镁	Fisher Scientific	BP214-500
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments Inc.		显微镜
NIS-elements, 5.20.01	Nikon Instruments Inc.		成像软件
PBS	Fisher Scientific	MT21040CV
PhD Ultra 注射泵	Harvard Apparatus	70-3007	注射泵
氢氧化钾	Fisher Scientific	02-003-763
重组人 TNF-α	R&D Systems	210-TA
载玻片夹具	SynVivo
氯化钠	Fisher Scientific	S640-500
SynVivo 气动引注仪	SynVivo
胰蛋白酶-EDTA，胰蛋白酶中和液（TNS）	Lonza	cc-5034
Tygon 管路	Fisher Scientific	50-206-8921	管路