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荧光蛋白中脯氨酸残基特异性替换为脯氨酸类似物：骨架“分子手术”如何影响折叠与稳定性

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DOI：

10.3791/63320

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2022年2月3日

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1Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 2Department of Chemistry, University of Manitoba, 3Institute of Physics, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

本文内容

摘要

为了克服传统定点突变技术的局限性，将带有特定修饰的脯氨酸类似物引入多种荧光蛋白中。我们展示了通过以氟原子取代氢原子，或在脯氨酸残基中将单键替换为双键（“分子手术”）的方式，如何影响蛋白质的基本性质，包括其折叠过程以及与光的相互作用。

摘要

通过传统的定点突变技术将蛋白质中的脯氨酸（Pro）残基替换为其余19种标准氨基酸中的任意一种，通常会对蛋白质折叠产生不利影响，尤其会影响绿色荧光蛋白及其相关变体中的发色团成熟过程。一种合理的替代方法是调控蛋白质的翻译过程，使得所有脯氨酸残基被特异性地替换为相应的类似物，该方法称为选择性压力整合（selective pressure incorporation, SPI）。内置的化学修饰可作为一种“分子手术”手段，用于精细解析可测量的变化，甚至理性调控不同的蛋白质性质。 全部 Pro残基被替换 残基特异性地 通过类似物进行取代，该方法称为选择性压力掺入（SPI）。内置的化学修饰可作为一种“分子手术”手段 "分子手术" 以精细解析可测量的变化，甚至合理调控不同的蛋白质特性。本研究展示了SPI方法在研究脯氨酸于典型β-桶状结构组织中作用方面的有效性 β-桶状结构，其序列中含有10-15个脯氨酸残基：增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、NowGFP和KillerOrange。Pro残基位于各个β-链之间的连接区域，构成桶状支架的闭合“盖子”，从而负责将发色团与水隔离，即维持其荧光特性。 β-链之间，并构成桶状支架的闭合盖子，因此负责将发色团与水隔绝，即影响其荧光特性。采用（4R-氟脯氨酸（R-Flp）、(4SS-氟代脯氨酸（S-Flp）、4,4-二氟代脯氨酸（Dfp）和3,4-脱氢脯氨酸（Dhp）的实验采用脯氨酸营养缺陷型 E. coli 菌株作为表达宿主。我们发现，含有 S-Flp 和 Dhp 的荧光蛋白具有活性（即具有荧光），而另外两种类似物（Dfp 和 R-Flp）则产生无功能且错误折叠的蛋白质。对含有 Pro 类似物的蛋白质进行紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱分析，结果显示仅有少量特征性变化。对 EGFP 变体的折叠动力学曲线进行分析表明，在 S-Flp 存在时重折叠过程加快，而含有 Dhp 的蛋白质的折叠过程则与野生型相似。本研究展示了 SPI 方法在原子水平上对蛋白质残基进行细微修饰的能力（“分子手术”），"分子手术"），可用于研究其他感兴趣的蛋白质。该研究阐明了在β桶状荧光蛋白类别中，以近似化学类似物替代脯氨酸对蛋白质折叠及光谱特性所产生的影响。 β-桶状荧光蛋白

引言

经典的定点突变技术可通过在DNA水平上操纵密码子，实现对现有基因编码蛋白质序列的任意置换。为了研究蛋白质折叠与稳定性，通常希望用结构相似的氨基酸替代物替换相似的氨基酸。然而，传统的蛋白质突变技术仅限于标准遗传密码子库中存在的天然氨基酸之间的结构相似替换，例如Ser/Ala/Cys、Thr/Val、Glu/Gln、Asp/Asn、Tyr/Phe。另一方面，对于色氨酸（Trp）、甲硫氨酸（Met）、组氨酸（His）或脯氨酸（Pro）等其他天然氨基酸，则缺乏此类替换手段，而这些氨基酸在蛋白质中常发挥关键的结构与功能作用1。在蛋白质高度特异的内部结构及其折叠过程的背景下，研究这些相互作用的理想方法是引入非破坏性的等排修饰。事实上，当这些天然氨基酸的等排氨基酸类似物——也称为非天然氨基酸（ncAAs）——被插入蛋白质中时，可在单个原子或原子基团（如H/F、CH2/S/Se/Te）水平上实现细微改变，这类改变被称为“原子突变”2。这种“分子手术”可产生性质发生改变的蛋白质，其性质变化仅源于单个原子或原子基团的交换，在理想情况下，这些变化可被分析并合理解释。通过这种方式，蛋白质合成在研究蛋白质折叠与结构方面的应用范围远远超出了经典的DNA突变技术。需要注意的是，通过定点突变技术产生的蛋白质通常被称为“突变体”（mutants），而含有被替换天然氨基酸的蛋白质则被称为“变体”（variants）3、“异源蛋白质”（alloproteins）4 或“蛋白质同系物”（protein congeners）5。

绿色荧光蛋白（GFP）最初在海洋生物Aequorea victoria中被发现，当暴露于紫外光至蓝光时会发出明亮的绿色荧光6,7。如今，GFP 常被用作高灵敏度的标记工具，通过荧光显微镜常规观察细胞中的基因表达和蛋白质定位。GFP 在多种生物物理8,9,10和生物医学11,12研究中也显示出重要价值，并广泛应用于蛋白质工程13,14,15。对 GFP 结构的深入分析促成了大量变异体的开发，这些变异体具有不同的稳定性和荧光发射峰值16,17。目前在细胞与分子生物学中使用的大多数 GFP 变异体在溶液和晶体状态下均为单体蛋白18。它们的主要结构特征对所有 GFP 家族成员具有普遍性，不受其系统发育来源影响，由11条β-链构成所谓的β-桶结构，一条弯曲的α-螺旋贯穿桶状结构中心，并承载发色团（图1A）。发色团的自催化成熟过程（图1B）需要其周围侧链在蛋白质中心位置精确排列；这些侧链中的许多在其他GFP变异体中高度保守19。在大多数来源于水母（如Aequorea victoria）的荧光蛋白中，发出绿光的发色团包含两个芳香环，分别是Tyr66的酚环和咪唑啉酮的五元杂环结构（图1B）。当发色团正确嵌入蛋白质基质中时，便赋予整个蛋白特征性的荧光。发色团位于结构中心，而桶状结构使其与水相环境隔离20。若发色团暴露于大量水环境中，将导致荧光猝灭，即荧光丧失21。

桶状结构的正确折叠对于保护发色团免受荧光淬灭至关重要22。脯氨酸（Pro）残基在绿色荧光蛋白（GFP）的结构组织中起着特殊作用23。由于无法支持β-链的形成，它们构成了连接环，负责维持整个蛋白质的结构稳定性。因此，在来源于Aequorea和Anthoathecata的GFP中均发现有10至15个脯氨酸残基；其中一些在其他类型的荧光β-桶蛋白中也高度保守。由于其独特的几何特征，脯氨酸预计会显著影响蛋白质的折叠特性。例如，在来源于Aequorea的GFP中，十个脯氨酸残基（图2A）中有九个形成反式肽键，仅有一个形成顺式肽键（Pro89）。Pro58是不可或缺的，即不能被其余19种标准氨基酸所替代。该残基可能负责Trp57残基的正确定位，而Trp57已被报道对发色团成熟及GFP整体折叠至关重要24。包含三个脯氨酸残基（Pro54、Pro56、Pro58）和Trp57的PVPWP片段是GFP结构中“下盖”的关键部分（见图1A）。PVPWP结构模体存在于多种蛋白质中，如细胞色素和真核电压门控钾通道25。在第75位和第89位将脯氨酸替换为丙氨酸也会严重损害蛋白质表达与折叠，并阻断发色团的成熟过程。Pro75和Pro89是“上盖”的组成部分，覆盖在发色团之上（图1A），并在11股β-桶荧光蛋白中高度保守23。这两个“盖子”能够使发色团与水性溶剂隔离，即使在稳定的三级结构部分破坏的情况下仍可维持此隔离状态26。这种特殊的分子结构可保护荧光团免受碰撞式（动态）荧光淬灭，例如由水、氧气或其他可扩散配体引起的淬灭。

为了对 GFP 结构进行分子工程改造，需要在其蛋白质的一级结构中引入氨基酸替换。研究人员已在 GFP 上进行了大量突变，获得了具有更高稳定性、快速且可靠折叠能力以及不同荧光特性的多种变体17。然而，在大多数情况下，对脯氨酸残基的突变被认为是一种高风险的方法，因为其余 19 种标准氨基酸中没有任何一种能够有效恢复脯氨酸残基特有的构象特征27。因此，人们发展出一种替代策略，即用其他基于脯氨酸的结构（称为脯氨酸类似物）来替换脯氨酸残基28。由于其独特的环状化学结构，脯氨酸表现出两种特征性的构象转变（图 1C）：1）脯氨酸环的折叠（ring puckering），这是一种快速过程，涉及主链的排列，主要影响 φ 扭转角；2）肽键的 cis/trans 异构化，这是一种较慢的过程，通过 ω 扭转角影响主链的折叠。由于该过程速度较慢，后者通常成为整个蛋白质折叠过程中的限速步骤。已有研究证实，在某些 GFP 变体的折叠过程中，围绕特定脯氨酸残基的肽键 cis/trans 异构化构成了缓慢的折叠步骤。例如，Pro89 处 cis 肽键的形成是折叠过程中的慢速步骤，因为它依赖于从 trans 到 cis 的键转变29。若将 Pro89 替换为全 trans 构型的肽环，即可消除 cis 到 trans 的异构化事件，从而实现更快的重折叠30。除了 cis/trans 异构化之外，环折叠转变也可能因主链在蛋白质内部的排列与堆积而对蛋白质折叠产生显著影响27,31。

化学修饰会改变脯氨酸残基固有的构象转变，从而影响蛋白质的折叠能力。某些脯氨酸类似物是蛋白质中脯氨酸替换的极具吸引力的候选物，因为它们可用于调控并研究蛋白质的折叠特性。例如，(4R)-氟代脯氨酸（R-Flp）、(4S)-氟代脯氨酸（S-Flp）、4,4-二氟代脯氨酸（Dfp）和3,4-脱氢脯氨酸（Dhp）是四种类似物（图1D），它们在分子体积和极性方面与脯氨酸差异极小32。同时，每种类似物表现出不同的环状折叠构型：S-Flp 稳定 C4-endo 折叠构型，R-Flp 稳定 C4-exo 折叠构型，Dfp 无明显的折叠偏好，而 Dhp 则消除折叠（图1D）33。通过在蛋白质结构中使用这些类似物，可以调控脯氨酸残基的构象转变，进而影响所获得的GFP变体的性质。

在本研究中，我们采用选择性压力掺入法（SPI，图3），将指定的一组脯氨酸类似物（图1D）引入绿色荧光蛋白（GFP）变体的结构中34。用结构最相近的类似物替换氨基酸残基，是蛋白质设计中一项应用性的生物技术理念35,36。因此，模型蛋白中脯氨酸类似物的作用体现了其作为蛋白质工程工具的潜力37。含有目标类似物的蛋白质在经过改造的E. coli菌株中进行表达，这些菌株无法自身合成脯氨酸（脯氨酸营养缺陷型），因而可被强制在蛋白质生物合成过程中接受底物替换38。这种全基因组范围内的脯氨酸替换得以实现，依赖于内源性氨酰-tRNA合成酶天然的底物灵活性39——这类关键酶负责催化tRNA与相应氨基酸之间的酯化反应40。通常如图3所示，细胞在确定培养基中培养至对数中期生长阶段。下一步，在发酵过程中使目标氨基酸在表达系统内胞内耗尽，随后由目标类似物或非天然氨基酸（ncAA）替代。然后诱导目标蛋白表达，以实现残基特异性的非天然氨基酸掺入。这种替换在整个蛋白质组范围内发生。尽管这一副作用可能对宿主菌株的生长产生不利影响，但目标蛋白的生产质量通常不受显著影响，因为在重组表达中，细胞资源主要被导向目标蛋白的合成41,42。因此，严格调控的可诱导表达系统和强启动子对于实现高效掺入至关重要43。我们的方法基于通过有义密码子实现多个残基特异性掺入非天然氨基酸（有义密码子重分配），并通过定点突变调控目标基因中脯氨酸类似物插入位点的数量44。类似的方法已在我们此前关于制备具有抗菌特性的重组肽的报告中应用45。在本研究中，我们应用SPI方法，使所有脯氨酸残基被相应的类似物取代，从而生成预期具备天然氨基酸组无法实现的独特理化性质的蛋白质。通过对所得变体的折叠行为和荧光特性进行表征，旨在展示GFP变体中原子级替换所产生的效应。

方案

1. 将表达质粒导入感受态原养缺陷型 E. coli 细胞

  1. 将每种样品质粒（pQE-80L H6-EGFP、pQE-80L H6-NowGFP 和 pQE-80L H6-KillerOrange）各 1 ng 与 50 µL 化学感受态或电感受态的原养型缺陷型 E. coli K12 衍生菌株 JM83（Addgene #50348 或 ATCC #35607）混合，按照现有方案通过热激法或电穿孔法进行转化46,47。
    注意：表达载体 pQE-80L EGFP-H6 编码C端带有6×His标签的增强型绿色荧光蛋白（EGFP），表达载体 pQE-80L H6-NowGFP 和 pQE-80L H6-KillerOrange 分别编码N端带有6×His标签的 NowGFP48 或 KillerOrange49，均构建于 pQE-80L 质粒骨架中。所有目标基因均由受 lac 操纵子调控的细菌 T5 启动子驱动表达。以氨苄青霉素抗性作为筛选标记，colE1 作为复制起点。有关 pQE-80L 质粒的更多信息，请参见材料表。亦可使用源自 K-12 和 B 菌株的其他原养型缺陷型 E. coli 进行表达，结果应相似。经发色团成熟后，H6 标签标记的单质子化野生型蛋白（[M+H]+）的理论分子质量分别为：27,745.33 Da（EGFP-H6）、27,931.50 Da（H6-NowGFP）和 27,606.09 Da（H6-KillerOrange）。目标蛋白的一级结构见表1（His标签序列下划线标出）。NowGFP cDNA 经 Pletnev 等人51 提供并亚克隆至 pQE-80L 质粒后，通过DNA测序确认其His标签序列中含有谷氨酰胺（Q）。该残基不影响蛋白纯化或荧光蛋白的性质。
  2. 将细胞在 950 µL SOC 培养基中，37 °C 下恢复培养 1 小时。
  3. 取 50 µL 恢复后的菌液涂布于含葡萄糖（10 g/L）和氨苄青霉素（100 µg/mL）的LB琼脂（LA）培养基平板上（见补充材料）。
  4. 将LA培养基平板在37 °C下过夜培养，或在30 °C下培养24小时。

2. 重组野生型荧光蛋白（含有经典脯氨酸）的制备及选择性压力掺入法（SPI）制备含脯氨酸类似物（S-Flp、R-Flp、Dfp、Dhp）的荧游戏副本

  1. 营养缺陷型前体菌的过夜培养 E. coli 源自K12的JM83菌株，携带pQE-80L EGFP-H6pQE-80L H6-NowGFP，以及 pQE-80L H6-KillerOrange
    1. 使用无菌移液枪头或接种环从LA培养基平板上挑选单个菌落，并将菌体悬浮于5 mL的Luria-Bertani（LB）培养基中（参见 补充材料含10 g/L葡萄糖， 100 µg/mL 氨苄青霉素）加入无菌的14 mL聚苯乙烯培养管中。
      注意：建议使用新鲜转化的菌落进行接种。步骤 2.2 中所述 LA 培养基平板上的菌株可保存于 4 °C 应在几天内使用。
    2. 将细胞培养物在过夜培养 37 °C 在200-250 rpm的摇床中震荡。
  2. 重组EGFP-H的制备6，H6-现在GFP和H6-含天然脯氨酸的KillerOrange及含脯氨酸类似物的相应蛋白质变体
    1. 接种200 mL新鲜NMM培养基（7.5 mM (NH4)2SO4，50 mM K2HPO4 和 22 mM KH2PO4，8.5 mM NaCl，1 mM MgSO₄4，20 mM D-葡萄糖， 1 µg/mL FeCl2, 1 µg/mL CaCl2, 10 µg/mL 硫胺素， 10 µg/mL 生物素, 0.01 µg/mL 微量元素（CuSO₄4, ZnCl2，MnCl2，（NH4)2MoO4），pH 约 7.2，含所有标准 L-氨基酸（50 mg/L）；参见 补充材料) 加入补充 100 µg/mL 氨苄青霉素与2 mL过夜培养物在2 L锥形瓶中混合。
      注意：根据蛋白质的类型，可选用其他培养基，如 MOPS 培养基52葡萄糖-矿物盐培养基53，戴维斯最低培养基54M9 最小培养基55，或 GMML56 可用于优化蛋白质产量。
    2. 将细胞置于培养环境中孵育 37 °C 在220 rpm的轨道摇床中振荡约3小时30分钟。
    3. 在600 nm处测定光密度（OD600在分光光度计中每30分钟测定一次，直至OD600 达到约 0.7 的值。
      注意：对于 OD600 在分光光度计中测定，比色皿的光程应为1 cm。以相应的培养基作为空白对照（"零"）测量。从孵育开始至 OD600 ~0.7 的值可能取决于培养液体积，3 小时 30 分钟仅为近似值。在本方案的 2.2.1–2.2.3 步骤的变体中，使用 2.1.2 步骤的培养物接种新鲜 NMMΔPro 培养基（参见 补充材料) 并添加有限浓度的脯氨酸（例如 5 mg/L 而非 50 mg/L），细胞在 37°C 下过夜培养 37 °C 在220 rpm的轨道摇床上。第二天，OD600 每30分钟测定一次，直至连续两次测量值之间的差异小于0.05。最大OD600 值应约为 1± 0.3）。初始的有限脯氨酸浓度可根据表达菌株和培养基进行调整（参见讨论部分）。
    4. 3,000 x 重力下离心细胞悬液10 min g 和 4 °C.
    5. 轻轻将上清液倾倒至废液容器中。
    6. 洗涤步骤：将细胞重悬于50 mL预冷的NMM中ΔAA（不含任何氨基酸，参见 补充材料）或 NMMΔPro（不含脯氨酸，参见 补充材料）培养基，小心地进行移液操作。
      注意：此洗涤步骤可使用所述的两种缓冲液中的任意一种，因为该步骤仅需去除孵育介质中残留的脯氨酸。
    7. 通过沉降法将细胞与培养基分离 4 °C 在离心机中以 3,000 x g 10 分钟。
    8. 轻轻将上清液倾倒至废液容器中。
    9. 轻轻吹打，将细胞沉淀重悬于 200 mL NMM 中ΔPro 培养基添加补充物 100 µg/mL 将氨苄青霉素加入2-L锥形瓶中。
      注意：可将所得细胞悬液分装为多个等体积样品，以获得相同的起始培养物，用于比较在脯氨酸（Pro）或脯氨酸类似物存在下蛋白质的表达情况（例如，分装为4份，每份50 mL，置于100 mL锥形瓶中）。
    10. 37 °C。 37 °C 在220 rpm的轨道摇床中 以实现对 Pro 的完全耗尽。
      注意：此步骤对于完全耗尽细胞中的Pro至关重要。
    11. 加入适量的 either L-脯氨酸或 R-Flp、S-Flp、Dfp 和 Dhp，从 50 mM 储存液中添加至细胞悬液，使终浓度为 1 mM。
      注意：通常情况下，Pro 或脯氨酸衍生物的 50 mM 原液应在使用前新鲜配制。只有当特定的天然或非天然氨基酸在水溶液中不发生水解时，才可考虑使用冷冻保存的原液。
    12. 从1 M储存液中加入IPTG至终浓度为0.5 mM，以诱导目标蛋白表达。
    13. 在12小时（过夜）时间内表达目标蛋白 37 °C 在220 rpm的摇床中振荡。
    14. 测量 OD600 第二天。
      注意：OD600 通过测定蛋白表达后细胞数量进行定量。较低的OD600 与洗涤步骤2.2.3之前测得的数值相比，若数值降低，则表明所提供的氨基酸具有细胞毒性。此时应以最低浓度（低至0.1 mM）的所提供氨基酸重复实验。
    15. 离心并在 5,000 x g 和 4 °C 10 分钟后将上清液倾倒至废液容器中。
    16. 洗涤步骤：用 50 mL 结合缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，1 mM DTT）含 10% 甘油，通过轻柔吹打重悬细胞，将细胞悬液转移至 50 mL 圆锥形聚苯乙烯管中。
    17. 离心并在 5,000 x g 下收集细菌细胞 g 和 4 °C 10 分钟后将上清液倾倒至废液容器中。
    18. 将细胞沉淀物置于50 mL锥形聚苯乙烯管中，于-20 °C 或 -80 °C 直至进一步使用（蛋白质纯化，见下文）。

3. 通过固定化金属离子亲和层析（IMAC）纯化蛋白质样品的操作步骤

  1. 细菌细胞裂解
    注意：为防止目标蛋白降解，所有细胞裂解步骤均需在冰上或 4 °C 下进行。
    1. 在冰上或 4 °C 下，将细菌细胞沉淀置于 50 mL 锥形聚苯乙烯管中解冻 10–20 分钟。
    2. 加入 10 mL 冰冷的结合缓冲液（参见补充材料），轻轻吹打混匀以重悬细胞沉淀。
    3. 加入 100 µL 50 mg/mL 溶菌酶、100 µL 1 mg/mL DNase I、100 µL 1 mg/mL RNase A 以及 30 µL 1 M MgCl2。小心倒置细胞悬液 5 次，将封闭的管子置于冰上或 4 °C 下静置 60 分钟。
      注意：溶菌酶通过破坏细菌细胞壁诱导化学裂解。
    4. 使用超声波均质器对样品进行超声破碎（例如，在冰水混合物中对 50 mL 聚苯乙烯管进行 3 次，每次 3 分钟，脉冲 2 秒/暂停 4 秒，振幅 45%）。
      注意：也可采用其他细胞破碎方法，例如在 14,000 psi 压力下进行 20 个循环的高压均质。如有必要，可用结合缓冲液（参见补充材料）稀释至仪器所需的最小体积。此外，也可使用蛋白提取试剂进行细胞破碎。示例参见材料表。
    5. 在 18,000 xg、4 °C 条件下离心 60 分钟。
    6. 记录步骤 3.1.6 中上清液的体积，并将上清液转移至新的 50 mL 聚苯乙烯管中。
    7. 使用孔径为 0.45 µm 的膜过滤器澄清上清液。
    8. 取“裂解液”样品用于 SDS-PAGE 分析（参见下文第 4 节）；该样品对应“可溶性蛋白组分”，即步骤 3.1.6 的上清液。
    9. 根据步骤 3.1.6 测得的体积，加入等体积的 ddH2O 重悬细胞碎片，以确保后续 SDS-PAGE 分析时各样品稀释度一致。
    10. 取“沉淀”样品用于 SDS-PAGE 分析（参见下文第 4 节）；该样品对应“不溶性蛋白组分”，即步骤 3.1.9 中的细胞碎片悬液。
  2. 固定化金属亲和层析（IMAC）纯化
    注意：目标荧光蛋白的纯化可在 4 °C 或室温（RT）下进行。若选择室温操作，需等待裂解液、层析柱及所有缓冲液平衡至室温，以避免冷溶液进入温热层析柱时因溶解空气释放而产生气泡。
    1. 根据制造商说明，使用 1 mL 预装或自装的 IMAC FPLC（快速蛋白[或高效]液相色谱）柱纯化样品；设定最大柱压为 0.3 MPa，流速为 1 mL/min；使用结合缓冲液（参见补充材料）平衡层析柱，洗涤缓冲液（参见补充材料）进行洗涤，洗脱缓冲液（参见补充材料）洗脱目标蛋白。
      注意：也可使用自动 FPLC 系统，通过线性咪唑浓度梯度（20–200 mM）洗脱目标蛋白。
    2. 收集并合并含有荧光蛋白的洗脱组分（根据肉眼可见的绿色或橙色判断）。
    3. 根据制造商说明，将合并的组分转移至透析膜（截留分子量（MWCO）为 5,000–10,000）中，并用透析缓冲液或 MS 缓冲液（参见补充材料）至少透析三次。例如，将 1 mL 样品每次用 100 mL 缓冲液透析，每轮至少 2 小时。详细方案请参考 Budisa 等人34。
    4. 用 PBS 缓冲液（参见补充材料）将透析后的洗脱组分稀释 100 倍。
    5. 在紫外-可见分光光度计中测定稀释样品的吸收光谱。
    6. 根据朗伯-比尔定律，使用特定波长下的摩尔消光系数文献值计算蛋白浓度（EGFP 在 488 nm 处 ε488 = 55,000 cm-1·M-1，NowGFP 在 493 nm 处 ε493 = 53,600 cm-1·M-1，KillerOrange 在 514 nm 处 ε514 = 22,600 cm-1·M-1）：
      figure-protocol-1（朗伯-比尔定律）
      cprotein = 蛋白浓度 [mg/mL]
      A = 特定波长下的吸光度
      ε = 特定波长下的摩尔消光系数 [M-1·cm-1]
      d = 比色皿光程，此处为 1 cm
      MW = 蛋白分子量 [g/mol]
      使用透析缓冲液（参见补充材料）作为空白（“零”）对照。
    7. 取“洗脱液”样品用于 SDS-PAGE 分析（参见下文第 4 节），每孔上样 1–10 µg 蛋白（根据上一步计算结果），用于考马斯亮蓝染色凝胶。
      注意：若使用考马斯亮蓝以外的染色方法或染料，应根据所用染色方法及染料灵敏度调整 SDS-PAGE 上样量。
    8. 将蛋白样品在透析缓冲液（参见补充材料）中分装，于 -80 °C 冻存。
      注意：在此储存条件下，蛋白样品至少可稳定保存 6 个月。实验室常用的紫外-可见及荧光分光光度计可用于测定目标蛋白的吸收光谱和荧光发射光谱。以下激发波长可用于荧光发射检测：488 nm（EGFP）、493 nm（NowGFP）和 510 nm（KillerOrange）。

4. SDS-PAGE 样品制备

  1. 测定第 3 节中“洗脱液”、“裂解液”和“沉淀”样品在 280 nm 处的吸光度 A（A280nm）。通过添加适量洗脱缓冲液调节样品体积，使 A280nm = 2（最终样品体积应至少为 80 µL）。
  2. 按 4:1（v/v）的比例将样品与 5× SDS 上样缓冲液混合（见补充材料），例如，取 80 µL 样品与 20 µL 5× SDS 上样缓冲液通过移液混合。
  3. 将 SDS 样品置于水浴或加热块中，在 95 °C 下煮沸 5 分钟，以使蛋白质变性。
  4. 让样品冷却至室温，并在上样前于微量离心机中以 13,000 ×g 离心 1 分钟。
  5. 使用 5–10 µL 样品进行考马斯亮蓝染色的 SDS-PAGE。有关 SDS-PAGE 实验步骤的详细信息，请参阅57。
    注意：根据所用染色方法和染料的灵敏度调整 SDS 样品上样量。应仔细检查 SDS-PAGE 结果，确保目标蛋白条带（对应预期分子量）中所含蛋白占总蛋白含量的 95% 以上。为此，拍摄考马斯亮蓝染色凝胶图像，并通过密度测定法比较目标分子量蛋白条带与泳道中所有其他条带（如有）的强度。可使用 ImageJ 软件进行条带强度的密度测定分析58。为实验证明目标非天然氨基酸（ncAAs）已成功掺入目标蛋白中，应采用高效液相色谱（HPLC）联用电喷雾电离飞行时间质谱（LC-ESI-TOF-MS）进行完整蛋白质质量分析，具体操作如文献所述59 （参见第 5 节实验方案及其中的材料表以获取示例设备）。

5. 蛋白质变异体的荧光发射

  1. 在实验开始前，检查 SDS-PAGE 实验结果，确保样品纯度 >95%（参见步骤 4.5 后的注释）。
  2. 根据在适当波长下计算得到的吸光度值（见子步骤 3.2.5），将每种纯化后的蛋白变体样品调整至浓度为 0.3 µM，并确保最终样品体积约为 200 µL。
  3. 将稀释后的样品在室温下平衡 1 小时。
  4. 将样品转移至 1 cm 石英比色皿中，使用荧光分光光度计（见材料表），分别采用以下激发波长测定样品的荧光发射光谱：488 nm（用于 EGFP）、493 nm（用于 NowGFP）、510 nm（用于 KillerOrange）。

6. EGFP 变体的变性与复性

  1. 在实验操作之前，检查 SDS-PAGE 实验的结果，以确保样品纯度符合要求。 >95%（参见步骤 4.5 后的注释）
  2. 为每种纯化的蛋白质变体准备两个样品 2 µL 终体积，浓度为 300 µM （参见步骤 3.2.4-3.2.6 中的蛋白质浓度测定）。
  3. 添加 18 µL 1.11× PBS缓冲液（参见 补充材料) 含 8.89 M 尿素和 5.56 mM DTT 的溶液 2 µL 每种纯化后的蛋白质变体（以获得含有8 M尿素和5 mM DTT的1x PBS）以诱导变性。
    注意：对于步骤 6.4–6.6，需分别处理每个样品。
  4. 将样品在5分钟内孵育 95 °C.
  5. 稀释 20 µL 将样品稀释100倍，通过加入 1980 µL 1×PBS（参见 补充材料) 加入 5 mM DTT 以诱导复性，得到 0.3 µM 最终蛋白浓度，并立即转移 200 µL 将样品加入1 cm石英比色皿中。
    注意：此处操作需迅速，因为复性过程会立即开始。
  6. 将石英比色皿插入合适的荧光光谱仪中（参见 材料表）并通过每3秒采集一次荧光光谱，持续30分钟，监测样品中蛋白质的复性过程。对于每种蛋白质变体，第一个样品采用295 nm荧光激发，第二个样品采用488 nm荧光激发。
  7. 将复性样品转移至1.5 mL微量离心管中，盖紧管盖，于室温避光保存24 h，以确保EGFP变体完全复性。
  8. 按照步骤6.6，使用与之前相同的激发波长测定复性蛋白样品的荧光发射，以捕获荧光恢复的时间终点。

结果

在研究开始时，我们选择了三种具有共同亲本GFP结构的不同荧光蛋白变体。第一种选择的蛋白是EGFP，它是一种由水母Aequorea victoria来源的原始绿色荧光蛋白（GFP）经工程改造而来的变体，含有Phe64Leu/Ser65Thr突变。第二种选择的蛋白是NowGFP51,60，它也是通过多步诱变从A. victoria GFP衍生而来的变体，其前体为一系列先前存在的荧光蛋白。与直接前体荧光蛋白“Cerulean”相比，NowGFP含有18个突变61。而“Cerulean”蛋白本身是增强型青色荧光蛋白（ECFP）62,63的衍生物，后者是通过定向实验室进化筛选获得的蛋白，其发色团基于色氨酸。EGFP和NowGFP均广泛应用于细胞生物学和生物物理研究中，且它们的结构中均含有十个保守的脯氨酸残基。此外，NowGFP在第230位还具有第十一 个脯氨酸残基，这是由于该蛋白变体经历了广泛的突变历史所致。第三种选择的蛋白是KillerOrange荧光蛋白64,65，它是来自水螅纲Anthoathecata属的色素蛋白anm2CP的衍生物。该蛋白序列含有15个脯氨酸残基，其发色团基于色氨酸而非酪氨酸。目前已报道了这三种所选蛋白的高分辨率X射线晶体结构（图2）51,65,66。

第一步，加入脯氨酸类似物（图1D）通过选择性压力掺入法（SPI，该实验流程示意图见 图3）。从仪器上而言，该脯氨酸营养缺陷型 E. coli K12 菌株 JM8367 用于在脯氨酸及其类似物存在条件下表达蛋白质（图1D)，分别产生野生型和修饰后的蛋白质。表达天然蛋白及带有S-Flp和Dhp变异体的细胞沉淀物因发色团完整而呈现典型的亮色，而含有R-Flp和Dfp的变异体则保持无色，表明蛋白质发生错误折叠，并在包涵体中沉积未折叠蛋白（图 4A）。对表达样品进行SDS-PAGE分析，证实存在不溶性含R-Flp蛋白（图 4B-D），这限制了进一步的研究。尽管这超出了本研究的范围，但应注意，蛋白质溶解度和错误折叠问题在一定程度上可通过以下方法得到缓解： 体外 复性程序68相比之下，天然蛋白质以及携带 S-Flp 和 Dhp 的变体主要存在于可溶性组分中（图 4B-D）。野生型以及含 S-Flp- 和 Dhp 的变体可通过荧光研究进一步分离和表征。可溶性蛋白通过固定化金属离子亲和层析（IMAC）纯化，EGFP 的产量为每升培养液体积 20–30 mg，NowGFP 和 KillerOrange 的产量为 60–80 mg，野生型与修饰蛋白的产量非常相似。液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析证实了以此方式获得的分离物具有预期的分子身份和纯度。图5在质谱图中，序列中每发生一次脯氨酸被S-Flp取代的反应，其质荷比均产生+18 Da的位移；而每发生一次脯氨酸被Dhp取代的反应，则产生−2 Da的位移。

下一步中，记录了光吸收和发射光谱，以分析非经典脯氨酸类似物的引入对亲本荧光蛋白光谱性质的潜在影响（图6）。UV-Vis 吸收光谱显示，在 280 nm 附近出现典型的吸收峰，这是芳香族残基酪氨酸和色氨酸的特征峰，而发色团的吸收峰在 EGFP 中位于 488 nm，在 NowGFP 中位于 493 nm（图6A、B）。在 KillerOrange 中，发色团吸收区域包含两个吸收带（图6C），对应于复杂发色团的两种可能构型和电荷状态。其中约 510 nm 处的吸收带是已知的高量子产率荧光发射状态49,65。在脯氨酸替换变体中观察到以下结果：Dhp 的引入未改变 EGFP 和 NowGFP 的吸收光谱，而 S-Flp 则导致紫外吸收增强。后者可解释为 S-Flp 诱导了色氨酸残基微环境的变化，特别是位于 PVPWP 基序中三个 S-Flp 之间的 Trp57（图6A、B）69。然而，紫外吸收增强的另一种更简单的解释可能是错误折叠蛋白比例增加所致。由于蛋白浓度是通过吸收特征的定量来评估的，含有未成熟发色团的蛋白会增加吸收值，但该部分并不计入总浓度中（图6A、B）。支持这一假设的是，我们观察到含 S-Flp 的 EGFP 其发色团吸收与色氨酸和酪氨酸总吸收的比值（ε(CRO)/ε(Tyr+Trp) = 0.96）明显低于亲本蛋白中的比值（1.57）（表2）70。在含 S-Flp 的 EGFP 中存在非荧光组分，这将在后续蛋白性质分析中成为一个重要的影响因素。在含 S-Flp 的 KillerOrange 变体中，观察到发色团吸收带不仅吸收增强，还发生了红移。这一现象表明发色团的形成更倾向于具有高荧光量子产率的构型（图6C）。

随后，我们分析了在相应最大吸收波长激发下记录的蛋白质荧光光谱。结果显示，对于含有脯氨酸及其取代物 S-Flp 和 Dhp 的荧光蛋白变体，其光谱基本保持一致。这一结果表明，在任何情况下，这些类似物均未改变发色团的化学环境（图 6G-I）。尽管如此，当 KillerOrange 在 295 nm 处激发（即色氨酸激发）时，其荧光光谱表现出显著差异。该实验检测的是色氨酸侧链与成熟发色团之间发生的荧光共振能量转移（FRET）或直接激子耦合，因为两者之间的距离不超过 25 Å。对于 EGFP 和 NowGFP 变体，当使用 295 nm 激发并测量发射光谱时，观察到强烈的发色团发射信号，而色氨酸发射信号几乎不可见（图 6D，E）。然而，含有 S-Flp 的变体表现出略强的特异性色氨酸发射。这一现象可能与未折叠的脱辅基蛋白的贡献有关，此类蛋白含有色氨酸但尚未形成成熟发色团。在 KillerOrange 中观察到特异性色氨酸发射显著增强，表明其未能通过预期的激发能量转移或激子耦合机制实现荧光猝灭。含有脯氨酸和 S-Flp 的蛋白变体表现出相似的色氨酸发射，同时保留了高量子产率所对应的有利红移荧光特征。相比之下，含有 Dhp 的变体其发色团荧光强度显著降低，可能归因于轻微的结构效应（图 6F）。

接下来，我们通过进行去折叠/复性实验来比较蛋白质的折叠特性。在折叠状态（方案第5节）、化学变性后以及随后的复性过程中（监测24小时，方案第6节），记录荧光发射光谱。激发波长选择在两个相关波长：295 nm，以及发色团吸收光谱的最大值处；所得荧光数据以每种蛋白质的最大值为基准进行归一化处理（图7）。在本方案结束时，我们观察到EGFP变体能够复性，而NowGFP和KillerOrange变体一旦变性后则保持未折叠状态（数据未显示）。因此，原始荧光蛋白的复性能力存在显著差异。值得注意的是，KillerOrange是以水螅类色蛋白变体KillerRed为起点开发的光敏剂65,71，尽管其具有稳定的β-桶状结构，其复性过程通常仍较滞后。在我们的实验中发现，野生型EGFP的发色团荧光仅部分恢复，而色氨酸特异性荧光在复性后反而增强（图7A、D）。含有Dhp的变体也表现出基本相似的行为（图7C、F）。在含S-Flp的EGFP中，当在295 nm色氨酸特异性波长激发时，也观察到类似结果（图7B）。引人注目的是，当在488 nm激发发色团时，荧光恢复程度显著更高（图7E）。这表明S-Flp相较于其他两种变体，能显著提高复性产率。然而，由于未知的分子相互作用，这种有益效应在使用295 nm激发时并未显现。

随后，通过分别记录色氨酸和发色团的荧光变化来监测复性速度，而复性过程的终点则在变性开始后24小时确定。只有EGFP变体表现出相对较快的复性动力学，能够可靠地进行定量评估，而所有变性的NowGFP和KillerOrange变体均未能恢复至可进行进一步定量测量的水平。在EGFP中，色氨酸发射信号的恢复速度是发色团发射信号恢复速度的两倍（分别在750秒和1,500秒内完成），表明其背后存在复杂的机制（图8）。在两种激发波长下，S-Flp的存在均提高了复性速率，这与文献数据一致25。与此同时，含Dhp的变体表现出与野生型相似的复性曲线。

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图1：绿色荧光蛋白（GFP）的结构支架、发色团构建、脯氨酸构象转变及本研究中使用的合成类似物。（A）GFP的结构由β-链组成，形成一个近乎完美的桶状结构（即尺寸为4.2 nm × 2.4 nm的“罐”），两端由α-螺旋“盖”封闭。27 kDa的GFP蛋白具有三级结构，包含十一个β-链、两个短的α-螺旋以及位于中心的发色团。相邻脯氨酸的构象状态与发色团的形成相关。（B） 发色团的自催化成熟（缩合）发生在Ser65、Tyr66和Gly67残基上，并经历多个步骤：首先，多肽主链发生扭转调整，使Thr65的羧基碳靠近Gly67的酰胺氮；随后，甘氨酸的酰胺氮对该碳原子进行亲核攻击并脱水，形成杂环咪唑啉-5-酮环系统；最后，分子氧氧化酪氨酸的α-β碳键，导致咪唑啉环系统的共轭体系延伸，最终包括酪氨酸的苯环及其对位氧取代基，从而使体系产生可见荧光。最终形成的对羟基亚苄基咪唑啉酮发色团位于β-桶的中心，完全与体相溶剂隔离。（C） 1）脯氨酸环（折叠构象）和2）前导酰胺键的骨架结构式与几何构型，代表了脯氨酸残基的主要构象转变。（D） 本研究中使用的脯氨酸类似物及其指定的脯氨酸环折叠构象。该图使用ChemDraw和Discovery Studio Visualizer生成。GFP结构来源于PDB数据库编号2Q6P。请点击此处查看该图的高清版本。

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图 2：本研究中使用的荧光蛋白。 各图显示了三种不同荧光蛋白变体（EGFP、NowGFP 和 KillerOrange）典型的 β-桶状结构的带状表示，其中带状颜色代表各变体荧光发射的颜色。脯氨酸残基（单字母代码）以棍状突出显示，并标注了相应位置。发色团以粗体标出其初始氨基酸组成。所有结构图示均基于以下 PDB 结构条目，使用 PyMol 软件生成：EGFP 对应 2Q6P，NowGFP 对应 4RYS，KillerOrange 对应 4ZFS。请点击此处查看该图的高清版本。

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图3：在特定位点掺入非天然脯氨酸类似物的SPI方法流程图。 将携带目标基因表达质粒的脯氨酸营养缺陷型Escherichia coli（E. coli）宿主菌株在含有全部20种天然氨基酸的限定性最低培养基中培养，直至菌液在600 nm处的光密度（OD600）达到约0.7，此时细胞处于对数生长中期。收集细胞并转移至新鲜的最低培养基中，该培养基含有19种天然氨基酸及一种脯氨酸类似物。加入诱导剂后，进行过夜蛋白表达。最后，通过细胞裂解分离目标蛋白，并在进一步分析前进行纯化。在该方案的一个变体中，细胞在含有19种天然氨基酸的限定性最低培养基中培养，同时仅添加限量的脯氨酸（例如，浓度为其他氨基酸的五分之一）。通过这种方式，细胞在进入对数生长期末期前即耗尽培养基中的脯氨酸，随后加入类似物并诱导目标蛋白的表达。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：EGFP、NowGFP 和 KillerOrange 变体的表达分析。（A） 来自1 mL表达培养物的细胞沉淀，已归一化至OD600 = 2。SDS-PAGE分析分别针对（B） EGFP、（C） NowGFP 和（D） KillerOrange 变体。每种荧光蛋白衍生物的可溶性（S）和不可溶性组分（I）被上样至15%丙烯酰胺凝胶，同时包括可溶性蛋白经IMAC纯化后的洗脱组分（E）。在标注为（M）的泳道中使用PageRuler未染色蛋白Ladder作为分子量标记（M）。特定蛋白的预期位置已用框标出。在脯氨酸位点引入的氨基酸分别为Pro、R-Flp、S-Flp和Dhp（在（A）中，显示的是在相应位置引入Dfp而非Dhp的荧光蛋白变体的细胞沉淀）。凝胶使用1%（w/v）考马斯亮蓝染色。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：荧光蛋白变体的质谱分析。（A）带H6标签的EGFP（黑色）、S-Flp-EGFP（橙色）和Dhp-EGFP（青色）的代表性去卷积ESI-MS谱图，主质荷峰位置以数值标出（单位：Da）。H6标签蛋白的理论分子质量[M+H]+分别为：EGFP为27,745.33 Da（实测值27,746.15 Da）；S-Flp-EGFP为27,925.33 Da（实测值27,925.73 Da）；Dhp-EGFP为27,725.33 Da（实测值27,726.01 Da）。（B）带H6标签的NowGFP（黑色）、S-Flp-NowGFP（橙色）和Dhp-NowGFP（青色）的代表性去卷积ESI-MS谱图，主质荷峰位置以数值标出（单位：Da）。H6标签蛋白的理论质量分别为：NowGFP为27,931.50 Da（实测值27,946.46 Da；约16 Da的差异可能是由于蛋白中甲硫氨酸氧化所致）；S-Flp-NowGFP为28,129.50 Da（实测值28,130.08 Da）；Dhp-NowGFP为27,909.50 Da（实测值27,910.22 Da）。（C）带H6标签的KillerOrange（黑色）、S-Flp-KillerOrange（橙色）和Dhp-KillerOrange（青色）的代表性去卷积ESI-MS谱图，主质荷峰位置以数值标出（单位：Da）。H6标签蛋白的理论质量分别为：KillerOrange为27,606.09 Da（实测值27,605.91 Da）；S-Flp-KillerOrange为27,876.09 Da（实测值27,876.08 Da）；Dhp-KillerOrange为27,576.09 Da（实测值27,575.93 Da）。实测与理论分子质量之间的偏差约1 Da，在ESI-MS仪器的误差范围内。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：荧光蛋白变体的光吸收与荧光发射光谱。 显示了 EGFP 变体 (A)、NowGFP 变体 (B) 和 KillerOrange 变体 (C) 的归一化紫外-可见光吸收光谱。光谱已归一化至发色团吸收峰最大值（约 500 nm）。显示了 EGFP 变体 (D,G)、NowGFP 变体 (E,H) 和 KillerOrange 变体 (F,I) 的归一化荧光发射光谱。(D,E,F) 中的光谱采用紫外光（295 nm）激发测得，(G,H,I) 中的光谱则分别采用 488 nm、493 nm 和 510 nm 的光进行激发，且光谱已归一化至各自发色团发射峰的最大值（约 500 nm）。在每个图中，黑色曲线对应天然脯氨酸荧光蛋白变体的光谱，橙色曲线表示 S-Flp 取代蛋白的光谱，蓝色曲线对应 Dhp 取代蛋白的光谱。请点击此处查看该图的放大版本。

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图7：复性实验中EGFP变体的荧光发射光谱。 天然状态以及变性与复性后，0.3 µM荧光蛋白变体溶液的归一化荧光发射光谱：(A,B,C) 中的光谱是在295 nm紫外光激发下测得的，(A) 为EGFP，(B) 为S-Flp-EGFP，(C) 为Dhp-EGFP。(D,E,F) 中的光谱是在488 nm绿光激发下测得的，(D) 为EGFP，(E) 为S-Flp-EGFP，(F) 为Dhp-EGFP。每种蛋白变体的天然态（黑色曲线）和复性样品（绿色对应EGFP，橙色对应S-Flp-EGFP，蓝色对应Dhp-EGFP）的发射光谱均归一化至相应天然态的最大荧光强度。请点击此处查看该图的放大版本。

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图8：利用荧光监测EGFP变体的蛋白质折叠与发色团成熟过程。（A） 在紫外光（295 nm）激发下，色氨酸荧光区域的荧光发射（发射波长设定为330 nm）。（B）在绿光（488 nm）激发下，发色团发射区域荧光强度的发展变化。时间依赖性的荧光轨迹根据监测时间段末期达到的荧光强度幅值归一化至单位值（100%）。在每个子图中，黑色曲线对应含有天然脯氨酸的荧光蛋白变体的光谱，橙色曲线代表S-Flp取代蛋白的光谱，蓝色曲线对应Dhp取代蛋白的光谱。请点击此处查看该图的高清版本。

表达载体氨基酸序列（6xHis 标签已加下划线）：
EGFP-H6MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVP
WPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTR
AEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVN
FKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDH
MVLLEFVTAAGITLGMDELYKHHHHHH
H6-NowGFPMRGSHHQHHHGSVSKGEKLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGK
MSLKFICTTGKLPVPWPTLKTTLTWGMQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGY
VQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGVDFKEDGNILGHKLEYN
AISGNANITADKQKNGIKAYFTIRHDVEDGSVLLADHYQQNTPIGDGPVLLPD
NHYLSTQSKQSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIPLGADELYK
H6-KillerOrangeMRGSHHHHHHGSECGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPH
GDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQWGEPFFARYPDGISHFAQECFPEG
LSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELSDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQ
LVDILPSETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHLDSKMTFNGSR
AIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAHAHSVPRITSAIGSDQD

表1：目标蛋白的一级结构。 每个序列中的 His-标签均以下划线标出。

λ [nm]ε [M-1·cm-1] (EGFP)ε [M-1·cm-1] (S-Flp-EGFP)ε [M-1·cm-1] (Dhp-EGFP)
488 (≡ CRO)31,657 (± 1,341)22,950 (± 290)27,800 (± 542)
280 (≡ Tyr+Trp)20,116 (± 172)23,800 (± 715)17,300 (± 554)
消光系数 ε（单位为 M-1·cm-1）的数值是根据已知蛋白质浓度下测定的适当 EGFP 变体的紫外-可见吸收光谱计算得出。选定的 280 nm 波长对应芳香族残基酪氨酸和色氨酸的最大吸收峰，而 488 nm 代表发色团的吸收波长。

表2：在选定波长下EGFP变体的消光系数（ε）。 消光系数ε（单位：M-1·cm-1）的数值是通过已知蛋白质浓度下测定的不同EGFP变体的紫外-可见吸收光谱计算得出。所选波长280 nm对应芳香族残基、酪氨酸和色氨酸的最大吸收波长，而488 nm则代表发色团最大吸收波长。

补充材料：储备液和缓冲液的配制 请点击此处下载该文件。

讨论

在自然界中，对蛋白质结构和功能的操控通常源于突变，即蛋白质序列中特定位置的氨基酸身份发生替换。这种自然机制被广泛用作蛋白质工程中的生物技术手段——定点突变，并依赖于参与该过程的20种标准氨基酸。然而，脯氨酸残基的替换存在困难。由于其特殊的主链基团结构，它几乎无法与其他19种氨基酸相互替换72。例如，由于脯氨酸与最常见的二级结构（即α-螺旋和β-折叠）相容性较差，通常被认为是一种二级结构破坏者。当该残基被标准氨基酸库中的其他氨基酸取代时，这一特性很容易丧失。使用脯氨酸的化学类似物进行替换则提供了一种替代策略，可在保留母体脯氨酸残基本身主链基本特征的同时，对其特定的构象转变施加偏向性，或调节分子体积与极性。例如，可通过向细菌培养物中添加羟基脯氨酸、氟代脯氨酸、烷基化脯氨酸、脱氢脯氨酸等类似物，以及具有不同环大小的结构，从而促进含有特定脯氨酸残基修饰的蛋白质的表达。

本研究中描述的选择性压力掺入（SPI）方法可实现对目标蛋白中所有脯氨酸进行全局性、即残基特异性的替换，代之以相关的化学类似物。该方法的重要性体现在，SPI能够实现常规诱变技术无法达到的序列改变。例如，如本研究所示，该方法可产生仅含微小结构变化的目标蛋白，此类变化通常不超过一至两个原子的替换、删除或添加。这类蛋白修饰被称为“原子突变”73,74。在绿色荧光蛋白（GFP）等荧光蛋白中，此类分子干预的影响可体现在折叠速度、局部极性、蛋白堆积程度以及相关结构特征稳定性的变化上。由于对蛋白折叠及残基微环境的影响，吸收光谱和荧光特性也随之发生间接改变。与将脯氨酸突变为其他标准氨基酸残基相比，SPI所实现的分子改变通常具有更高的精确性，而后者通常会对蛋白的折叠、表达与纯化产生不利影响。

作为一种生产方法，选择性压力掺入（SPI）方法利用了氨酰-tRNA合成酶口袋对天然氨基酸化学类似物的底物耐受性。该合成酶负责准确识别氨基酸结构，而氨基酸向蛋白质中的掺入则发生在翻译过程的下游。在操作上，SPI方法中的蛋白质生产、分离与纯化过程与任何其他重组蛋白表达技术典型操作方式相同，但需对方案进行如下补充：用于替换的目标脯氨酸在发酵过程初期即被提供，以使细胞能够生长并建立完整的细胞机制。然而，细胞培养物不允许达到最大光密度，以保持细胞处于适合蛋白表达的对数生长期。在此基础上，SPI方法主要有两种变体。第一种方法是在初始培养基（化学成分明确的培养基）中调整脯氨酸浓度，使其在无外界干预的情况下自然耗尽。细胞在培养基中的脯氨酸耗尽前仍处于对数生长期，随后加入类似物，并诱导目标蛋白的表达。第二种方法则是将细胞在含脯氨酸的培养基中培养至对数生长期中期，此时需将细胞取出，并物理转移至另一种不含脯氨酸、仅含类似物的新培养基中，随后诱导目标蛋白的表达。在这两种方法中，类似物和目标蛋白的诱导试剂均被加入预先培养好的细胞中。野生型蛋白的分离与纯化操作与变异体蛋白相同。原则上，任何可用的脯氨酸营养缺陷型菌株均可作为表达宿主，但建议通过表达测试来确定最合适的宿主。此外，也可通过测试不同的化学成分明确培养基以优化蛋白产量。

对于选择性压力掺入（SPI）所用的化学类似物，需考虑一些特定要求，例如溶解度和浓度。氨基酸的代谢可利用性和细胞摄取依赖于培养基中溶解分子的数量。为提高特定化合物的溶解度，可选择偏酸性或偏碱性的条件。由于这些人工分子可能因其细胞毒性产生抑制细胞生长的效应，因此应将浓度降至最低，以避免细胞应激75。

SPI 的一个微小缺陷是，随着需要替换的位点数量增加，其掺入效率会降低。原则上，可通过定点突变减少目标生物分子中该氨基酸的出现频率来解决此问题。然而，改变蛋白质的一级结构可能会影响其结构和功能特性。

如前所述，SPI 可实现对标准氨基酸的残基特异性 替换。这意味着非标准氨基酸会被插入到目标蛋白中所有标准氨基酸的位置，包括对蛋白功能或折叠至关重要的保守残基。要解决这一问题，唯一可行的方法是采用位点特异性插入技术3。在过去的几十年中，已发展出一种正交配对方法，可生成在预定位置含有修饰残基的蛋白质。该方法最常见的形式被称为终止密码子抑制。该技术基于一种经过改造的正交翻译系统，专用于将合成氨基酸位点特异性地掺入蛋白质中76。迄今为止，已有超过 200 种具有不同侧链修饰的氨基酸通过该方法被成功插入蛋白质77。然而，这些翻译系统目前仍不适用于将脯氨酸类似物插入目标蛋白。此外，由于在改造后的翻译系统中，氨酰-tRNA 合成酶通常仍存在一定的背景错配现象，因此该方法在进行微小氨基酸修饰时效率较低。

通过 SPI 方法，我们制备了多种 β-桶状荧光蛋白变体，并研究了脯氨酸被其非天然类似物取代后的影响。当脯氨酸被 R-Flp 和 Dfp 取代时，表达宿主产生了无功能的蛋白质，该效应很可能是由蛋白质错误折叠引起的。这种错误折叠可能源于 R-Flp 所促进的 C4-exo 构象，而该构象不被天然蛋白质结构所偏好27。对于 Dfp，错误折叠可能归因于脯氨酸残基处 trans-到-cis 肽键异构化速率降低27。已知该过程是蛋白质折叠动力学中的限速步骤之一，会影响 β-桶结构的形成以及后续发色团的成熟。事实上，对于 R-Flp 和 Dfp 这两种氨基酸，蛋白质表达均导致形成聚集且不溶的蛋白产物，因此无法完成发色团的形成，荧光完全丧失。然而，在使用 S-Flp 和 Dhp 的情况下，观察到正常的蛋白质成熟过程，每种类似物与蛋白质组合均获得了具有荧光的蛋白样品。尽管蛋白质的吸收和荧光特性出现了一些调节性变化，但总体上仍与野生型蛋白相近。氨基酸替换的影响在复性动力学研究中得以显现：当以 S-Flp 取代时，复性速度更快。模型研究表明，该残基可能提升 trans-到-cis 酰胺键旋转速率，并促进 C4-endo 构象的形成。这两个因素均可能有助于该残基在 EGFP 中产生有利的动力学效应。相比之下，Dhp 所产生的折叠动力学曲线与亲本蛋白最为相似。在所研究的荧光蛋白中，仅通过原子层面的微小突变即产生多样化的结果，这凸显了 SPI 制备方法在调控目标蛋白质特性方面的潜力。利用类似物取代脯氨酸所诱导的蛋白质改变，进一步对酶78,79,80 和离子通道81,82 的工程化改造，以及蛋白质稳定性的通用设计具有重要意义。

SPI 方法的基本局限性在于其以“全或无”的模式将脯氨酸残基替换为相应的类似物。若能精确选择哪些脯氨酸残基应被类似物取代，而哪些应保持未修饰状态，则将具有显著优势。然而，目前尚无技术可在微生物表达宿主中实现如此精细的蛋白质生产。蛋白质的化学合成83,84以及无细胞表达系统85,86是两种可实现位点特异性脯氨酸修饰的替代方法。但这些方法操作复杂且产量较低，相较于在活细胞中进行表达仍处于劣势。迄今为止，SPI 仍是生产携带原子级突变的复杂蛋白质最为简便且稳健的方法。通过引入非天然氨基酸替代物，该方法可实现对蛋白质特性的靶向调控，本研究中通过脯氨酸替换所引起的荧光蛋白折叠及光吸收/发射性质的改变即为一例。

披露

作者声明所有潜在的利益冲突。

致谢

本工作由德国研究基金会（催化统一系统卓越集群）资助 T.F. 和 N.B.，以及由联邦教育与研究部（BMBF 计划“HSP 2020”，TU-WIMIplus 项目 SynTUBio）资助 F.-J.S. 和 T.M.T.T.。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈VWRHiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642需 LC-MS 级
丙烯酰胺与双丙烯酰胺水溶液储备液（比例 37.5:1，ROTIPHORESE Gel 30）Carl Roth3029.1
琼脂Carl Roth5210
钼酸铵 ((NH4)2MoO4)Sigma-Aldrich277908
过硫酸铵 (APS)Carl Roth9592.2≥98 %，p.a.，需 ACS 级
硫酸铵 ((NH4)2SO4)Sigma-AldrichA4418
氨苄青霉素钠盐Carl RothK029
生物素Sigma-AldrichB4501
溴酚蓝Sigma-AldrichB0126
氯化钙 (CaCl2)Sigma-AldrichC5670
考马斯亮蓝 R 250Carl Roth3862
硫酸铜 (CuSO4)Carl RothCP86.1
D-葡萄糖Carl Roth6780
1,2-双(二甲氨基)乙烷， N,N,N',N'-四甲基乙二胺 (TEMED)Carl Roth2367.3≥99 %，p.a.，用于电泳
1,4-二硫苏糖醇 (DTT)Carl Roth6908
二氯甲烷 (DCM)Sigma-Aldrich270997
磷酸氢二钾 (K2HPO4)Carl RothP749.1
磷酸氢二钠 (Na2HPO4)Carl RothX987
脱氧核糖核酸酶 I (DNase I)Sigma-AldrichD5025
Dowex 50WX8-100（氢型）Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)10731181阳离子交换树脂
乙醇Carl Roth9065.1
甲酸VWRHiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865需 LC-MS 级
冰醋酸Carl Roth3738.5100 %，p. a.
甘油Carl Roth3783
咪唑Carl RothX998
盐酸 (HCl)Merck295426
氯化亚铁 (FeCl2)Sigma-Aldrich380024
异丙醇Carl RothAE73.1
异丙基 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷 (IPTG)Sigma-AldrichI6758
溶菌酶Sigma-AldrichL6876
氯化镁 (MgCl2)Carl RothKK36.1
硫酸镁 (MgSO4)Carl Roth8283.2
氯化锰 (MnCl2)Sigma-Aldrich63535
β-巯基乙醇Carl Roth4227.3
PageRuler 未染色蛋白 MarkerThermo Fisher Scientific26614
氯化钾 (KCl)Carl Roth6781.3
磷酸二氢钾 (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
核糖核酸酶 A (RNase A)Carl Roth7156
氯化钠 (NaCl)Carl RothP029
磷酸二氢钠 (NaH2PO4)Carl RothT879
十二烷基硫酸钠 (NaC12H25SO4)Carl Roth0183
硫胺素Sigma-AldrichT4625
三氟乙酸 (TFA)Sigma-AldrichT6508
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCl)Sigma-Aldrich857645
三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris)Carl Roth5429
胰蛋白胨Carl Roth8952
酵母提取物Carl Roth2363
氯化锌 (ZnCl2)Sigma-Aldrich229997
L-丙氨酸Sigma-AldrichA7627
L-精氨酸Sigma-AldrichA5006
L-天冬酰胺Sigma-AldrichA8381
L-天冬氨酸Sigma-AldrichA0884
L-半胱氨酸Sigma-AldrichC7352
L-谷氨酸Sigma-AldrichG2128
L-谷氨酰胺Sigma-AldrichG3126
L-甘氨酸Sigma-AldrichG7126
L-组氨酸Sigma-AldrichH8000
L-异亮氨酸Sigma-AldrichI2752
L-亮氨酸Sigma-AldrichL8000
L-赖氨酸Sigma-AldrichL5501
L-甲硫氨酸Sigma-AldrichM9625
L-苯丙氨酸Sigma-AldrichP2126
L-脯氨酸Sigma-AldrichP0380
L-丝氨酸Sigma-AldrichS4500
L-苏氨酸Sigma-AldrichT8625
L-色氨酸Sigma-AldrichT0254
L-酪氨酸Sigma-AldrichT3754
L-缬氨酸Sigma-AldrichV0500
(4S)-氟脯氨酸Bachem4033274确保所有脯氨酸类似物不含脯氨酸，检查纯度。否则需增加步骤以在表达过程中消耗脯氨酸污染。
(4R)-氟脯氨酸Bachem4033275确保所有脯氨酸类似物不含脯氨酸，检查纯度。否则需增加步骤以在表达过程中消耗脯氨酸污染
3,4-脱氢脯氨酸Bachem4003545确保所有脯氨酸类似物不含脯氨酸，检查纯度。否则需增加步骤以在表达过程中消耗脯氨酸污染
4,4-二氟脯氨酸EnamineEN400-17448确保所有脯氨酸类似物不含脯氨酸，检查纯度。否则需增加步骤以在表达过程中消耗脯氨酸污染
锥形聚苯乙烯（Falcon）离心管，15 mLFisher Scientific14-959-49B
锥形聚苯乙烯（Falcon）离心管，50 mLFisher Scientific14-432-22
透析膜，截留分子量 (MWCO) 5,000Spectrum Medical IndustriesSpectra/Por MWCO 5000 透析膜，133198
金属离子亲和层析 (IMAC) 柱，1 mL，Ni-NTAGE HealthcareHisTrap HP，1 mL，17-5247-01
鲁尔锁紧注射器，5 mLCarl RothEP96.1
鲁尔锁紧注射器，20 mLCarl RothT550.1
鲁尔锁紧注射器，50 mLCarl RothT552.1
微量离心管，1.5 mLEppendorf30120086
培养皿（聚苯乙烯，无菌）Carl RothTA19
pQE-80L 质粒载体Qiagen已不再提供由 N-末端 pQE 载体套装替代，货号/ID：32915
脯氨酸营养缺陷型 E. coli 菌株 JM83Addgene50348https://www.addgene.org/50348/
脯氨酸营养缺陷型 E. coli 菌株 JM83ATCC35607
圆底聚苯乙烯离心管，14 mLFisher ScientificCorning Falcon，14-959-1B
0.45 µm 聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜注射器滤器Carl RothCCY1.1
用于 LC-ESI-TOF-MS 的高效液相色谱 (HPLC) 柱Sigma-AldrichSupelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC 柱，3 µm 粒径，10 cm x 2.1 mm配锥形 0.1 mL 玻璃内衬、螺口盖和隔垫
高效液相色谱自动进样瓶，1.5 mLSigma-AldrichSupelco 854165
用于 LC-ESI-TOF-MS 的质谱仪AgilentAgilent 6530 Accurate-Mass QTOF
质谱数据分析软件AgilentMassHunter 定性分析软件 v. B.06.00
用于 1.5 mL Eppendorf 管的台式离心机Eppendorf5427 R
用于 50 mL Falcon 管的制冷离心机Eppendorf5810 R
快速蛋白液相色谱 (FPLC) 系统GE HealthcareÄKTA pure 25 L
荧光光谱仪Perkin ElmerLS 55
用于细菌细胞破碎的高压微流化器MicrofluidicsLM 系列，带 “Z” 型腔室
用于细菌培养的旋转摇床Infors HTMinitron
用于液相色谱 (LC) 的蠕动泵GE HealthcareP-1
用于细菌细胞破碎的超声波均质器OmnilabBandelin SONOPULS HD 3200，5650182配 MS72 探头
紫外-可见分光光度计BiochromULTROSPEC 2100
紫外-可见-近红外分光光度计Perkin ElmerLAMBDA 950 UV/Vis/NIR

参考文献

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