方法文章

荧光蛋白中脯氨酸残基特异性替换为脯氨酸类似物：骨架“分子手术”如何影响折叠与稳定性

DOI：

10.3791/63320

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2022年2月3日

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1Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 2Department of Chemistry, University of Manitoba, 3Institute of Physics, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了克服传统定点突变技术的局限性，将带有特定修饰的脯氨酸类似物引入多种荧光蛋白中。我们展示了通过以氟原子取代氢原子，或在脯氨酸残基中将单键替换为双键（“分子手术”）的方式，如何影响蛋白质的基本性质，包括其折叠过程以及与光的相互作用。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过传统的定点突变技术将蛋白质中的脯氨酸（Pro）残基替换为其余19种标准氨基酸中的任意一种，通常会对蛋白质折叠产生不利影响，尤其会影响绿色荧光蛋白及其相关变体中的发色团成熟过程。一种合理的替代方法是调控蛋白质的翻译过程，使得所有脯氨酸残基被特异性地替换为相应的类似物，该方法称为选择性压力整合（selective pressure incorporation, SPI）。内置的化学修饰可作为一种“分子手术”手段，用于精细解析可测量的变化，甚至理性调控不同的蛋白质性质。 全部 Pro残基被替换 残基特异性地 通过类似物进行取代，该方法称为选择性压力掺入（SPI）。内置的化学修饰可作为一种“分子手术”手段 "分子手术" 以精细解析可测量的变化，甚至合理调控不同的蛋白质特性。本研究展示了SPI方法在研究脯氨酸于典型β-桶状结构组织中作用方面的有效性 β-桶状结构，其序列中含有10-15个脯氨酸残基：增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、NowGFP和KillerOrange。Pro残基位于各个β-链之间的连接区域，构成桶状支架的闭合“盖子”，从而负责将发色团与水隔离，即维持其荧光特性。 β-链之间，并构成桶状支架的闭合盖子，因此负责将发色团与水隔绝，即影响其荧光特性。采用（4R-氟脯氨酸（R-Flp）、(4SS-氟代脯氨酸（S-Flp）、4,4-二氟代脯氨酸（Dfp）和3,4-脱氢脯氨酸（Dhp）的实验采用脯氨酸营养缺陷型 E. coli 菌株作为表达宿主。我们发现，含有 S-Flp 和 Dhp 的荧光蛋白具有活性（即具有荧光），而另外两种类似物（Dfp 和 R-Flp）则产生无功能且错误折叠的蛋白质。对含有 Pro 类似物的蛋白质进行紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱分析，结果显示仅有少量特征性变化。对 EGFP 变体的折叠动力学曲线进行分析表明，在 S-Flp 存在时重折叠过程加快，而含有 Dhp 的蛋白质的折叠过程则与野生型相似。本研究展示了 SPI 方法在原子水平上对蛋白质残基进行细微修饰的能力（“分子手术”），"分子手术"），可用于研究其他感兴趣的蛋白质。该研究阐明了在β桶状荧光蛋白类别中，以近似化学类似物替代脯氨酸对蛋白质折叠及光谱特性所产生的影响。 β-桶状荧光蛋白

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

经典的定点突变技术可通过在DNA水平上操纵密码子，实现对现有基因编码蛋白质序列的任意置换。为了研究蛋白质折叠与稳定性，通常希望用结构相似的氨基酸替代物替换相似的氨基酸。然而，传统的蛋白质突变技术仅限于标准遗传密码子库中存在的天然氨基酸之间的结构相似替换，例如Ser/Ala/Cys、Thr/Val、Glu/Gln、Asp/Asn、Tyr/Phe。另一方面，对于色氨酸（Trp）、甲硫氨酸（Met）、组氨酸（His）或脯氨酸（Pro）等其他天然氨基酸，则缺乏此类替换手段，而这些氨基酸在蛋白质中常发挥关键的结构与功能作用1。在蛋白质高度特异的内部结构及其折叠过程的背景下，研究这些相互作用的理想方法是引入非破坏性的等排修饰。事实上，当这些天然氨基酸的等排氨基酸类似物——也称为非天然氨基酸（ncAAs）——被插入蛋白质中时，可在单个原子或原子基团（如H/F、CH2/S/Se/Te）水平上实现细微改变，这类改变被称为“原子突变”2。这种“分子手术”可产生性质发生改变的蛋白质，其性质变化仅源于单个原子或原子基团的交换，在理想情况下，这些变化可被分析并合理解释。通过这种方式，蛋白质合成在研究蛋白质折叠与结构方面的应用范围远远超出了经典的DNA突变技术。需要注意的是，通过定点突变技术产生的蛋白质通常被称为“突变体”（mutants），而含有被替换天然氨基酸的蛋白质则被称为“变体”（variants）3、“异源蛋白质”（alloproteins）4 或“蛋白质同系物”（protein congeners）5。

绿色荧光蛋白（GFP）最初在海洋生物Aequorea victoria中被发现，当暴露于紫外光至蓝光时会发出明亮的绿色荧光6,7。如今，GFP 常被用作高灵敏度的标记工具，通过荧光显微镜常规观察细胞中的基因表达和蛋白质定位。GFP 在多种生物物理8,9,10和生物医学11,12研究中也显示出重要价值，并广泛应用于蛋白质工程13,14,15。对 GFP 结构的深入分析促成了大量变异体的开发，这些变异体具有不同的稳定性和荧光发射峰值16,17。目前在细胞与分子生物学中使用的大多数 GFP 变异体在溶液和晶体状态下均为单体蛋白18。它们的主要结构特征对所有 GFP 家族成员具有普遍性，不受其系统发育来源影响，由11条β-链构成所谓的β-桶结构，一条弯曲的α-螺旋贯穿桶状结构中心，并承载发色团（图1A）。发色团的自催化成熟过程（图1B）需要其周围侧链在蛋白质中心位置精确排列；这些侧链中的许多在其他GFP变异体中高度保守19。在大多数来源于水母（如Aequorea victoria）的荧光蛋白中，发出绿光的发色团包含两个芳香环，分别是Tyr66的酚环和咪唑啉酮的五元杂环结构（图1B）。当发色团正确嵌入蛋白质基质中时，便赋予整个蛋白特征性的荧光。发色团位于结构中心，而桶状结构使其与水相环境隔离20。若发色团暴露于大量水环境中，将导致荧光猝灭，即荧光丧失21。

桶状结构的正确折叠对于保护发色团免受荧光淬灭至关重要22。脯氨酸（Pro）残基在绿色荧光蛋白（GFP）的结构组织中起着特殊作用23。由于无法支持β-链的形成，它们构成了连接环，负责维持整个蛋白质的结构稳定性。因此，在来源于Aequorea和Anthoathecata的GFP中均发现有10至15个脯氨酸残基；其中一些在其他类型的荧光β-桶蛋白中也高度保守。由于其独特的几何特征，脯氨酸预计会显著影响蛋白质的折叠特性。例如，在来源于Aequorea的GFP中，十个脯氨酸残基（图2A）中有九个形成反式肽键，仅有一个形成顺式肽键（Pro89）。Pro58是不可或缺的，即不能被其余19种标准氨基酸所替代。该残基可能负责Trp57残基的正确定位，而Trp57已被报道对发色团成熟及GFP整体折叠至关重要24。包含三个脯氨酸残基（Pro54、Pro56、Pro58）和Trp57的PVPWP片段是GFP结构中“下盖”的关键部分（见图1A）。PVPWP结构模体存在于多种蛋白质中，如细胞色素和真核电压门控钾通道25。在第75位和第89位将脯氨酸替换为丙氨酸也会严重损害蛋白质表达与折叠，并阻断发色团的成熟过程。Pro75和Pro89是“上盖”的组成部分，覆盖在发色团之上（图1A），并在11股β-桶荧光蛋白中高度保守23。这两个“盖子”能够使发色团与水性溶剂隔离，即使在稳定的三级结构部分破坏的情况下仍可维持此隔离状态26。这种特殊的分子结构可保护荧光团免受碰撞式（动态）荧光淬灭，例如由水、氧气或其他可扩散配体引起的淬灭。

为了对 GFP 结构进行分子工程改造，需要在其蛋白质的一级结构中引入氨基酸替换。研究人员已在 GFP 上进行了大量突变，获得了具有更高稳定性、快速且可靠折叠能力以及不同荧光特性的多种变体17。然而，在大多数情况下，对脯氨酸残基的突变被认为是一种高风险的方法，因为其余 19 种标准氨基酸中没有任何一种能够有效恢复脯氨酸残基特有的构象特征27。因此，人们发展出一种替代策略，即用其他基于脯氨酸的结构（称为脯氨酸类似物）来替换脯氨酸残基28。由于其独特的环状化学结构，脯氨酸表现出两种特征性的构象转变（图 1C）：1）脯氨酸环的折叠（ring puckering），这是一种快速过程，涉及主链的排列，主要影响 φ 扭转角；2）肽键的 cis/trans 异构化，这是一种较慢的过程，通过 ω 扭转角影响主链的折叠。由于该过程速度较慢，后者通常成为整个蛋白质折叠过程中的限速步骤。已有研究证实，在某些 GFP 变体的折叠过程中，围绕特定脯氨酸残基的肽键 cis/trans 异构化构成了缓慢的折叠步骤。例如，Pro89 处 cis 肽键的形成是折叠过程中的慢速步骤，因为它依赖于从 trans 到 cis 的键转变29。若将 Pro89 替换为全 trans 构型的肽环，即可消除 cis 到 trans 的异构化事件，从而实现更快的重折叠30。除了 cis/trans 异构化之外，环折叠转变也可能因主链在蛋白质内部的排列与堆积而对蛋白质折叠产生显著影响27,31。

化学修饰会改变脯氨酸残基固有的构象转变，从而影响蛋白质的折叠能力。某些脯氨酸类似物是蛋白质中脯氨酸替换的极具吸引力的候选物，因为它们可用于调控并研究蛋白质的折叠特性。例如，(4R)-氟代脯氨酸（R-Flp）、(4S)-氟代脯氨酸（S-Flp）、4,4-二氟代脯氨酸（Dfp）和3,4-脱氢脯氨酸（Dhp）是四种类似物（图1D），它们在分子体积和极性方面与脯氨酸差异极小32。同时，每种类似物表现出不同的环状折叠构型：S-Flp 稳定 C4-endo 折叠构型，R-Flp 稳定 C4-exo 折叠构型，Dfp 无明显的折叠偏好，而 Dhp 则消除折叠（图1D）33。通过在蛋白质结构中使用这些类似物，可以调控脯氨酸残基的构象转变，进而影响所获得的GFP变体的性质。

在本研究中，我们采用选择性压力掺入法（SPI，图3），将指定的一组脯氨酸类似物（图1D）引入绿色荧光蛋白（GFP）变体的结构中34。用结构最相近的类似物替换氨基酸残基，是蛋白质设计中一项应用性的生物技术理念35,36。因此，模型蛋白中脯氨酸类似物的作用体现了其作为蛋白质工程工具的潜力37。含有目标类似物的蛋白质在经过改造的E. coli菌株中进行表达，这些菌株无法自身合成脯氨酸（脯氨酸营养缺陷型），因而可被强制在蛋白质生物合成过程中接受底物替换38。这种全基因组范围内的脯氨酸替换得以实现，依赖于内源性氨酰-tRNA合成酶天然的底物灵活性39——这类关键酶负责催化tRNA与相应氨基酸之间的酯化反应40。通常如图3所示，细胞在确定培养基中培养至对数中期生长阶段。下一步，在发酵过程中使目标氨基酸在表达系统内胞内耗尽，随后由目标类似物或非天然氨基酸（ncAA）替代。然后诱导目标蛋白表达，以实现残基特异性的非天然氨基酸掺入。这种替换在整个蛋白质组范围内发生。尽管这一副作用可能对宿主菌株的生长产生不利影响，但目标蛋白的生产质量通常不受显著影响，因为在重组表达中，细胞资源主要被导向目标蛋白的合成41,42。因此，严格调控的可诱导表达系统和强启动子对于实现高效掺入至关重要43。我们的方法基于通过有义密码子实现多个残基特异性掺入非天然氨基酸（有义密码子重分配），并通过定点突变调控目标基因中脯氨酸类似物插入位点的数量44。类似的方法已在我们此前关于制备具有抗菌特性的重组肽的报告中应用45。在本研究中，我们应用SPI方法，使所有脯氨酸残基被相应的类似物取代，从而生成预期具备天然氨基酸组无法实现的独特理化性质的蛋白质。通过对所得变体的折叠行为和荧光特性进行表征，旨在展示GFP变体中原子级替换所产生的效应。

方案

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1. 将表达质粒导入感受态的脯氨酸营养缺陷型 E. coli 细胞

  1. 将每种样品质粒（pQE-80L H6-EGFP、pQE-80L H6-NowGFP 和 pQE-80L H6-KillerOrange）各 1 ng 与 50 µL 的化学感受态或电感受态细胞混合，使用源自脯氨酸营养缺陷型 E. coli K12 的菌株 JM83（Addgene #50348 或 ATCC #35607）进行热激法或电穿孔转化，具体操作依据现有方案46,47。
    注：表达载体 pQE-80L EGFP-H6 编码C端带有6×His标签的增强型绿色荧光蛋白（EGFP），表达载体 pQE-80L H6-NowGFP 和 pQE-80L H6-KillerOrange 分别编码N端带有6×His标签的 NowGFP48 或 KillerOrange49，均构建于 pQE-80L 质粒骨架中。所有目标基因均由受 lac 操纵子调控的细菌 T5 启动子驱动表达。筛选标记为氨苄青霉素抗性，复制起点为 colE1。有关 pQE-80L 质粒的更多信息，请参见材料表。其他源自 K-12 和 B 型菌株的脯氨酸营养缺陷型 E. coli 也可用于表达，预期可获得相似结果。经生色团成熟后，H6 标签标记的单质子化（[M+H]+）野生型蛋白的计算分子质量分别为：27,745.33 Da（EGFP-H6）、27,931.50 Da（H6-NowGFP）和 27,606.09 Da（H6-KillerOrange）。目标蛋白的一级结构见表1（His标签部分已加下划线）。NowGFP 的 His 标签序列中的谷氨酰胺（Q）是通过将 Pletnev 等人51 提供的 NowGFP cDNA 亚克隆至 pQE-80L 质粒后经DNA测序确认的，该残基不影响蛋白纯化或荧光蛋白的性质。
  2. 在 37 °C 条件下，将细胞在 950 µL SOC 培养基中复苏 1 小时。
  3. 取 50 µL 复苏后的细胞涂布于含葡萄糖（10 g/L）和氨苄青霉素（100 µg/mL）的Luria琼脂（LA）培养基平板上（见补充材料）。
  4. 将LA培养基平板在37 °C过夜或30 °C培养24小时。

2. 重组野生型荧光蛋白（含有天然脯氨酸）的制备及利用选择性压力掺入法（SPI）制备含脯氨酸类似物（S-Flp、R-Flp、Dfp、Dhp）的荧光蛋白的操作流程

  1. 含有 pQE-80L EGFP-H6、pQE-80L H6-NowGFP 和 pQE-80L H6-KillerOrange 质粒的脯氨酸营养缺陷型 E. coli K12 衍生菌株 JM83 的过夜培养
    1. 使用无菌移液枪头或接种环从 LA 培养基平板上挑取单菌落，并用 5 mL 溶于无菌 14 mL 聚苯乙烯培养管中的溶菌肉汤（LB）培养基（见补充材料；含 10 g/L 葡萄糖、100 µg/mL 氨苄青霉素）重悬细胞。
      注意：建议使用新鲜转化的菌落进行接种。步骤 2.2 中制备的 LA 培养基平板上的菌落若存放于 4 °C，应在数日内使用。
    2. 将细胞培养物在 37 °C 下以 200–250 rpm 的转速于摇床中培养过夜。
  2. 重组 EGFP-H6、H6-NowGFP 和 H6-KillerOrange 蛋白及其含天然脯氨酸类似物的蛋白变体的制备
    1. 在 2-L 三角烧瓶中，将 2 mL 过夜培养物接种至 200 mL 新鲜 NMM 培养基中（7.5 mM (NH4)2SO4、50 mM K2HPO4 和 22 mM KH2PO4、8.5 mM NaCl、1 mM MgSO4、20 mM D-葡萄糖、1 µg/mL FeCl2、1 µg/mL CaCl2、10 µg/mL 硫胺素、10 µg/mL 生物素、0.01 µg/mL 微量元素（CuSO4、ZnCl2、MnCl2、(NH4)2MoO4），pH ~7.2），该培养基补充了全部 19 种标准 L-氨基酸（50 mg/L）和 100 µg/mL 氨苄青霉素；见补充材料）。
      注意：根据目标蛋白类型，可尝试使用其他培养基（如 MOPS 培养基52、葡萄糖-无机盐培养基53、Davis 最小培养基54、M9 最小培养基55 或 GMML56）以优化蛋白产量。
    2. 将细胞在 37 °C 下以 220 rpm 的转速于摇床中培养约 3 小时 30 分钟。
    3. 每隔 30 分钟使用分光光度计测定 600 nm 处的光密度（OD600），直至 OD600 值达到约 0.7。
      注意：使用分光光度计测定 OD600 时，比色皿的光程应为 1 cm。参比（“零”）测量应使用相应的培养基。达到 OD600 ~0.7 所需的培养时间可能因培养体积而异，3 小时 30 分钟为近似值。在本步骤 2.2.1–2.2.3 的变体中，可使用步骤 2.1.2 的培养物接种补充有限浓度脯氨酸（例如 5 mg/L 而非 50 mg/L）的新鲜 NMMΔPro 培养基（见补充材料），并在 37 °C 下以 220 rpm 的转速过夜培养。次日每隔 30 分钟测定 OD600，直至连续测量值差异小于 0.05。最大 OD600 值应约为 1（±0.3）。初始脯氨酸浓度可根据表达菌株和培养基进行调整（见讨论）。
    4. 在 4 °C、3,000 x g 条件下离心 10 分钟，沉淀细胞悬浮液。
    5. 小心倾去上清液至废液容器中。
    6. 洗涤步骤：通过轻柔移液，用 50 mL 冰冷的 NMMΔAA（不含任何氨基酸，见补充材料）或 NMMΔPro（不含脯氨酸，见补充材料）培养基重悬细胞。
      注意：此洗涤步骤可使用上述任一缓冲液，因该步骤仅需去除培养基中残留的脯氨酸。
    7. 在 4 °C 下以 3,000 x g 离心 10 分钟，使细胞沉淀分离。
    8. 小心倾去上清液至废液容器中。
    9. 轻柔地反复移液，将细胞沉淀重悬于含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 200 mL NMMΔPro 培养基中，并转移至 2-L 三角烧瓶。
      注意：所得细胞悬浮液可分装为多个等体积样品，以便在含脯氨酸或脯氨酸类似物的条件下平行比较蛋白表达（例如，分装为 4 份 50 mL 样品，置于 100 mL 三角烧瓶中）。
    10. 在 37 °C 下以 220 rpm 的转速孵育 30 分钟，以彻底耗尽细胞内的脯氨酸。
      注意：此步骤对完全清除细胞内脯氨酸至关重要。
    11. 从 50 mM 储存液中加入适量的 L-脯氨酸、R-Flp、S-Flp、Dfp 或 Dhp，使细胞悬浮液中终浓度为 1 mM。
      注意：通常应在使用前新鲜配制脯氨酸或其衍生物的 50 mM 储存液。仅当特定标准或非标准氨基酸在水溶液中不易水解时，方可使用冷冻储存液。
    12. 加入 0.5 mM IPTG（来自 1 M 储存液）以诱导目标蛋白表达。
    13. 在 37 °C 下以 220 rpm 的转速表达目标蛋白过夜（12 小时）。
    14. 次日测定 OD600。
      注意：OD600 测定用于量化蛋白表达后的细胞量。若 OD600 值低于洗涤步骤 2.2.3 前的测量值，表明所添加氨基酸具有细胞毒性。此时应降低所添加氨基酸的浓度（可低至 0.1 mM）后重复实验。
    15. 在 4 °C、5,000 x g 条件下离心 10 分钟，收集菌体细胞，并将上清液倾入废液容器。
    16. 洗涤步骤：用 50 mL 结合缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，1 mM DTT）含 10% 甘油，轻柔移液重悬细胞，并将细胞悬浮液转移至 50 mL 圆锥形聚苯乙烯离心管中。
    17. 在 4 °C、5,000 x g 条件下离心 10 分钟，收集菌体细胞，并将上清液倾入废液容器。
    18. 将细胞沉淀保存于 50 mL 圆锥形聚苯乙烯离心管中，置于 -20 °C 或 -80 °C，直至后续使用（蛋白纯化，见下文）。

3. 通过固定化金属离子亲和层析（IMAC）纯化蛋白质样品的流程

  1. 细菌细胞裂解
    注意：所有细胞裂解步骤均需在冰上或 4 °C 下进行，以防止目标蛋白降解。
    1. 在冰上或 4 °C 下，将细菌细胞沉淀置于 50 mL 圆锥形聚苯乙烯管中解冻 10–20 分钟。
    2. 加入 10 mL 冰冷的结合缓冲液（参见补充材料），轻轻吹打混匀，使细胞沉淀充分重悬。
    3. 加入 100 µL 50 mg/mL 溶菌酶、100 µL 1 mg/mL DNase I、100 µL 1 mg/mL RNase A 和 30 µL 1 M MgCl2。小心倒置细胞悬液 5 次，将密闭的管子置于冰上或 4 °C 下静置 60 分钟。
      注意：溶菌酶通过破坏细菌细胞壁实现化学裂解。
    4. 使用超声波均质器对样品进行超声破碎（例如，在冰水混合物中对 50 mL 聚苯乙烯管进行 3 次，每次 3 分钟，脉冲 2 秒/暂停 4 秒，振幅 45%）。
      注意：也可采用其他细胞破碎方法，例如在 14,000 psi 压力下进行 20 个循环的高压均质。如有需要，可用结合缓冲液（参见补充材料）稀释至仪器所需的最小体积。此外，也可使用蛋白提取试剂进行细胞破碎。参见材料表中的示例。
    5. 在 18,000 xg、4 °C 条件下离心 60 分钟。
    6. 记录下步骤 3.1.6 中所得液体体积，并将上清液转移至新的 50 mL 聚苯乙烯管中。
    7. 使用孔径为 0.45 µm 的膜滤器对上清液进行澄清过滤。
    8. 取“裂解液”样品用于 SDS-PAGE 分析（参见下文第 4 节）；该样品对应“可溶性蛋白组分”，即步骤 3.1.6 的上清液。
    9. 根据步骤 3.1.6 所得体积，加入等体积的 ddH2O 以重悬细胞碎片，确保后续 SDS-PAGE 分析中各样品稀释度一致。
    10. 取“沉淀”样品用于 SDS-PAGE 分析（参见下文第 4 节）；该样品对应“不溶性蛋白组分”，即步骤 3.1.9 所得的细胞碎片悬液。
  2. 固定化金属亲和层析（IMAC）纯化
    注意：目标荧光蛋白的纯化可在 4 °C 或室温（RT）下进行。若选择室温操作，需先将裂解液、层析柱及所有缓冲液平衡至室温，以避免冷溶液进入温热层析柱时因溶解空气释放而产生气泡。
    1. 根据制造商说明，使用 1 mL 预装或自制的 IMAC FPLC（快速蛋白[或性能]液相色谱）柱对样品进行纯化；设定最大柱压为 0.3 MPa，流速为 1 mL/min；使用结合缓冲液（参见补充材料）平衡层析柱，洗涤缓冲液（参见补充材料）进行洗涤，洗脱缓冲液（参见补充材料）洗脱目标蛋白。
      注意：也可使用自动 FPLC 系统，通过线性咪唑浓度梯度（20–200 mM）洗脱目标蛋白。
    2. 收集并合并含有荧光蛋白的洗脱组分（根据肉眼可见的绿色或橙色选择）。
    3. 根据制造商说明，将合并的组分转移至透析膜（截留分子量（MWCO）为 5,000–10,000）中，并使用透析缓冲液或 MS 缓冲液（参见补充材料）至少透析三次。例如，将 1 mL 样品每次用 100 mL 缓冲液透析，每次至少 2 小时，共三次。详细方案请参见 Budisa 等人34。
    4. 用 PBS 缓冲液（参见补充材料）将透析后的洗脱组分稀释 100 倍。
    5. 在紫外-可见分光光度计中测定稀释样品的吸收光谱。
    6. 根据朗伯-比尔定律，使用特定波长下的摩尔消光系数 ε 计算蛋白浓度，公式如下（文献值：EGFP 在 488 nm 处 ε488 = 55,000 cm-1·M-1，NowGFP 在 493 nm 处 ε493 = 53,600 cm-1·M-1，KillerOrange 在 514 nm 处 ε514 = 22,600 cm-1·M-1）：
      分光光度法中蛋白浓度公式；c_protein = A/ε·d · MW；方程 （朗伯-比尔定律）
      cprotein = 蛋白浓度 [mg/mL]
      A = 特定波长下的吸光度
      ε = 特定波长下的摩尔消光系数 [M-1·cm-1]
      d = 比色皿光程，此处为 1 cm
      MW = 蛋白分子量 [g/mol]
      使用透析缓冲液（参见补充材料）作为空白（“零”）对照进行测定。
    7. 取“洗脱液”样品用于 SDS-PAGE 分析（参见下文第 4 节），在考马斯亮蓝染色凝胶中每孔上样 1–10 µg 蛋白（根据上一步计算结果确定）。
      注意：若使用考马斯亮蓝以外的染色剂，应根据所用染色方法及染料灵敏度调整 SDS 样品上样量。
    8. 将蛋白样品在透析缓冲液（参见补充材料）中分装，于 -80 °C 冻存。
      注意：在此储存条件下，蛋白样品至少可稳定保存 6 个月。也可使用其他实验室的紫外-可见及荧光分光光度计测定目标蛋白的吸收和荧光发射光谱。荧光发射测定时可使用以下激发波长：488 nm（EGFP）、493 nm（NowGFP）和 510 nm（KillerOrange）。

4. SDS-PAGE 样品制备

  1. 测定第3节中“洗脱液”、“裂解液”和“沉淀”样品在280 nm处的吸光度（A280nm）。通过加入适量洗脱缓冲液调整样品体积，使A280nm达到2（最终样品体积应至少为80 µL）。
  2. 按4:1（v/v）的比例将样品与5×SDS上样缓冲液混合（参见补充材料），例如，取80 µL样品与20 µL 5×SDS上样缓冲液用移液器混合。
  3. 将SDS样品置于水浴或加热块中，在95 °C下煮沸5分钟，以变性蛋白质。
  4. 让样品冷却至室温，然后在上样前于微量离心机中以13,000 ×g离心1分钟。
  5. 取5–10 µL进行考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析。SDS-PAGE操作细节请参阅57。
    注意：根据所用染色方法及染料的灵敏度，适当调整SDS样品上样量。应仔细检查SDS-PAGE结果，确保目标蛋白条带中的蛋白含量占总蛋白的95%以上。为此，拍摄考马斯亮蓝染色凝胶的图像，并通过密度测定法比较目标分子量蛋白条带与泳道中其他所有条带（如有）的强度。可使用ImageJ软件进行条带强度的密度测定分析58。为实验性验证目标非天然氨基酸（ncAA）在目标蛋白中的成功掺入，应按照文献描述进行高效液相色谱（HPLC）耦合电喷雾电离飞行时间质谱（LC-ESI-TOF-MS）的完整蛋白质质量分析59（参见第5节实验方案及其中的材料表以获取示例设备）。

5. 蛋白质变体的荧光发射

  1. 在进行操作之前，检查 SDS-PAGE 实验结果，确保样品纯度 >95%（参见步骤 4.5 后的 NOTE）。
  2. 根据在相应波长下计算得到的吸光度值（子步骤 3.2.5），将每种纯化后的蛋白变体样品调整至浓度为 0.3 µM，并确保最终样品体积约为 200 µL。
  3. 将稀释后的样品在室温下平衡 1 小时。
  4. 将样品转移至 1 cm 石英比色皿中，使用荧光分光光度计（见材料表）测量样品的荧光发射光谱，激发波长分别设置为：488 nm（用于 EGFP）、493 nm（用于 NowGFP）、510 nm（用于 KillerOrange）。

6. EGFP 变体的变性与复性

  1. 实验前，检查 SDS-PAGE 实验结果，确保样品纯度 >95%（参见步骤 4.5 后的注释）。
  2. 为每种纯化的蛋白质变体准备两个样品，每个样品终体积为 2 µL，浓度为 300 µM（参见蛋白质浓度测定步骤 3.2.4–3.2.6）。
  3. 向每种纯化的蛋白质变体 2 µL 样品中加入 18 µL 含 8.89 M 尿素和 5.56 mM DTT 的 1.11x PBS 缓冲液（参见补充材料），使终浓度为 1x PBS、8 M 尿素和 5 mM DTT，以诱导变性。
    注：步骤 6.4–6.6 中需分别处理每个样品。
  4. 将样品在 95 °C 下孵育 5 分钟。
  5. 通过向 20 µL 样品中加入含 5 mM DTT 的 1x PBS 缓冲液（参见补充材料）1980 µL，进行 100 倍稀释，以诱导复性，最终蛋白质浓度为 0.3 µM，并立即转移 200 µL 样品至 1 cm 石英比色皿中。
    注：此步骤操作需迅速，因复性过程立即开始。
  6. 将石英比色皿插入合适的荧光光谱仪中（参见材料表），通过每 3 秒采集一次荧光光谱，持续监测 30 分钟内样品的蛋白质复性过程。对每种蛋白质变体，第一个样品使用 295 nm 荧光激发，第二个样品使用 488 nm 荧光激发。
  7. 将复性样品转移至 1.5 mL 微离心管中，盖紧管盖，并在避光条件下室温保存 24 小时，以确保 EGFP 变体完全复性。
  8. 使用与之前相同的激发波长，按照步骤 6.6 测定复性后蛋白质样品的荧光发射，以记录荧光恢复的时间终点。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在研究初期，我们选择了三种具有共同亲本GFP结构的不同荧光蛋白变体。第一种选择的蛋白是EGFP，它是一种经过改造的变体，源自水母Aequorea victoria的原始绿色荧光蛋白（GFP），含有Phe64Leu/Ser65Thr突变。第二种选择的蛋白是NowGFP51,60，它也是通过多轮诱变从A. victoria GFP逐步演化而来的荧光蛋白变体。NowGFP与其直接前体荧光蛋白“Cerulean”相比含有18个突变61。而“Cerulean”蛋白本身是增强型青色荧光蛋白（ECFP）62,63的衍生物，后者是通过定向实验室进化筛选获得的、以色氨酸为基础形成发色团的蛋白。EGFP和NowGFP均被广泛应用于细胞生物学和生物物理研究中，其结构中均含有十个保守的脯氨酸残基。此外，由于NowGFP蛋白变体经历了广泛的突变历程，其第230位还额外出现了一个第十一号脯氨酸残基。第三种选择的蛋白是KillerOrange荧光蛋白64,65，它来源于水螅纲Anthoathecata属的色蛋白anm2CP。该蛋白序列含有15个脯氨酸残基，其发色团基于色氨酸而非酪氨酸。这三种选定蛋白的高分辨率X射线晶体结构均已报道（图2）51,65,66。

第一步，将脯氨酸类似物（图 1D) 通过选择性压力整合（SPI，该方法的流程图见于 图3）。实验上，使用脯氨酸营养缺陷型 E. coli K12 菌株 JM8367 用于在脯氨酸及其类似物存在下表达蛋白质（图1D)，分别得到野生型和修饰后的蛋白质。表达天然蛋白质以及含有S-Flp和Dhp变异体的细胞沉淀呈现典型的亮色，表明发色团完整；而含有R-Flp和Dfp的变异体则保持无色，表明蛋白质发生错误折叠，并在包涵体中沉积未折叠蛋白。图4A）。表达样品的SDS-PAGE分析证实了含有R-Flp的不溶性蛋白的存在（图 4B-D），这阻碍了进一步的研究。尽管这超出了本研究的范围，但应注意，蛋白质溶解度及错误折叠问题在一定程度上可通过 体外 重折叠步骤68相比之下，天然蛋白质以及含有 S-Flp 和 Dhp 的变异体主要存在于可溶性组分中（图 4B-D）。野生型以及含 S-Flp 和 Dhp 的变体可进一步分离并用于荧光性质研究。可溶性蛋白通过固定化金属离子亲和层析（IMAC）纯化，每升培养液体积可获得 20–30 mg 的 EGFP，60–80 mg 的 NowGFP 和 KillerOrange，野生型与修饰蛋白的产量非常相近。液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析证实了以此方式获得的纯化产物具有预期的分子身份和纯度。图5在质谱图中，每处脯氨酸被 S-Flp 取代导致序列中每个脯氨酸残基产生 +18 Da 的质量偏移，而脯氨酸被 Dhp 取代时，每个残基的质量偏移为 −2 Da。

接下来，记录了光吸收和发射光谱，以分析非天然脯氨酸类似物的引入对亲本荧光蛋白光谱特性可能产生的影响（图6）。紫外-可见吸收光谱在280 nm附近显示出芳香族残基（酪氨酸和色氨酸）的典型吸收峰，而EGFP的发色团吸收峰位于488 nm，NowGFP则位于493 nm（图6A、B）。在KillerOrange中，发色团吸收区域包含两个吸收峰（图6C），对应于复杂发色团的两种可能构型和电荷状态。其中约510 nm处的吸收峰对应于具有高量子产率的荧光发射状态49,65。在脯氨酸替换变体中观察到以下现象：Dhp的引入未改变EGFP和NowGFP的吸收光谱，而S-Flp则导致紫外吸收增强。后者可归因于色氨酸残基微环境的改变，特别是位于PVPWP基序中三个S-Flp之间的Trp57所受的影响（图6A、B）69。然而，紫外吸收增强也可能源于错误折叠蛋白比例的增加。由于蛋白浓度是通过吸收特征进行定量的，含有未成熟发色团的蛋白会增加吸收值，但该部分并不计入总浓度中（图6A、B）。支持这一假设的是，我们发现含S-Flp的EGFP其发色团吸收与酪氨酸和色氨酸总吸收的比值（ε(CRO)/ε(Tyr+Trp) = 0.96）明显低于亲本蛋白的比值（1.57）（表2）70。因此，在含S-Flp的EGFP中存在非荧光组分，这将在后续蛋白性质分析中成为一个重要的影响因素。在含S-Flp的KillerOrange变体中，观察到发色团吸收峰不仅增强，还发生了红移。这一现象表明，发色团的形成更倾向于具有高荧光量子产率的构型（图6C）。

随后，我们分析了在相应最大吸收波长激发下记录的蛋白质荧光光谱。结果表明，含有脯氨酸及其替代物 S-Flp 和 Dhp 的各荧光蛋白变体的光谱基本保持一致。该结果说明，在这些情况下，类似物并未改变生色团的化学环境（图 6G-I）。尽管如此，在 KillerOrange 中以 295 nm 激发时记录的荧光光谱显示出明显差异，即通过色氨酸激发进行检测。该实验用于追踪色氨酸侧链与成熟生色团之间的荧光共振能量转移（FRET）或直接激子耦合，二者之间的距离不超过 25 Å。对于 EGFP 和 NowGFP 变体，当以 295 nm 激发并测量发射光谱时，观察到强烈的生色团发射，而色氨酸发射几乎不可见（图 6D、E）。然而，含有 S-Flp 的变体表现出略强的色氨酸特异性发射。这一现象可能与未折叠的脱辅基蛋白中色氨酸的存在但缺乏成熟生色团的贡献有关。在 KillerOrange 中，色氨酸特异性发射显著增强，表明通过预期的激发能量转移或激子耦合机制发生的荧光淬灭未能有效进行。含有脯氨酸和 S-Flp 的蛋白变体表现出相近的色氨酸发射，同时保留了高量子产率所对应的有利红移荧光特征。相比之下，含有 Dhp 的变体显示出生色团荧光强度的急剧下降，可能归因于微小的结构效应（图 6F）。

接下来，我们通过去折叠/复性实验比较了蛋白质的折叠特性。在折叠状态（方案第5节）、化学变性后以及随后的复性过程中（监测24小时，方案第6节），记录了荧光发射光谱。激发波长分别选择在两个相关波长：295 nm以及发色团吸收光谱的最大值处，所得荧光强度均归一化至每种蛋白质自身的最大值（图7）。在实验结束时，我们观察到EGFP变体能够复性，而NowGFP和KillerOrange变体一旦变性后则保持非折叠状态（数据未显示）。因此，原始荧光蛋白的复性能力存在显著差异。值得注意的是，KillerOrange是以水螅类色素蛋白变体KillerRed为起点开发的光敏剂65,71，尽管其具有稳定的β-桶状结构，其复性过程通常较为滞后。在我们的实验中发现，野生型EGFP的发色团荧光仅部分恢复，而色氨酸特异性荧光在复性后反而增强（图7A、D）。含有Dhp的变体也表现出基本相似的行为（图7C、F）。在含有S-Flp的EGFP中，当以295 nm（色氨酸特异性波长）激发时，结果与此类似（图7B）。值得注意的是，当以488 nm激发发色团时，荧光恢复程度显著更高（图7E）。这表明，与另外两种变体相比，S-Flp能够显著提高复性产率。然而，由于未知的分子相互作用，该有益效应在295 nm激发下并未显现。

随后，通过分别记录色氨酸和生色团的荧光来监测复性速度，复性过程的终点确定为变性开始后24小时。只有EGFP的变体表现出相对较快且可可靠评估的复性动力学，而所有变性的NowGFP和KillerOrange变体均未能恢复至可进行进一步定量测量的水平。在EGFP中，色氨酸发射恢复的速度是生色团发射恢复速度的两倍（前者在750秒内完成，后者在1,500秒内完成），表明其背后过程的复杂性（图8）。在两种激发波长下，含S-Flp的变体复性速率均提高，与文献数据一致25。与此同时，含Dhp的变体则表现出与野生型相似的复性曲线。

蛋白质结构与序列示意图；β-桶状结构、发色团形成、脯氨酸异构化。
图1：绿色荧光蛋白（GFP）的结构骨架、发色团构建、脯氨酸构象转变及本研究中使用的合成类似物。（A） GFP 的结构由形成近乎完美桶状（即尺寸为 4.2 nm × 2.4 nm 的“罐”）的 β-链组成，桶的两端由 α-螺旋“盖”封闭。27 kDa 的 GFP 蛋白具有包含十一个 β-链、两个短 α-螺旋以及位于中心的发色团的三级结构。相邻脯氨酸的构象状态与发色团的形成相关。（B） 发色团在 Ser65、Tyr66 和 Gly67 残基处发生自催化成熟（缩合），该过程分多个步骤进行：首先，多肽主链发生扭转调整，使 Thr65 的羧基碳靠近 Gly67 的酰胺氮；随后，甘氨酸的酰胺氮对该碳原子进行亲核攻击并伴随脱水，形成杂环咪唑啉-5-酮环系；最后，分子氧氧化酪氨酸的 α-β 碳键，导致咪唑啉环系共轭体系延伸，最终包括酪氨酸的苯环及其对位氧取代基，从而使体系产生可见荧光。最终形成的对羟基亚苄基咪唑啉酮发色团完全与体相溶剂隔离。（C） 1）脯氨酸环（折叠构象）和 2）前导酰胺键的骨架结构式及其几何构型，代表了脯氨酸残基的主要构象转变。（D） 本研究中使用的脯氨酸类似物及其指定的脯氨酸环折叠构象。该图使用 ChemDraw 和 Discovery Studio Visualizer 生成。GFP 结构来源于 PDB 数据库编号 2Q6P。请点击此处查看该图的高清版本。

蛋白质结构比较；EGFP、NowGFP、KillerOrange；β-桶状结构、发色团、三维模型。
图 2：本研究所用的荧光蛋白。 各图展示了三种不同荧光蛋白变体典型的 β-桶状结构的带状表示，分别为 EGFP、NowGFP 和 KillerOrange，其中带状颜色代表各变体荧光发射的颜色。脯氨酸残基（单字母代码）以棍状突出显示，并标注了相应位置。发色团以初始氨基酸组成加粗显示。所有结构图示均基于以下 PDB 结构条目，使用 PyMol 软件生成：EGFP 对应 2Q6P，NowGFP 对应 4RYS，KillerOrange 对应 4ZFS。 请点击此处查看该图的放大版本。

大肠杆菌细菌蛋白生产流程图，包括培养生长和蛋白纯化步骤。
图3：非天然脯氨酸类似物残基特异性整合的SPI方法流程图。 携带目标基因表达质粒的脯氨酸营养缺陷型Escherichia coli（E. coli）宿主菌株在含有全部20种标准氨基酸的限定最小培养基中培养，直至OD600达到约0.7，此时菌体处于对数生长中期。收集细胞并转移至含有19种标准氨基酸和一种脯氨酸类似物的新鲜最小培养基中。加入诱导剂后，进行过夜蛋白表达。最后通过细胞裂解分离目标蛋白，并在进一步分析前进行纯化。在该方案的一个变体中，细胞在含有19种标准氨基酸的限定最小培养基中培养，仅添加有限量的脯氨酸（例如，其他氨基酸浓度的五分之一）。通过这种方式，细胞在退出对数生长期前即耗尽培养基中的脯氨酸，随后添加类似物并诱导目标蛋白的生产。请点击此处查看本图的放大版本。

蛋白质表达分析；SDS-PAGE 凝胶结果；荧光蛋白类型；Pro、R-Flp、S-Flp、Dhp。
图 4：EGFP、NowGFP 和 KillerOrange 变体的表达分析。（A） 来自 1 mL 表达培养物的细胞沉淀，已归一化至 OD600 = 2。可溶性（S）和不可溶性组分（I）以及经 IMAC 纯化的可溶性蛋白洗脱组分（E）分别上样于 15% 丙烯酰胺凝胶，用于分析（B） EGFP、（C） NowGFP 和（D） KillerOrange 变体。蛋白条带标记使用 PageRuler 未染色蛋白 Ladder（M）。特定蛋白的预期位置已用方框标出。在脯氨酸位点引入的氨基酸为 Pro、R-Flp、S-Flp 和 Dhp（在（A）中显示的是用 Dfp 替代 Dhp 的荧光蛋白变体的细胞沉淀）。凝胶使用 1%（w/v）考马斯亮蓝染色。请点击此处查看该图的放大版本。

质谱图、蛋白质质谱分析、EGFP、NowGFP、KillerOrange 峰值比较
图 5：荧光蛋白变体的质谱分析。（A） H6-标记的 EGFP（黑色）、S-Flp-EGFP（橙色）和 Dhp-EGFP（青色）的代表性去卷积 ESI-MS 谱图，主质量峰位置以数字标出（单位：Da）。H6-标记蛋白的理论分子质量 [M+H]+ 分别为：EGFP 27,745.33 Da（实测 27,746.15 Da）；S-Flp-EGFP 27,925.33 Da（实测 27,925.73 Da）；Dhp-EGFP 27,725.33 Da（实测 27,726.01 Da）。（B） H6-标记的 NowGFP（黑色）、S-Flp-NowGFP（橙色）和 Dhp-NowGFP（氰色）的代表性去卷积 ESI-MS 谱图，主质量峰位置以数字标出（单位：Da）。H6-标记蛋白的理论质量分别为：NowGFP 27,931.50 Da（实测 27,946.46 Da；约 16 Da 的差异可能是由于蛋白中甲硫氨酸的氧化所致）；S-Flp-NowGFP 28,129.50 Da（实测 28,130.08 Da）；Dhp-NowGFP 27,909.50 Da（实测 27,910.22 Da）。（C） H6-标记的 KillerOrange（黑色）、S-Flp-KillerOrange（橙色）和 Dhp-KillerOrange（青色）的代表性去卷积 ESI-MS 谱图，主质量峰位置以数字标出（单位：Da）。H6-标记蛋白的理论质量分别为：KillerOrange 27,606.09 Da（实测 27,605.91 Da）；S-Flp-KillerOrange 27,876.09 Da（实测 27,876.08 Da）；Dhp-KillerOrange 27,576.09 Da（实测 27,575.93 Da）。实测与理论分子质量之间约 1 Da 的偏差在 ESI-MS 仪器的误差范围内。请点击此处查看此图的放大版本。

EGFP、NowGFP 和 KillerOrange 在不同波长下的吸光度和荧光光谱示意图
图6：荧光蛋白变体的光吸收与荧光发射光谱。 图中展示了 EGFP 变体的归一化紫外-可见吸收光谱 (A)、NowGFP 的 (B) 以及 KillerOrange 的 (C)。光谱均归一化至发色团吸收峰最大值（约 500 nm 处）。归一化荧光发射光谱展示了 EGFP 变体的 (D,G)、NowGFP 的 (E,H) 和 KillerOrange 的 (F,I)。图 (D,E,F) 中的光谱采用紫外光（295 nm）激发测得；图 (G,H,I) 中的光谱分别采用 488 nm、493 nm 和 510 nm 的光激发，且光谱均归一化至各自发色团发射峰的最大值（约 500 nm 处）。各图中，黑色曲线代表含天然脯氨酸的荧光蛋白变体的光谱，橙色曲线代表 S-Flp 取代蛋白的光谱，蓝色曲线对应 Dhp 取代蛋白的光谱。请点击此处查看本图的放大版本。

在295nm和488nm激发下EGFP及其变体的荧光光谱图，显示复性过程
图7：EGFP变体在复性实验中的荧光发射光谱。 在天然状态以及变性后复性状态下，0.3 µM荧光蛋白变体溶液的归一化荧光发射光谱：(A,B,C) 中的光谱为使用紫外光（295 nm）激发测得，其中(A)为EGFP，(B)为S-Flp-EGFP，(C)为Dhp-EGFP；(D,E,F) 中的光谱为使用绿光（488 nm）激发测得，其中(D)为EGFP，(E)为S-Flp-EGFP，(F)为Dhp-EGFP。每种蛋白变体的天然状态（黑色曲线）和复性后样品（绿色对应EGFP，橙色对应S-Flp-EGFP，蓝色对应Dhp-EGFP）的发射光谱均归一化至相应天然状态的最大荧光强度。请点击此处查看此图的放大版本。

重折叠动力学图；荧光 vs. 时间；发射 λ=330, 509 nm；激发 λ=295, 488 nm；EGFP 变体分析。
图 8：通过荧光监测 EGFP 变体的蛋白质折叠与发色团成熟过程。（A） 在紫外光激发（295 nm）下，色氨酸荧光区域的荧光发射（发射波长设定为 330 nm）。（B） 在绿光激发（488 nm）下，发色团发射区域荧光强度的发展变化。时间依赖性荧光曲线根据监测时间段末达到的荧光强度归一化至单位值（100%）。每个图中，黑色曲线对应天然脯氨酸 EGFP 变体的光谱，橙色曲线代表 S-Flp 取代蛋白的光谱，蓝色曲线对应 Dhp 取代蛋白的光谱。请点击此处查看该图的放大版本。

构建体氨基酸序列（6xHis 标签已加下划线）：
EGFP-H6MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVP
WPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTR
AEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVN
FKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDH
MVLLEFVTAAGITLGMDELYKHHHHHH
H6-NowGFPMRGSHHQHHHGSVSKGEKLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGK
MSLKFICTTGKLPVPWPTLKTTLTWGMQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGY
VQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGVDFKEDGNILGHKLEYN
AISGNANITADKQKNGIKAYFTIRHDVEDGSVLLADHYQQNTPIGDGPVLLPD
NHYLSTQSKQSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIPLGADELYK
H6-KillerOrangeMRGSHHHHHHGSECGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPH
GDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQWGEPFFARYPDGISHFAQECFPEG
LSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELSDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQ
LVDILPSETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHLDSKMTFNGSR
AIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAHAHSVPRITSAIGSDQD

表1：目标蛋白的一级结构。 每个序列中的His标签均以下划线标出。

λ [nm]ε [M-1·cm-1] (EGFP)ε [M-1·cm-1] (S-Flp-EGFP)ε [M-1·cm-1] (Dhp-EGFP)
488 (≡ CRO)31,657 (± 1,341)22,950 (± 290)27,800 (± 542)
280 (≡ Tyr+Trp)20,116 (± 172)23,800 (± 715)17,300 (± 554)
消光系数 ε（单位为 M-1·cm-1）的数值是根据已知蛋白浓度下测定的相应 EGFP 变体的紫外-可见吸收光谱计算得出。280 nm 处的选定波长对应芳香族残基酪氨酸和色氨酸的最大吸收峰，488 nm 则代表发色团的吸收波长。

表2：EGFP变体在选定波长下的消光系数（ε）。 消光系数ε（单位为M-1·cm-1）的数值是通过已知蛋白浓度的EGFP变体的紫外-可见吸收光谱计算得出。选定的280 nm波长对应芳香族残基酪氨酸和色氨酸的最大吸收峰，而488 nm则代表发色团最大吸收波长。

补充材料：储备液和缓冲液的配制 请点击此处下载该文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在自然界中，对蛋白质结构和功能的操控通常源于突变，即蛋白质序列中特定位置的氨基酸身份发生替换。这种自然机制被广泛用作蛋白质工程中的生物技术手段——定点突变，并依赖于参与该过程的20种标准氨基酸。然而，脯氨酸残基的替换存在困难。由于其特殊的主链基团结构，它几乎无法与其他19种氨基酸相互替换72。例如，由于脯氨酸与最常见的二级结构（即α-螺旋和β-折叠）相容性较差，通常被认为是一种二级结构破坏者。当该残基被标准氨基酸库中的其他氨基酸取代时，这一特性很容易丧失。使用脯氨酸的化学类似物进行替换则提供了一种替代策略，可在保留母体脯氨酸残基本身主链基本特征的同时，对其特定的构象转变施加偏向性，或调节分子体积与极性。例如，可通过向细菌培养物中添加羟基脯氨酸、氟代脯氨酸、烷基化脯氨酸、脱氢脯氨酸等类似物，以及具有不同环大小的结构，从而促进含有特定脯氨酸残基修饰的蛋白质的表达。

本研究中描述的选择性压力掺入（SPI）方法可实现对目标蛋白中所有脯氨酸进行全局性、即残基特异性的替换，代之以相关的化学类似物。该方法的重要性体现在，SPI能够实现常规诱变技术无法达到的序列改变。例如，如本研究所示，该方法可产生仅含微小结构变化的目标蛋白，此类变化通常不超过一至两个原子的替换、删除或添加。这类蛋白修饰被称为“原子突变”73,74。在绿色荧光蛋白（GFP）等荧光蛋白中，此类分子干预的影响可体现在折叠速度、局部极性、蛋白堆积程度以及相关结构特征稳定性的变化上。由于对蛋白折叠及残基微环境的影响，吸收光谱和荧光特性也随之发生间接改变。与将脯氨酸突变为其他标准氨基酸残基相比，SPI所实现的分子改变通常具有更高的精确性，而后者通常会对蛋白的折叠、表达与纯化产生不利影响。

作为一种生产方法，选择性压力掺入（SPI）方法利用了氨酰-tRNA合成酶口袋对天然氨基酸化学类似物的底物耐受性。该合成酶负责准确识别氨基酸结构，而氨基酸向蛋白质中的掺入则发生在翻译过程的下游。在操作上，SPI方法中的蛋白质生产、分离与纯化过程与任何其他重组蛋白表达技术典型操作方式相同，但需对方案进行如下补充：用于替换的目标脯氨酸在发酵过程初期即被提供，以使细胞能够生长并建立完整的细胞机制。然而，细胞培养物不允许达到最大光密度，以保持细胞处于适合蛋白表达的对数生长期。在此基础上，SPI方法主要有两种变体。第一种方法是在初始培养基（化学成分明确的培养基）中调整脯氨酸浓度，使其在无外界干预的情况下自然耗尽。细胞在培养基中的脯氨酸耗尽前仍处于对数生长期，随后加入类似物，并诱导目标蛋白的表达。第二种方法则是将细胞在含脯氨酸的培养基中培养至对数生长期中期，此时需将细胞取出，并物理转移至另一种不含脯氨酸、仅含类似物的新培养基中，随后诱导目标蛋白的表达。在这两种方法中，类似物和目标蛋白的诱导试剂均被加入预先培养好的细胞中。野生型蛋白的分离与纯化操作与变异体蛋白相同。原则上，任何可用的脯氨酸营养缺陷型菌株均可作为表达宿主，但建议通过表达测试来确定最合适的宿主。此外，也可通过测试不同的化学成分明确培养基以优化蛋白产量。

对于选择性压力掺入（SPI）所用的化学类似物，需考虑一些特定要求，例如溶解度和浓度。氨基酸的代谢可利用性和细胞摄取依赖于培养基中溶解分子的数量。为提高特定化合物的溶解度，可选择偏酸性或偏碱性的条件。由于这些人工分子可能因其细胞毒性产生抑制细胞生长的效应，因此应将浓度降至最低，以避免细胞应激75。

SPI 的一个微小缺陷是，随着需要替换的位点数量增加，其掺入效率会降低。原则上，可通过定点突变减少目标生物分子中该氨基酸的出现频率来解决此问题。然而，改变蛋白质的一级结构可能会影响其结构和功能特性。

如前所述，SPI 可实现对标准氨基酸的残基特异性 替换。这意味着非标准氨基酸会被插入到目标蛋白中所有标准氨基酸的位置，包括对蛋白功能或折叠至关重要的保守残基。要解决这一问题，唯一可行的方法是采用位点特异性插入技术3。在过去的几十年中，已发展出一种正交配对方法，可生成在预定位置含有修饰残基的蛋白质。该方法最常见的形式被称为终止密码子抑制。该技术基于一种经过改造的正交翻译系统，专用于将合成氨基酸位点特异性地掺入蛋白质中76。迄今为止，已有超过 200 种具有不同侧链修饰的氨基酸通过该方法被成功插入蛋白质77。然而，这些翻译系统目前仍不适用于将脯氨酸类似物插入目标蛋白。此外，由于在改造后的翻译系统中，氨酰-tRNA 合成酶通常仍存在一定的背景错配现象，因此该方法在进行微小氨基酸修饰时效率较低。

通过 SPI 方法，我们制备了多种 β-桶状荧光蛋白变体，并研究了脯氨酸被其非天然类似物取代后的影响。当脯氨酸被 R-Flp 和 Dfp 取代时，表达宿主产生了无功能的蛋白质，该效应很可能是由蛋白质错误折叠引起的。这种错误折叠可能源于 R-Flp 所促进的 C4-exo 构象，而该构象不被天然蛋白质结构所偏好27。对于 Dfp，错误折叠可能归因于脯氨酸残基处 trans-到-cis 肽键异构化速率降低27。已知该过程是蛋白质折叠动力学中的限速步骤之一，会影响 β-桶结构的形成以及后续发色团的成熟。事实上，对于 R-Flp 和 Dfp 这两种氨基酸，蛋白质表达均导致形成聚集且不溶的蛋白产物，因此无法完成发色团的形成，荧光完全丧失。然而，在使用 S-Flp 和 Dhp 的情况下，观察到正常的蛋白质成熟过程，每种类似物与蛋白质组合均获得了具有荧光的蛋白样品。尽管蛋白质的吸收和荧光特性出现了一些调节性变化，但总体上仍与野生型蛋白相近。氨基酸替换的影响在复性动力学研究中得以显现：当以 S-Flp 取代时，复性速度更快。模型研究表明，该残基可能提升 trans-到-cis 酰胺键旋转速率，并促进 C4-endo 构象的形成。这两个因素均可能有助于该残基在 EGFP 中产生有利的动力学效应。相比之下，Dhp 所产生的折叠动力学曲线与亲本蛋白最为相似。在所研究的荧光蛋白中，仅通过原子层面的微小突变即产生多样化的结果，这凸显了 SPI 制备方法在调控目标蛋白质特性方面的潜力。利用类似物取代脯氨酸所诱导的蛋白质改变，进一步对酶78,79,80 和离子通道81,82 的工程化改造，以及蛋白质稳定性的通用设计具有重要意义。

SPI 方法的基本局限性在于其以“全或无”的模式将脯氨酸残基替换为相应的类似物。若能精确选择哪些脯氨酸残基应被类似物取代，而哪些应保持未修饰状态，则将具有显著优势。然而，目前尚无技术可在微生物表达宿主中实现如此精细的蛋白质生产。蛋白质的化学合成83,84以及无细胞表达系统85,86是两种可实现位点特异性脯氨酸修饰的替代方法。但这些方法操作复杂且产量较低，相较于在活细胞中进行表达仍处于劣势。迄今为止，SPI 仍是生产携带原子级突变的复杂蛋白质最为简便且稳健的方法。通过引入非天然氨基酸替代物，该方法可实现对蛋白质特性的靶向调控，本研究中通过脯氨酸替换所引起的荧光蛋白折叠及光吸收/发射性质的改变即为一例。

披露

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作者声明所有潜在的利益冲突。

致谢

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本工作由德国研究基金会（催化统一系统卓越集群）资助 T.F. 和 N.B.，以及由联邦教育与研究部（BMBF 计划“HSP 2020”，TU-WIMIplus 项目 SynTUBio）资助 F.-J.S. 和 T.M.T.T.。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈VWRHiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642需 LC-MS 级
丙烯酰胺与双丙烯酰胺水溶液储备液（比例 37.5:1，ROTIPHORESE Gel 30）Carl Roth3029.1
琼脂Carl Roth5210
钼酸铵 ((NH4)2MoO4)Sigma-Aldrich277908
过硫酸铵 (APS)Carl Roth9592.2≥98 %，p.a.，需 ACS 级
硫酸铵 ((NH4)2SO4)Sigma-AldrichA4418
氨苄青霉素钠盐Carl RothK029
生物素Sigma-AldrichB4501
溴酚蓝Sigma-AldrichB0126
氯化钙 (CaCl2)Sigma-AldrichC5670
考马斯亮蓝 R 250Carl Roth3862
硫酸铜 (CuSO4)Carl RothCP86.1
D-葡萄糖Carl Roth6780
1,2-双(二甲氨基)乙烷， N,N,N',N'-四甲基乙二胺 (TEMED)Carl Roth2367.3≥99 %，p.a.，用于电泳
1,4-二硫苏糖醇 (DTT)Carl Roth6908
二氯甲烷 (DCM)Sigma-Aldrich270997
磷酸氢二钾 (K2HPO4)Carl RothP749.1
磷酸氢二钠 (Na2HPO4)Carl RothX987
脱氧核糖核酸酶 I (DNase I)Sigma-AldrichD5025
Dowex 50WX8-100（氢型）Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)10731181阳离子交换树脂
乙醇Carl Roth9065.1
甲酸VWRHiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865需 LC-MS 级
冰醋酸Carl Roth3738.5100 %，p. a.
甘油Carl Roth3783
咪唑Carl RothX998
盐酸 (HCl)Merck295426
氯化亚铁 (FeCl2)Sigma-Aldrich380024
异丙醇Carl RothAE73.1
异丙基 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷 (IPTG)Sigma-AldrichI6758
溶菌酶Sigma-AldrichL6876
氯化镁 (MgCl2)Carl RothKK36.1
硫酸镁 (MgSO4)Carl Roth8283.2
氯化锰 (MnCl2)Sigma-Aldrich63535
β-巯基乙醇Carl Roth4227.3
PageRuler 未染色蛋白 MarkerThermo Fisher Scientific26614
氯化钾 (KCl)Carl Roth6781.3
磷酸二氢钾 (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
核糖核酸酶 A (RNase A)Carl Roth7156
氯化钠 (NaCl)Carl RothP029
磷酸二氢钠 (NaH2PO4)Carl RothT879
十二烷基硫酸钠 (NaC12H25SO4)Carl Roth0183
硫胺素Sigma-AldrichT4625
三氟乙酸 (TFA)Sigma-AldrichT6508
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCl)Sigma-Aldrich857645
三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris)Carl Roth5429
胰蛋白胨Carl Roth8952
酵母提取物Carl Roth2363
氯化锌 (ZnCl2)Sigma-Aldrich229997
L-丙氨酸Sigma-AldrichA7627
L-精氨酸Sigma-AldrichA5006
L-天冬酰胺Sigma-AldrichA8381
L-天冬氨酸Sigma-AldrichA0884
L-半胱氨酸Sigma-AldrichC7352
L-谷氨酸Sigma-AldrichG2128
L-谷氨酰胺Sigma-AldrichG3126
L-甘氨酸Sigma-AldrichG7126
L-组氨酸Sigma-AldrichH8000
L-异亮氨酸Sigma-AldrichI2752
L-亮氨酸Sigma-AldrichL8000
L-赖氨酸Sigma-AldrichL5501
L-甲硫氨酸Sigma-AldrichM9625
L-苯丙氨酸Sigma-AldrichP2126
L-脯氨酸Sigma-AldrichP0380
L-丝氨酸Sigma-AldrichS4500
L-苏氨酸Sigma-AldrichT8625
L-色氨酸Sigma-AldrichT0254
L-酪氨酸Sigma-AldrichT3754
L-缬氨酸Sigma-AldrichV0500
(4S)-氟脯氨酸Bachem4033274确保所有脯氨酸类似物不含脯氨酸，检查纯度。否则需增加步骤以在表达过程中消耗脯氨酸污染。
(4R)-氟脯氨酸Bachem4033275确保所有脯氨酸类似物不含脯氨酸，检查纯度。否则需增加步骤以在表达过程中消耗脯氨酸污染
3,4-脱氢脯氨酸Bachem4003545确保所有脯氨酸类似物不含脯氨酸，检查纯度。否则需增加步骤以在表达过程中消耗脯氨酸污染
4,4-二氟脯氨酸EnamineEN400-17448确保所有脯氨酸类似物不含脯氨酸，检查纯度。否则需增加步骤以在表达过程中消耗脯氨酸污染
锥形聚苯乙烯（Falcon）离心管，15 mLFisher Scientific14-959-49B
锥形聚苯乙烯（Falcon）离心管，50 mLFisher Scientific14-432-22
透析膜，截留分子量 (MWCO) 5,000Spectrum Medical IndustriesSpectra/Por MWCO 5000 透析膜，133198
金属离子亲和层析 (IMAC) 柱，1 mL，Ni-NTAGE HealthcareHisTrap HP，1 mL，17-5247-01
鲁尔锁紧注射器，5 mLCarl RothEP96.1
鲁尔锁紧注射器，20 mLCarl RothT550.1
鲁尔锁紧注射器，50 mLCarl RothT552.1
微量离心管，1.5 mLEppendorf30120086
培养皿（聚苯乙烯，无菌）Carl RothTA19
pQE-80L 质粒载体Qiagen已不再提供由 N-末端 pQE 载体套装替代，货号/ID：32915
脯氨酸营养缺陷型 E. coli 菌株 JM83Addgene50348https://www.addgene.org/50348/
脯氨酸营养缺陷型 E. coli 菌株 JM83ATCC35607
圆底聚苯乙烯离心管，14 mLFisher ScientificCorning Falcon，14-959-1B
0.45 µm 聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜注射器滤器Carl RothCCY1.1
用于 LC-ESI-TOF-MS 的高效液相色谱 (HPLC) 柱Sigma-AldrichSupelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC 柱，3 µm 粒径，10 cm x 2.1 mm配锥形 0.1 mL 玻璃内衬、螺口盖和隔垫
高效液相色谱自动进样瓶，1.5 mLSigma-AldrichSupelco 854165
用于 LC-ESI-TOF-MS 的质谱仪AgilentAgilent 6530 Accurate-Mass QTOF
质谱数据分析软件AgilentMassHunter 定性分析软件 v. B.06.00
用于 1.5 mL Eppendorf 管的台式离心机Eppendorf5427 R
用于 50 mL Falcon 管的制冷离心机Eppendorf5810 R
快速蛋白液相色谱 (FPLC) 系统GE HealthcareÄKTA pure 25 L
荧光光谱仪Perkin ElmerLS 55
用于细菌细胞破碎的高压微流化器MicrofluidicsLM 系列，带 “Z” 型腔室
用于细菌培养的旋转摇床Infors HTMinitron
用于液相色谱 (LC) 的蠕动泵GE HealthcareP-1
用于细菌细胞破碎的超声波均质器OmnilabBandelin SONOPULS HD 3200，5650182配 MS72 探头
紫外-可见分光光度计BiochromULTROSPEC 2100
紫外-可见-近红外分光光度计Perkin ElmerLAMBDA 950 UV/Vis/NIR

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