蒙古沙鼠作为伤口愈合的动物模型

摘要

本文介绍了一种用于研究角膜解剖结构、组织学特征及其愈合过程的新型动物模型。该新型动物模型采用蒙古沙鼠，其角膜在多个方面与人角膜具有相似性。

摘要

角膜伤口愈合的研究已开展很长时间，有助于减轻患者痛苦并开发出改善眼健康的治疗方法。传统上，角膜愈合研究多在小鼠和大鼠等啮齿类动物中进行，但这些模型可能无法完全模拟人类疾病。然而，关于其他啮齿类动物（如蒙古沙鼠（Meriones unguiculatus））在角膜研究中的信息仍十分有限。

本文介绍了一种用于建立新型动物模型的技术，以研究光折射性角膜切除术后角膜愈合过程。由于关于M. unguiculatus角膜的文献资料有限，我们还描述了其正常角膜的组织学分析方法。由于蒙古沙鼠与人类在角膜的遗传学、解剖学和生理学方面具有相似性，这些研究技术也可应用于眼病的研究。

引言

角膜伤口愈合的一些最重要方面对于眼前节手术至关重要，包括上皮结构的完整性、角膜基质透明度的维持，以及最终角膜屈光特性的恢复结果¹。

角膜是眼球最外层的透明组织，因此容易受到外伤、感染和烧伤的影响；这些伤口的愈合受损可能损害视觉健康²。

目前，已有多种动物模型可用于研究角膜愈合过程，其中一些模型的适用性优于其他模型，具体取决于所研究的物种和机制类型¹。 关于沙鼠视网膜的既往研究报道较少²。然而，迄今为止，尚无关于这些啮齿类动物角膜瘢痕形成过程的已发表文献。

本文介绍Meriones unguiculatus（蒙古沙鼠）作为角膜伤口愈合的动物模型。文中描述了在进行准分子激光角膜切削术后诱导角膜愈合的操作步骤，这些方法使我们能够研究不同类型的角膜瘢痕形成过程，从活体组织动态阶段的角度理解伤口愈合机制，并最终为未来制定适当的治疗方案提供依据³。光治疗性角膜切削术是一种高度可重复的技术，能够精确控制角膜损伤的深度和直径等参数⁴。此外，该技术无需使用手术器械或化学溶液（如生理盐水、甲醛、酒精等），从而避免了因器械本身或操作者差异而引入额外变量的可能性⁵。

本实验使用了三只年龄为6个月、体型和体重相近（约90 g）的雄性沙鼠。所有操作仅在右眼进行。其中一只沙鼠（称为沙鼠1或对照组）未接受光治疗性角膜切削术，术后摘除眼球以评估所有正常的眼部结构。光治疗性角膜切削术是指将准分子激光产生的紫外线光精确地递送至角膜，最初开发用于屈光手术⁶，目前已在其他啮齿类动物（如小鼠）中应用⁷。其余两只沙鼠接受了光治疗性角膜切削术处理，其中一只在术后24小时摘除眼球（称为沙鼠2），另一只在术后96小时摘除眼球（称为沙鼠3）。

为进行本实验，每种研究条件各随机选取一只沙鼠进行拍摄，但此前该实验每种条件均已使用总共16只沙鼠完成。出于编辑需要，决定每种条件各随机选取一只沙鼠（共三只沙鼠）作为示例。

本研究的主要目的是探索目前最佳的动物模型。然而，需要注意的是，并非所有物种的眼睛特征都与人类眼睛相似⁸。本文描述了用于研究Meriones unguiculatus角膜的方法，以及用于制造角膜损伤的操作步骤，这些方法使我们能够研究角膜的愈合过程。

方案

所有研究程序均经 "实验动物护理与使用机构委员会" 科尔多瓦天主教大学和美国国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》的规定，并获得了相关主管部门的批准 "健康科学学院" 科尔多瓦天主教大学 "塞罗视觉研究所".

1. 沙鼠的抓取与麻醉

注意：所有动物均为无特定病原体（SPF）的雄性蒙古沙鼠，饲养于免疫学与传染病研究及发展中心（CIDIE）设施（阿根廷科尔多瓦）。动物来源于阿根廷布宜诺斯艾利斯的拉普拉塔大学。

1. 将沙鼠群养于聚砜材质的笼子中，垫料使用玉米芯。在笼内提供食物和装在饮水瓶中的过滤自来水。 随意摄取确保室温范围为 18 °C 至 24 °C，并采用 12:12 小时明暗循环。
2. 分别称量每只沙鼠的体重，并进行个体标识以避免混淆。使用永久性记号笔在沙鼠尾根部做标记。用镊子夹住沙鼠耳朵，再用永久性记号笔在其耳部做标记。若具备实验室和大型动物饲养室条件，应为每只啮齿动物分配独立的笼具，并标注相应的标识信息。
3. 用70%乙醇溶液对超净工作台进行消毒。将所有手术器械和一次性用品，包括针头、注射器和支架，放入工作台内的操作区域。同时在工作台内放置一块一次性外科泡沫垫。
4. 使用小型敞口塑料容器盛放啮齿类动物，置于精密天平上以方便测量。
5. 使用三只年龄为6个月、体型和体重相近（约80 g）的雄性蒙古沙鼠进行本实验。每次将一只装有啮齿动物的笼子放入超净工作台中。打开笼子，辨认每只沙鼠，并用天平称重。
   注意：沙鼠无害但较为脆弱。抓取沙鼠时应佩戴一次性手套。
6. 用非惯用手抓住沙鼠的尾巴以固定动物，用惯用手的拇指和食指在耳后固定头部，使动物腹部朝上。用小指固定尾巴。
7. 用带有30 G针头的注射器吸取1 mL的氯胺酮和赛拉嗪。按50-100 mg/kg氯胺酮和2 mg/kg赛拉嗪的剂量，对啮齿动物进行腹腔注射麻醉。⁹ 使用惯用手。效应持续时间约为20-50分钟（可能存在个体差异）。
8. 为确保沙鼠已完全麻醉，须在角膜切开前通过脚趾夹捏、尾部夹捏及角膜反射等方法进行检查。
   ​注意：仅对右眼进行所有操作。

2. 角膜光学相干断层扫描（OCT）

1. 放置无菌手术巾，以保护设备免受分泌物或动物毛发的污染。
2. 确保一名操作者固定动物，另一名操作者进行图像采集。操作者在固定沙鼠时应将手放置在设备上，使沙鼠的眼睛尽可能保持稳定和静止以便观察。将握持沙鼠的手放在颏托上。
3. 启动控制OCT的软件，点击Take Image，然后点击Save Desired Image。对角膜进行多次矢状面和冠状面扫描。在OCT下对眼睛成像，并进行多层面扫描以观察啮齿类动物角膜的前段结构。
   注意：如果获得的图像不够清晰，或眼睛发生轻微移动，需重复操作数次，以获取足够数量的图像。
4. 使用OCT软件对中央区和周边区进行角膜厚度测量。在软件主界面中，点击Take Image，然后点击Save Desired Image按钮。
5. 对正常眼或对照眼进行测量，并在另一只啮齿类动物眼睛接受光治疗性角膜切削术后立即进行测量。

3. 准分子激光治疗性角膜切削术（PTK）

1. 在准分子激光设备上放置无菌手术单，以保护设备免受分泌物或动物毛发污染。
2. 在手术前5分钟，向待治疗的眼睛滴一滴表面麻醉剂盐酸丙帕他卡因（0.5%）。
3. 用非优势手牢固地固定沙鼠，用优势手打开动物的眼睑，以便能够正确采集图像。为了能够准确对焦并获得清晰图像，请确保持握沙鼠的操作者将手部支撑在设备的头部位置，即双手应放置在相当于患者放置颈部的位置。
4. 对右眼进行PTK切削。使用以下参数：切削深度为60 µm至62 µm，光学区直径3 mm，持续时间4秒，共1,867次脉冲。
   注意：仅对沙鼠2和沙鼠3进行PTK处理。在此步骤中，第二位操作者负责准备并启动激光以切削角膜组织。
5. 手术完成后立即拍摄照片并进行OCT分析，以记录和存档治疗眼表面的变化情况。
6. 操作完成后，将啮齿动物放回笼中，监测其生命体征（心率：360次/分钟；直肠温度：37–38.5 °C；呼吸频率：90次/分钟），并让动物从麻醉状态中恢复。

4. 角膜PTK术后大鼠的苏醒

1. 注射布托啡诺（0.1 mg/kg 至 0.05 mg/kg）和阿替美唑（0.1–1 mg/kg） 通过 腹腔注射。
2. 将每只沙鼠放回各自的饲养笼中，并监测其生命体征以确认正常苏醒（正常体温为37-39 °C）。
3. 涂抹红霉素软膏以保持表面清洁并预防感染。每日执行此操作两次。
4. 术后连续两天，皮下注射布托啡诺（每6-12小时一次，0.01-0.05 mL）以镇痛，并使用眼膏。

5. 安乐死方法

1. 尽可能在动物的居住笼内实施安乐死。
2. 将压缩二氧化碳（CO₂）气体通入居住笼中。以每分钟30%-70%笼体体积的填充速率将CO₂加入笼内原有空气中，即可达到符合要求的混合浓度（对于10 L体积的笼子，使用3-7 L/min的流速）。采用颈椎脱位法（作为安乐死的辅助方法）以确保啮齿类动物死亡。
3. 分别在沙鼠2和沙鼠3术后24小时和96小时，将动物从居住笼中取出，进行眼球摘除（包括正常眼球和接受手术的眼球），以观察角膜愈合情况。
4. 将动物置于手术台上，并检查其心跳是否消失，持续约1分钟。

6. 眼科手术

1. 剪除上下眼睑以暴露眼球。使用手术镊和剪刀去除眼睑。由于操作区域狭小而精细，去除眼睑有助于在不损伤眼球的情况下完成摘除。
2. 为摘除眼球，先在外眦处做一切口，并将剪刀向后方推进。再从内眦重复此操作，分离眼球与眼眶的连接。
3. 在眼球后方切断视神经。需注意，此操作过程中后部眶丛常出现轻微出血，可能增加操作难度。
4. 将眼球放入含有无菌生理盐水的微量离心管中，清洗30秒至1分钟，以去除残留血液。
5. 将眼球置于含有10%甲醛的微量离心管中，用于后续解剖病理学分析（如下所述）。同时拍摄多张图像和照片。

7. 解剖病理学分析

1. 将整个眼球置于10%缓冲福尔马林中固定6-24小时。
2. 使用切片机对组织进行切割，确保切下的组织厚度为3 mm。
3. 将组织浸入96%乙醇中30-90分钟，并重复此步骤两次。
4. 将组织置于异丙醇中30-90分钟，并重复此步骤两次。
5. 将组织放入二甲苯或二甲苯替代剂中1-3小时。
6. 将组织浸入液态石蜡中至少1小时。
7. 使用模具固定组织并包埋于液态石蜡中，待其凝固（可置于低温环境中），然后进行切片。
8. 根据制造商说明，准备切片机以进行切片操作。
9. 随后使用苏木精和伊红等染色剂对切片染色。
10. 利用连接在显微镜上的相机拍摄图像。

结果

在本研究中，采用组织学技术对整个角膜结构进行了全面分析，并结合眼前节光学相干断层扫描等辅助检查。眼前节结构的光学相干断层扫描图像分析显示上皮层和基质层正常（图1），中央角膜厚度和周边角膜厚度分别为160 µm和106 µm ± 2 µm。其他文献也表明，其他啮齿类动物的角膜向周边逐渐变薄¹⁰。

PTK术后观察到角膜上皮的清创情况（图2）。同时拍摄了沙鼠眼睛在治疗前后的宏观图像。PTK术后观察到角膜表面不规则，通过滴加一滴荧光素并在紫光照射下显示上皮溃疡（图3）。

关于组织学分析，未经处理的蒙古沙鼠（沙鼠1）的正常角膜显示出与人类相同的层次结构：由4至6层细胞组成的复层前部上皮，占角膜总厚度的28%；鲍曼层；基质层，占角膜总厚度的66%；后弹力膜以及内皮层（图4<...

讨论

角膜伤口愈合的生理过程是组织再生与维持稳态之间的平衡。过度的伤口愈合可能导致纤维化和瘢痕形成，最终可能导致器官功能丧失。随着角膜外科手术技术的迅速发展，理解角膜伤口愈合及其涉及的生理和病理事件的重要性不容低估¹¹。

多项研究指出，长爪沙鼠具有多种感官特征，使其成为视觉研究的理想物种，主要包括昼行性行为¹² 与小鼠或大鼠相比，具有更优越且更敏锐的视觉¹³其视网膜结构更类似于人类¹⁴因此，它们被用作视网膜寄生虫感染研究的动物模型¹⁵，治疗药物，基因递送以及视网膜生理学研究。此外，近期发表的遗传学分析表明，大多数已鉴定的沙鼠基因（81%）在小鼠与人类之间是共有的¹⁶此外，已有研究记录了沙鼠与小鼠及人类之间的遗传相似性，揭示了不同物种间的重要相似之处与差异¹⁷...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉剂	Tododrogas
Eppendorf 管	Tododrogas
准分子激光器	Technolas	2022445
荧光素	Poen
镊子	Ofcor	3339
甲醛	Tododrogas
手套	Tododrogas
Ketamine	Sigma-Aldrich
光学相干断层扫描	Optovue	659007
丙帕卡因	Poen
剪刀	Ofcor	3336
无菌铺巾	Soporte hospitalario
无菌纱布	Soporte hospitalario
注射器和针头	Tododrogas
Xylazine	Sigma-Aldrich