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方法文章

设计并显微注射吗啉代反义寡核苷酸与mRNA至斑马鱼胚胎以阐明特定基因在心脏发育中的功能

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DOI：

10.3791/63324

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2022年8月9日

 ,  ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Qatar University, Doha, Qatar, 2Department of Biological and Environmental Sciences, College of Arts and Science, Qatar University, Doha, Qatar, 3Department of Cell Biology, Neurobiology and Anatomy, Medical College of Wisconsin, 4Department of Pediatrics, Medical College of Wisconsin

本文内容

摘要

本实验方案描述了针对一个代表性心脏基因——心脏和神经嵴衍生物表达基因2（hand2）设计、制备并显微注射翻译阻断型吗啉代寡核苷酸，将其注入新受精的斑马鱼胚胎卵黄中以敲低该基因功能。同时，本方案还展示了通过共注射编码该基因产物的mRNA对这些“吗啉代寡核苷酸处理胚胎”（morphants）进行瞬时挽救的方法。

摘要

基于吗啉代寡核苷酸的基因敲低系统已被用于通过基因表达缺失或降低来鉴定多种基因产物的功能。吗啉代寡核苷酸（MOs）相较于DNA寡核苷酸具有更高的生物稳定性优势，因其不易被酶降解。为达到最佳效果，MOs需注射至1-4细胞期胚胎中。敲低作用的时间效应存在可变性，但通常认为MOs会因稀释而最终失去效应。应严格控制吗啉代寡核苷酸的稀释程度和注射量，以在维持靶向效率的同时尽量减少脱靶效应的发生。建议使用其他互补性工具（如CRISPR/Cas9）针对目标基因构建突变品系，并利用这些品系验证morphant表型。本文将演示如何设计、制备并显微注射翻译阻断型吗啉代寡核苷酸至1-4细胞期斑马鱼胚胎的卵黄中，以敲低hand2基因功能，并通过共注射编码相应cDNA的mRNA对这些“morphants”进行挽救。随后，首先通过验证卵黄中吗啉代寡核苷酸的存在（与酚红共注射）以及表型分析来评估吗啉代寡核苷酸显微注射的有效性。此外，还将讨论用于检测敲低效率的心脏功能分析方法。最后，将阐述如何通过蛋白质印迹（western blotting）评估吗啉代寡核苷酸诱导的基因翻译阻断效应。

引言

利用斑马鱼作为心血管发育和疾病研究的模型具有多种优势，包括基因功能的高度保守性、光学透明性、心血管系统发育迅速，以及与传统体内模型相比更低的成本1。吗啉代寡核苷酸（MOs）是斑马鱼模型中最常用的反义基因敲低工具，常用于确定表型或探究基因功能。James Summerton 博士最初开发吗啉代递送系统，旨在抑制体内mRNA的翻译，以尝试开发治疗人类发育缺陷的疗法2,3。MOs 已被广泛应用于体外和体内模型生物中进行基因敲低，并研究这种敲低对表型的影响。这通常通过观察特定器官（例如心脏）发育过程中的异常变化来实现。在野生型（WT）斑马鱼胚胎中敲低心脏特异性基因会导致正常心跳无法形成，证明这些基因在心脏发育中的不可或缺作用4,5。这些表型可通过共注射相应基因的mRNA得以挽救。一项关于心肌肌钙蛋白T（Tnnt2）的研究表明，表达全长tnnt2 mRNA 可以挽救吗啉代介导的敲低所导致的肌节表型6。另一项研究发现，在cmcl2 吗啉代敲低胚胎中过表达调控型肌球蛋白轻链同源物（cmlc2）mRNA，可恢复A带和Z盘的结构完整性7。

吗啉代寡核苷酸（MOs）常用于通过靶向pre-mRNA剪接或阻断翻译来敲低基因表达。剪接阻断型MO通过结合并抑制剪接体功能，从而阻断pre-mRNA的正常剪接。翻译阻断则发生在MO结合至互补mRNA的5'-非翻译区时，阻碍核糖体的组装。MO是目前应用最广泛的基因特异性基因表达敲低方法 体内 模型；它们也是细胞培养中用于阻断mRNA的最有效试剂。吗啉代寡核苷酸（MO）本身通常由约25个吗啉代亚基组成的短链构成。每个MO亚基包含一个核酸碱基、一个吗啉环和一个非离子型的磷酰二胺键。两种类型MO的作用机制不同，因此需要采用不同的方法来验证其敲低效率。对于翻译阻断型MO，最可靠的效率检测方法是蛋白质印迹（Western blot）分析，因为目标蛋白的翻译起始位点（ATG）被阻断后，目标蛋白不应被表达。MO不会直接降解其靶标mRNA，而是通过结合到特定区域抑制基因表达，直至MO自身被自然降解。而剪接阻断型MO则通过诱导前体mRNA发生剪接改变来发挥作用，其效果可通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）结合凝胶电泳进行检测。

MO 筛选过程必须标准化的三个关键部分包括：（i）MO 剂量曲线必须针对表型识别进行优化。剂量曲线还可显示每种测试 MO 的半数致死剂量（LD50：即注射后导致 50% 胚胎死亡的剂量），以提高优化表型“信号”与脱靶“噪声”之间平衡的能力3。（ii）所采用的表型命名法应有充分记录；精确且易于理解的表型描述至关重要，需基于现有文献和研究者经验提供详尽解释，以便未直接观察胚胎的研究人员之间实现信息共享。（iii）使用明确定义的语言，有助于从 Morpholino 数据库8集中收集数据。

在针对心脏基因的吗啉代（MO）敲低研究中，必须监测动物的心脏活动和血液流动动力学，以确定MO敲低实验对心血管系统功能的影响。此类分析需要以高分辨率实时观察心血管系统。斑马鱼在发育的前一周皮肤透明，可通过显微镜直接观察心脏和血液循环。在评估心脏功能时，最常计算的生理参数包括心率、心输出量，以及缩短分数、面积变化分数和射血分数。通过追踪移动的红细胞（RBCs）可测量血流速度，这些测量数据可用于确定内皮细胞所受的剪切应力水平——这是一种关键的力学生物学因子。此类评估需要使用配备高速相机的倒置显微镜或体视显微镜，记录心跳和血流的延时影像。

本文介绍了如何针对目的基因设计、制备翻译阻断型吗啉代寡核苷酸，并将其显微注射到新受精的斑马鱼胚胎卵黄中，以敲低该基因的功能。同时还将展示通过共注射编码该基因的 mRNA 来挽救这些"吗啉代寡核苷酸处理胚胎（morphants）"的方法。随后，我们将通过表型特征分析以及心脏结构和功能分析，评估吗啉代寡核苷酸显微注射的效果。本方法将以一个广泛研究的心脏发育相关基因 hand2 为例进行演示。

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方案

所有实验均按照 QU 的 IACUC 法规所规定的实验动物福利公认标准进行；实验动物饲养于卡塔尔大学生物医学研究中心（QU-BRC）的斑马鱼养殖设施中。本研究所使用的全部动物均为受精后 3 天内（dpf）的个体。

注意：为确保统计学的严谨性，建议每个实验组使用至少30个胚胎。实验组如下：

对照组：该组包括在不含任何注射物的卵水中培养的胚胎。此处的结果将作为对照基线。

阴性对照组：该组包括在卵水中培养并注射了随机序列吗啉代寡核苷酸（scrambled MOs）的胚胎。

注射组：该组包括仅注射hand2 MO的胚胎，以及同时注射hand2 MO与hand2 mRNA以挽救表型的胚胎。本组结果将证实所观察到的表型是由注射的MO引起的。通过比较各实验组，可精确评估抑制hand2及其功能挽救对心脏功能的影响。

1. hand2 的 Morpholino 设计。

注意：吗啉代寡核苷酸（MO）序列可参考文献9,10,11进行设计。此外，也可通过 Gene-tools 提供的在线服务进行设计。Gene-tools 提供免费且快速的在线设计服务，可通过其网站12访问。只需提供目标基因的相关信息（如序列信息或登录号），即可快速定制设计特定的 MO。以下具体步骤总结了如何针对斑马鱼中的 hand2 基因设计 MO：

  1. 首先，从 NCBI 数据库中检索目标基因的相关信息。以斑马鱼中的 hand2 基因为例13。
  2. 从 NCBI 获取 GenBank mRNA 转录本 ID14。
  3. 从 NCBI 获取 mRNA 序列15。
    注意：斑马鱼 hand2 基因的吗啉代（MO）修饰反义寡核苷酸已有报道并可获得。hand2 MO 序列9,10,11：5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGACAG-3'，本研究中使用的 MO 序列列于 材料表 中。
  4. 从 Gene Tools16 获取阴性对照，可选用错配或随机打乱序列的 MO（与原序列相似但碱基随机改变）进行注射。这有助于验证在特定 MO 注射中所观察到表型的特异性，并最大限度降低观察到的效应源于注射操作本身技术假象的风险。

2. Morpholino 注射液的制备

  1. 储备液制备
    1. 用 ddH2O 溶解吗啉寡核苷酸（MO）储备液；焦碳酸二乙酯（DEPC）可能损伤 MO 并对胚胎产生毒性，因此应使用不含 DEPC 的 ddH2O。订购的 MO 通常以 300 nM 浓度装于小瓶中。
      注：尽管 Gene Tools 建议配制 1 mM 的储备液（约 8 ng/nL），但该浓度可能偏低，尤其当吗啉寡核苷酸需要高剂量使用或与其他 MO 混合时。因此，建议配制多种浓度的 MO 储备液（如 2 或 3 mM）更为理想。
    2. 通过进一步稀释储备液制备 0.2 mM 的工作液（例如，对于 2 mM 储备液，进行 1:10 稀释）。通过加入 Danieaux 溶液（7 µL）、储备吗啉寡核苷酸（1 µL）和酚红（来自 10 倍储备液的 2 µL）配制 10 µL 工作液。酚红使溶液呈深红色，有助于在胚胎中追踪注射物质。
    3. 将 MO 储存在室温（RT）下的密封容器中，以防蒸发。切勿将 MO 置于实验台上的冰上，以免溶液析出沉淀。室温操作最为适宜。
      注：Gene Tools 推荐两种 MO 储存方法：工作液可在 -20 °C 下保存（数月到数年），或在密封管中于室温长期保存。若存于 -20 °C，使用前需将寡核苷酸溶液在 65 °C 加热 10 分钟并涡旋充分溶解（若存于室温则无需预热）。
  2. 体外 转录 mRNA
    注：本研究采用 体外 转录方法，由质粒 HAND2（NM_021973）人源标签 ORF 克隆制备 Hand2 的 mRNA，并微量注射至斑马鱼胚胎中，以挽救因使用吗啉寡核苷酸敲低斑马鱼 hand2 基因而产生的表型。本研究所用质粒的详细信息列于材料表中。
    1. 使用适当的限制性内切酶线性化质粒 DNA，并使用 DNA 纯化试剂盒（材料表）进行纯化。将纯化的线性化 DNA 作为模板，按照制造商说明书进行 体外 转录以制备用于注射的 mRNA（材料表）。
    2. 最终，向目标基因注射 250 pg 的人源 mRNA，以进行表型挽救实验，验证表型缺失是否确实由 MO 介导的斑马鱼基因功能丧失所致。
  3. 准备注射
    1. 使用微毛细管拉制仪（材料表）拉制针头，操作步骤参见 2.3.2–2.3.6。
    2. 使用带细丝的 1 mm 毛细管和微毛细管拉制仪。打开仪器电源并开启盖子。
    3. 将模式选择旋钮调至 NO.2 加热器。使用 NO.2 加热器，调节旋钮使加热温度达到 68 °C。
    4. 将模式选择旋钮调回 步骤 1 位置。使用四个配重（2 个轻型 / 2 个重型）。
    5. 将毛细管置于夹持器上并关闭盖子。按下 开始 按钮以拉制针头。
      注：此操作将产生具有长锥度的毛细管针头。
    6. 用镊子短暂剪切针尖。使用毛细管斜面打磨仪打磨拉制针头的尖端约 30 秒，以便更容易刺入斑马鱼胚胎，最终使针尖直径约为 15–25 µm。
    7. 校准针头以估算注射量，操作步骤参见 2.3.8–2.3.13。
    8. 在将 mRNA/吗啉寡核苷酸溶液装入针头前，短暂混匀，以溶解可能堵塞针头的颗粒。
    9. 使用带微小尖端的移液器吸头，向注射针头后部加入约 3–4 µL 的 MO 溶液。注射针头配有小型凹槽，便于通过毛细作用从后部填充。
    10. 确认注射针头内无气泡。将针头安装至显微注射仪。
    11. 按下注射踏板，检查针尖是否堵塞，并确认 MO 溶液可顺利流出。
    12. 通过测量液滴大小校准注射体积。将针尖置于载物台测微尺上的矿物油中，按下注射踏板，调节注射（喷出）压力（psi）和/或注射时间（ms），直至喷出液滴直径为 0.1 mm，对应体积为 0.5 nL。
    13. 确保注射体积在 0.5–1 nL 范围内。通过调节注射（喷出）压力（psi）或时间（ms）来调整体积。
    14. 如需使用皮升级注射仪，操作步骤参见 2.3.15–2.3.16。
    15. 使用皮升级注射仪进行斑马鱼注射。打开注射仪的供液泵。
    16. 根据以下要求准备注射仪：
      1. P-平衡：确保 P-平衡值接近 0。应略呈负压，以防止卵黄回流至针头，稀释针内 MO 溶液；反之，若背压过高，即使未踩下踏板，MO 也会持续从针头流出，导致注射剂量不一致，影响表型观察结果。
      2. P-注射：20–25 psi 为理想值；可通过调节此参数改变注射体积。该值可在 10–30 psi 范围内调整，但建议初始设为约 20 psi，以确认是否达到所需体积。
      3. 注射时间：应将注射时间缩短至 300 ms。在调节注射体积前，应先调整注射时间。
    17. 进行吗啉寡核苷酸注射时，操作步骤参见 2.3.18–2.3.19。
    18. 按以下步骤准备注射模具：将 0.6 g 琼脂糖溶于 30 mL E3 培养基中，制成 2% 琼脂糖溶液。将琼脂糖倒入培养皿中，并使用 TU-1 注射模具在琼脂糖上压模。放入冰箱冷却后，将形成用于放置和固定胚胎的凹槽（图 1A）。
      注：60 倍 E3M 储备液的配方为：在 1 L ddH2O 中含 5.0 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.16 mM MgSO4·7H2O、0.4 mM CaCl2·2H2O，最终 pH 为 7.6。
    19. 使用移液器将收集的胚胎转移至凹槽中，并清除胚胎周围所有多余的 E3 培养基，以防胚胎漂浮（图 1B）。

3. 将 Morpholino 和 mRNA 溶液注射到卵黄中

  1. 将针插入绒毛膜，注射至卵黄/细胞交界处靠近胚胎的一侧，并按压注射踏板（图 1C）。
    注意：注射的吗啉寡聚体（MO）溶液/酚红不会立即在卵黄中扩散。卵黄中将出现一个红色斑点，随后逐渐消散。注射物的体积不应超过胚胎总体积的10%。吗啉寡聚体可在斑马鱼受精卵产下后至8细胞期阶段注射至卵黄中，因为发育中的细胞可通过卵黄囊的胞质流动高效摄取MO17,18。在质粒或加帽mRNA注射时，应将物质注射至单细胞期胚胎的一个卵裂球中。
  2. 将胚胎转移至含有E3培养基的培养皿中，在28 °C条件下孵育至受精后3天（3 dpf），并每日更换E3培养基。在此阶段，使用显微镜进行表型评估。
    注意：针对每项实验，必须谨慎稀释MO溶液，以确定诱导特定表型所需的最低浓度。还需明确每种MO的胚胎致死率。当浓度过高时（超过4–10 ng，具体取决于MO种类），MO易引发非特异性效应，例如脑部损伤或广泛的细胞死亡。
  3. 为验证由MO介导的斑马鱼hand2基因功能缺失所诱导的表型是否可被挽救，以相同方式共注射MO与250 pg人源hand2 mRNA。

4. 通过蛋白质印迹验证吗啉代寡核苷酸敲降效果

  1. 在特定时间点（48 hpf，72 hpf）收集胚胎，必要时使用蛋白酶Pronase去除卵膜。
  2. 采用已知方法去卵黄以去除卵黄蛋白原19。
    注：卵黄蛋白原是一种磷脂糖蛋白，可为发育中的胚胎提供营养来源。通过去除卵黄并清除卵黄蛋白原，可实现高分辨率的二维凝胶电泳及显著改善的蛋白质印迹（western blotting）效果。
  3. 按照先前所述方法进行蛋白质印迹（western blotting）20。

5. 心脏结构与功能评估：

  1. 斑马鱼活体成像：心室成像
    注意：通过观察斑马鱼胚胎跳动的心脏，可计算多种心脏功能/血流动力学参数21,22。这些参数包括心输出量（CO）、射血分数（EF）、每搏输出量（SV）、缩短分数（FS）和面积变化分数（FAC）（有关斑马鱼胚胎心脏功能评估的详细实验方案，请参见先前发表的论文22,23）。以下步骤简要说明如何计算约3天龄（dpf）斑马鱼胚胎的上述参数，此阶段斑马鱼体表透明，便于使用明场显微镜进行观察。
    1. 在凹面成像载玻片的孔中加入一滴3%甲基纤维素溶液（室温）。
    2. 使用合适的塑料移液器将斑马鱼胚胎置于孔中（图2A、B）
      注意：孔内液体过多可能导致胚胎移位出孔。
    3. 轻轻混合3%甲基纤维素液滴与E3培养基，以稳定已孵出的胚胎。
      注意：配制3%甲基纤维素溶液的方法为：将3 g甲基纤维素粉末溶于100 mL PBS或其他封片介质中，置于烧瓶内。在混合液中放入搅拌子，并将烧瓶置于磁力搅拌器上，调至低速，在4 °C条件下持续搅拌约1天，直至所有团块完全溶解。甲基纤维素完全溶解后，分装至小管中，于-20 °C保存。
    4. 将鱼体左侧朝下放置，右侧朝上，头端朝左，以便对心室进行明确无误的成像（图2C）。
    5. 在显微镜下以100倍放大倍率对准胚胎心脏，并开始录制约5秒的视频。确保心室边界位于成像视野内（图2D）。
    6. 使用高速相机和体视显微镜，以约每秒100帧（fps）的速度记录整个胚胎（图2C）、跳动的心室（图2D）以及主要血管（如背主动脉或后主静脉）中红细胞（RBC）运动的时间序列视频，用于心脏功能分析（图2E）。
    7. 将视频保存为AVI格式或TIFF（或JPEG）图像序列格式。
  2. 计算心率
    1. 计算记录两个连续帧所需的时间。对于100 fps，时间间隔为0.01秒。
    2. 从任意一个记录的心动周期中选择一个已知时间点（例如舒张末期或收缩末期），计算完成一个完整周期所需的帧数。
    3. 将步骤5.2.1中的时间间隔乘以步骤5.2.2中的帧数，所得结果即为一次心跳的持续时间（单位：秒）。
    4. 为计算每分钟心跳次数，用60除以上一步所得数值。对于正常的3 dpf胚胎，该值约为150 bpm（2.5 Hz）。
      注意：许多软件可自动从跳动心脏的录像中计算心率，例如ViewPoint24和DanioVision25。
    5. 使用约100 fps的时间序列录像分析心脏结构，检查整个心脏是否存在心包水肿或其他结构异常。
      注意：图3A显示正常3 dpf胚胎心脏，图3B显示具有心包水肿和心脏环化缺陷（心室延长）的3 dpf心脏。
  3. 计算面积变化分数（FAC）：
    注意：面积变化分数（FAC）是用于比较心室舒张末期与收缩末期面积以评估心室收缩功能的参数。
    1. 使用约100 fps的时间序列录像确定代表一个完整心动周期的帧，并提取显示收缩末期和舒张末期结束时刻的帧。
    2. 使用ImageJ或类似图像分析软件，分别计算舒张末期面积（EDA）和收缩末期面积（ESA）。
    3. 使用以下公式计算FAC22,26,27：
      FAC 使用EDA和ESA变量计算效率百分比的公式，用于效率分析。
  4. 计算缩短分数（FS）：
    注意：缩短分数（FS）是另一种用于评估心室收缩功能的参数；测定FS需测量心室舒张末期和收缩末期的直径21。
    1. 重复步骤5.3.1
    2. 使用ImageJ或任何其他等效图像分析程序，测量心室壁在舒张末期（Dd）和收缩末期（Ds）的直径。大多数情况下采用短轴直径来确定缩短分数（FS）（图4）。
    3. 使用以下公式计算FS22,27：
      FS 孔隙率计算公式，显示(Dd-Ds)/Dd，适用于材料密度研究。
  5. 每搏输出量（SV）的计算：
    注意：每次心跳时，SV是指从心室泵出的血量，可通过心室舒张末期和收缩末期容积轻松计算得出28。
    1. 重复步骤5.3.1和5.3.2
    2. 测量如图4所示的舒张末期（DL）和收缩末期（DS）直径。
      注意：假设斑马鱼心室呈长椭球体形状21,22，则心室容积可通过以下公式计算。
      容积 体积计算公式：V = (1/6)πDLDS²，适用于几何或物理研究。
      SV可按以下公式计算27。2–6 dpf胚胎的正常SV范围为0.15–0.3 nL29。其中EDV为舒张末期容积，ESV为收缩末期容积。
      SV = (EDV - ESV)
  6. 计算射血分数（EF）：
    ​注意：EF定义为每次心跳时从心室射出的血液所占的比例28。
    1. 根据上述公式，提取该鱼的EDV和ESV。
    2. 按以下方式计算EF22,27：
      EF (%) 心脏功能公式，每搏输出量/舒张末期容积方程，用于血流动力学分析。
  7. 计算心输出量（CO）：
    注意：CO是指心脏每分钟泵出的血量28。2–6 dpf胚胎的CO值为10–55 nL/min29。
    1. 如前文第5.5节和5.2节所述，计算SV和HR。
    2. 使用以下公式计算CO22,27：
      CO (nL/min) = SV (nL/beat) × HR (beats/min)。
  8. 测量红细胞（RBC）速度：
    注意：细胞速度的测定对于评估血流速率、血管直径以及计算作用于血管内皮细胞的剪切应力至关重要（即剪切应力是流动血液对内皮细胞施加的摩擦力）。对于2–5 dpf胚胎，红细胞（RBC）的平均速度约为300–750 µm/s29。测量RBC速度的方法如下：
    1. 在显微镜下以100倍放大倍率对准动物尾部，此放大倍率下应可见红细胞的运动（图5A、B）。
    2. 开始录制约8秒的视频。确保背主动脉（DA）和后主静脉（PCV）这两个最重要的轴向血管在成像视野内，且录制速度为100–120 fps。追踪连续帧中的单个细胞（图5A、B）。
    3. 使用ImageJ或其他类似图像分析软件提取若干帧。
    4. 计算单个红细胞移动的距离差（Δx）。
    5. 确定连续帧之间的时间差（Δt）。
    6. 使用以下公式计算红细胞速度22,27：
      红细胞速度（µm/s） 变化率公式，Δx/Δt方程，用于科学研究中的速度计算。
      注意：通过重复追踪单个细胞的连续帧，可获得最大速度和平均速度21。红细胞速度也代表血流速度。此外，也可使用多种市售软件自动测量红细胞速度，如ViewPoint24和DanioVision25（图5C）。此外，ImageJ中也有若干可用插件（如TrackMate30和MTrackJ31），适用于录制速度高于100 fps的视频。
  9. 根据测得的细胞速度计算剪切应力
    在血管中测得的红细胞速度也代表血流速度（图5C）。基于这些测量值，在假设为泊肃叶流动（Poiseuille Flow）的前提下，按下式计算目标血管中的剪切应力τ22,27：
    流体动力学方程 τ=4μVmean/D，流体力学，示意图，黏度、速度、直径。
    其中V为平均血流速度（µm/s），µ为血液黏度（dynes/cm2），D为血管直径（µm）。对于3 dpf胚胎，背主动脉（DA）中的剪切应力约为4 dynes/cm222,26,27。

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结果

图6 中的图表展示了HAND2特异性吗啉环（MO）注射胚胎与对照组乱序MO注射胚胎在24、48和72 hpf时的平均胚胎存活率。1 mM（8 ng/µL）和0.8 mM（6.4 ng/µL）MO注射组胚胎在各观测时间点的存活率均显著低于对照组，且在这些时间点均观察到死亡或畸形现象。结果表明，高浓度的HAND2 MO因脱靶效应和MO本身的毒性导致胚胎存活率显著降低。而0.4 mM（3.2 ng/nL）HAND2 MO注射组胚胎的存活率未出现显著下降；然而，实验组中仍观察到一些类似的表型，例如心脏发育延迟、呈细长管状结构的心脏以及心包水肿，与对照组乱序MO注射胚胎相比存在明显差异（图6）。

HAND2 基因敲低的胚胎表现出明显且特异的表型。在24至72小时后受精（hpf）期间，于光学显微镜下观察形态缺陷胚胎的表型。HAND2 功能缺失导致胚胎心脏发育延迟，并出现呈管状且伴有心包水肿的拉长心脏（图7）。因此，与...

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讨论

吗啉代（Morpholino, MO）技术已广泛应用于斑马鱼、爪蟾、海胆，以及近年来的细胞培养模型系统中。大多数技术在带来优势的同时，也存在一些实验人员应意识到的局限性。MO技术的主要局限之一在于：通过MO介导的基因敲低所观察到的表型效应，并非源于目标基因主要产物的功能缺失，而是由于其他基因（与主要目标基因相关或独立于该基因）受到影响，从而导致所谓的"脱靶"效应 成为"观察到的"形态异常表型的原因。当在斑马鱼中发现morphant（MO处理个体）与同一基因的突变体之间表型相关性较差时，这一问题变得尤为突出32。因此，针对斑马鱼研究领域中MO的使用，已制定出若干建议和指导原则2,3，推荐实验人员遵循这些规范。我们认为，在可能的情况下，采用第二种独立且互补的方法（如CRISPR）来验证morphant或突变体表型是可取的。第二个局限性在于利用MO实现基因在时空上的特异性敲低能力。尽管已有光激活型MO3...

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披露

作者声明不存在财务利益或其他利益冲突。

致谢

本文的发表得到了BARZAN HOLDINGS的慷慨资助。 RR的部分资助来自R61HL154254以及儿科学系和儿童医院的资金支持。  

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙烯酰胺 40%SigmaSigma, 货号 C977M88
琼脂糖Sigma-AldrichSigma-Aldrich 货号 A9539-250G
All Prep DNA/RNA Mini KitQiagenQiagen 货号 80204.
alpha TubulinAbcamAbcam- ab4074兔多克隆抗 alpha Tubulin 抗体 批号 GR3 180877-1 (50 kDa)
过硫酸铵 分子级SigmaSigma, 货号 C991U65
BV10 毛细管切削器Sutter Instruments 产品Sutter Instruments 产品目录号 BV10
化学发光成像 Gene GnomeSYNGENESYNGENE
Cleaver Scientific 转膜仪CVS10D_OmniPAGEMiniCVS10D_OmniPAGEMini
考马斯亮蓝Thermo FisherThermo Fisher 货号 C861C44
电化学发光 (ECL) 试剂盒Abcam BiochemicalsAbcam Biochemicals 货号 ab65623
甘氨酸SigmaSigma, 货号 C988U91
羊抗兔AbcamAbcam-  ab6721羊抗兔 IgG H&L (HRP) 第二代 抗体 批号 GR3179871-1
HAND2Gene tools为 HAND2 (NM_021973) 定制合成5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGAC
AG-3'
Hand2AbcamAbcam- ab10131兔多克隆抗 HAND2 抗体 批号 GR143200-9 (24–26 kDa)
HAND2 (NM_021973) 人源带标签 ORF 克隆OriGene Technologies, IncRC224436L3载体：pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro (PS100092)
IBI DNA/RNA/蛋白质提取试剂盒IBI ScientificIBI Scientific 货号 -r IB47702
成像系统iBrightiBright CL1000 成像系统
异丙醇Sigma-AldrichSigma-Aldrich 货号 278475-2L
Laemmli 样品上样缓冲液 (4x)Sigma-AldrichSigma-Aldrich 货号 70607
巯基乙醇SigmaSigma, 货号 M6250-1L
配备 Gen5 数据分析软件界面的微孔板分光光度计EpochEpoch
显微镜Ziess SteREO Lumar V12 荧光显微镜Ziess SteREO Lumar V12 荧光显微镜
矿物油Fisher ScientificFisher Scientific 货号 0121-1
mMESSAGE mMACHINE T7/T3/SP6 转录试剂盒Thermo FisherThermo Fisher 货号 AM1340用于 mRNA 合成
无核酸酶水New England BiolabsNew England Biolabs 货号 B1500L
PC-100 微量移液器拉制仪NARISHIGE GROUP 产品NARISHIGE GROUP 产品目录号 PC-100
酚红SigmaSigma, 货号 P-0290
皮升级注射器Harvard ApparatusHarvard Apparatus 目录号 PLI-90A
Pierce 双辛可宁酸法 (BCA) 蛋白质定量试剂盒Thermo FisherThermo Fisher 货号 23227
PMSF，作为蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂Thermo FisherThermo Fisher 货号 36978
丽春红 SSigma-AldrichSigma-Aldrich 货号 10165921001
蛋白酶抑制剂混合物Thermo FisherThermo Fisher 货号 88668
蛋白质分子量标准SMOBiOSMOBiO 货号 PM2500
放射免疫沉淀分析 (RIPA) 裂解液Thermo FisherThermo Fisher 货号 89900
Ringer’s 溶液Thermofisher目录号 S25513
SDSSigmaSigma, 货号 436143
标准对照Gene tools货号：PCO-StandardControl-1005'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTAT
A-3'，靶向人 β-珠蛋白内含子突变
stripping 缓冲液Sigma-AldrichSigma-Aldrich 货号 21059
TEMEDIBI scientificIBI scientific 货号 C000A52
Tris 碱Thermo FisherThermo Fisher 货号 BP-152-500
Tweensigma life sciencesigma life science 货号 P2287
Zebra Box Revolution-Danio Track 系统腔室，配备 EthoVision XT 11.5 软件Noldus Information Technology, NLNoldus Information Technology, NL
Zeiss Axiocam ERc 5sZeissStemi 508 Zeiss
Zeiss Stemi 2000-CZeissStemi 2000-C

参考文献

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