本实验方案描述了一种利用培养的大鼠海马神经元和三维结构照明显微镜（3D-SIM）对轴突起始段膜周骨架中的肌动蛋白环及其他组分进行可视化和测量的方法。
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摘要
摘要
轴突起始段（AIS）是动作电位的起始部位，同时作为运输过滤器和扩散屏障，通过分选胞体-树突货物来维持神经元的极性。由周期性排列的肌动蛋白环组成的膜周期性骨架（MPS）为多种AIS蛋白（包括结构蛋白和不同离子通道）的锚定提供了支架。尽管近期的蛋白质组学方法已鉴定出大量新的AIS组分，但关于MPS的结构细节及其各个组分功能的信息仍然缺乏。MPS中相邻肌动蛋白环之间的距离（约190 nm）要求必须采用超分辨率显微镜技术才能解析其结构细节。本实验方案描述了一种利用培养的大鼠海马神经元，结合三维结构照明显微镜（3D-SIM）技术，精确检测AIS蛋白在MPS中相对于膜下肌动蛋白环定位的方法。此外，还介绍了一种分析方法，用于定量评估各组分的周期性及其相对于肌动蛋白环的位置。
引言
轴突起始段（AIS）是脊椎动物神经元近端轴突上一个短小但高度特化的区域1。AIS包含一种运输筛选装置和扩散屏障，在维持神经元极性方面发挥关键作用，能够对胞体-树突来源的物质进行分选2,3,4,5,6,7。此外，AIS独特的结构使其能够富集电压门控离子通道簇，从而发挥动作电位起始部位的功能8。AIS的特殊功能依赖于一个高度稳定的结构复合体。过去十年的研究发现，AIS中存在一种由肌动蛋白环与血影蛋白连接构成的膜周期性骨架（MPS），为多种AIS蛋白的锚定提供了支架结构9,10。
MPS中肌动蛋白环之间的距离（约190 nm）9,10低于传统光学显微镜的分辨率极限。早期尝试使用电子显微镜观察MPS并未成功，因为其所涉及的严苛样品制备过程无法有效保存MPS的结构。因此，超分辨率显微技术在揭示MPS部分结构细节方面发挥了重要作用11。然而，目前对轴突初始段（AIS）结构复合体的理解，包括其组成成分的身份与功能，以及其时空调控机制，仍不完善。近期的蛋白质组学研究已成功鉴定出大量定位于AIS、且靠近AIS结构组分的蛋白质12,13。但这些蛋白质的具体功能及其在AIS复合体中的精确定位仍不清楚。因此，超分辨率显微技术成为研究这些蛋白质相对于其他MPS组分的精确位置并探究其功能的关键工具。多种光学显微技术能够实现高于光衍射极限的分辨率，其中一些甚至可实现单分子定位。然而，这些技术大多需要特殊的荧光染料或成像缓冲液，且图像采集通常耗时较长14。
三维结构照明显微镜（3D-SIM）由于使用简便且对样品制备要求简单，成像和样品制备过程中无需特殊试剂，可与多种荧光染料和样品良好兼容，易于实现多色成像，并具备活细胞成像能力15。尽管SIM所能达到的最佳分辨率（约120 nm）相较于许多其他超分辨率技术较低，但对于许多应用而言已足够（例如，用于分辨神经元中MPS内的组分）。因此，关键在于根据具体应用需求判断SIM是否为合适选择，或是否需要更高分辨率的技术。本文描述了一种利用培养的海马神经元和三维结构照明显微镜（3D-SIM）来检测MPS中肌动蛋白环相对于轴突起始段（AIS）候选蛋白的位置与组织方式的实验方案，该方法已在Abouelezz et al.16中实施。
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方案
本实验所用的原代海马神经元根据赫尔辛基大学及芬兰法律的伦理准则，从妊娠17天的Wistar大鼠胚胎（不分性别）中分离获得16。
1. 样品制备
- 在高保真玻璃盖玻片上，将大鼠海马神经元置于稀疏培养条件下（约5,000–10,000个细胞/cm2）培养14天（体外培养14天）。
注：使用稀疏培养可降低神经突相互重叠的概率，有助于对MPS进行定量分析。 - 使用4%多聚甲醛在室温下固定神经元12分钟。用含0.2% BSA的PBS（BSA-PBS）洗涤盖玻片一次，然后在室温下用含1% Triton-X的PBS溶液孵育10分钟。再用BSA-PBS洗涤一次。
- 将抗ankyrin G抗体按1:200比例溶于BSA-PBS中。将抗体溶液加入盖玻片，于4 °C孵育过夜。可选：在抗体溶液中加入鸡源抗MAP2抗体（见材料表），以标记胞体-树突区域。
- 先用BSA-PBS洗涤细胞一次，再用含0.1% Triton-X的PBS洗涤一次，最后再用BSA-PBS洗涤一次。
- 将荧光标记的抗小鼠二抗（1:200稀释）（见材料表）溶于BSA-PBS中，加入盖玻片，室温孵育1小时。依次用BSA-PBS、含0.1% Triton-X的PBS和PBS各洗涤一次。
- 配制1 µM的标记型鬼笔环肽PBS溶液（见材料表），加入细胞中，室温孵育2小时。依次用PBS、含0.1% Triton-X的PBS和PBS各洗涤一次。
注：此处使用了AlexaFluor488标记的鬼笔环肽，但其他标记物同样适用。 - 将盖玻片封片至载玻片时，先在载玻片上滴加一滴封片介质，将盖玻片浸入去离子水中，再用柔软的纸巾轻轻吸去多余水分。
- 将盖玻片放置于载玻片上，室温孵育24小时。
注：使用固化型封片介质（固化后折射率为1.47）未观察到对样品产生不良影响。
- 将盖玻片放置于载玻片上，室温孵育24小时。
2. 成像
- 如果可能，在成像前请咨询显微成像平台的技术人员。使用浸油计算器（参见材料表）选择适用于样本的浸油。
- 样本准备好后，确保盖玻片清洁，无任何残留物或过量封片剂。如有必要，可用蘸有水或乙醇的棉签进行清洁。将样本置于具备三维结构光照明显微镜（3D SIM）功能的显微镜（参见材料表）中，并找到待成像的细胞。
- 调节相应激光线的功率和曝光时间，在不显著漂白样本的前提下最大化信噪比。
注意：良好的信噪比应呈现出清晰的网格状结构，且聚焦于样本，从而获得准确的高分辨率重建图像。本实验中使用488 nm和640 nm激光线分别观察F-肌动蛋白（F-actin）和锚蛋白G（ankyrin G）。 - 设定样本在z轴方向的上下边界，随后采集图像堆栈。
注意：本实验中采用的z轴步长为125 nm。 - 为实现成功的SIM重建，请确保显微镜软件（参见材料表）具备适用于所用染料的光学传递函数文件（OTF）。
注意：此类文件通常由专业人员创建和维护。若缺乏有效的OTF文件，也可使用开源工具基于估计值进行重建17。本研究中使用的均为由专业人员维护的最新OTF文件。 - 对图像堆栈运行重建算法，获得超分辨率重建图像。检查重建结果中是否存在已知伪影，必要时调整参数以校正。
注意：默认的算法参数通常可提供准确结果。常见的伪影包括某些重复性图案：某一z平面内沿多个方向出现的条纹、"重影"现象（特征在不同z平面重复出现），或局部区域出现的六边形"蜂窝状"图案。这些伪影通常可通过优化样本制备、提高信噪比、调整重建算法参数，或确保所选浸油的折射率与封片介质及样本匹配来消除。有关SIM伪影的详细讨论以及可用于检测伪影的免费工具，请参见Ball等人的研究.18 - 将SIM重建图像与宽场图像进行比较，以观察分辨率的提升效果。
- 进行多色SIM成像时，当获得满意的重建结果后，使用对齐算法对不同通道进行正确对齐。
注意：对齐算法使用的是根据显微镜制造商说明，通过微球珠样本制备生成的对齐参考文件。
3. 图像分析
- 神经元膜下周期性骨架结构（MPS）中的肌动蛋白环具有独特的周期性排列。使用图像分析软件（参见材料表），对所有可见肌动蛋白环的焦平面图像生成最大强度投影图像。
- 在最大强度投影图像上，沿相邻可见环之间画一条垂直线，并利用软件的“线轮廓分析”（Plot Profile）功能记录沿线的荧光强度。
- 为计算平均峰间距离，需在该线轮廓图中识别局部荧光强度峰值，并测量相邻峰值之间的距离。
注：此计算可便捷完成，例如使用 MATLAB 中的 'findpeaks' 函数或开源 GNU Octave 平台实现。 - 为评估不同蛋白质与 MPS 中肌动蛋白环的共定位情况，应对肌动蛋白与候选蛋白的结构光照明显微镜（SIM）重建图像进行共定位分析19,20,21。在软件平台中，使用 EzColocalization 插件手动选择轴突起始段（AIS）作为感兴趣区域19，运行分析以计算共定位的皮尔逊相关系数（PCC）19,20,21。PCC 值接近 1 表示共定位程度强。
注：本实验方案的流程总结于图 1中。
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结果
利用培养的大鼠海马神经元和三维结构光照明显微镜（3D-SIM），本文描述了一种用于可视化和测量轴突起始段（AIS）中肌动蛋白环及膜下周期性骨架（MPS）其他组分的实验方案。图像堆栈的重建结果显示肌动蛋白环具有明显的周期性（图2A）。在我们的实验中，使用Alexa 488标记的鬼笔环肽可视化MPS中的肌动蛋白环，其平均峰间距离为190.36 ± 1.7 nm（均值±标准误）。该数值与先前报道的MPS中肌动蛋白环之间约190 nm的平均距离一致。类似地，使用抗ankyrin G抗体对ankyrin G进行可视化（图2B）。通过共定位分析方法计算共定位的皮尔逊相关系数（PCC），以检测AIS中ankyrin G与F-actin的共定位情况19,20,21。ankyrin G与F-actin荧光信号的共定位PCC值为0.36 ± 0.03（均...
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讨论
本文所述方案提供了一种利用超分辨率成像技术对MPS蛋白进行可视化和测量的方法。由于肌动蛋白环及其他MPS组分具有约190 nm的周期性结构9,10，传统的衍射极限成像方法无法揭示MPS的精细结构。目前已有多种显微镜配置可实现超分辨率下的衍射极限结构解析，其中SIM（结构光照明显微镜）是一种稳健且操作简便的选择。重要的是，SIM与最常用的荧光染料兼容，具有很高的灵活性。此外，SIM在可视化MPS中可能较弱的结构方面也十分有效，例如用latrunculin处理的神经元中的肌动蛋白环22，以及活神经元中的结构15。
该实验方案成功的关键在于首先保持微生理系统（MPS）的完整性。成功的SIM成像最关键的步骤发生在样品制备过程中。例如，适度固定（室温下使用4%多聚甲醛固定12分钟）和强效透化（使用1% Triton-X处理10分钟）可获得最佳结果。必须注意的是，某些特定制备步骤可能...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Pirta Hotulainen博士对本文手稿撰写提供的宝贵意见和关键性评论。感谢Rimante Minkeviciene博士在制备本研究原始实验所用神经元培养物过程中提供的帮助。所有成像实验均在Biomedicum影像中心完成。本研究工作得到芬兰科学院（D.M.，项目编号SA 266351）和博士生项目Brain & Mind（A.A.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔板 | Corning | 3524 | |
| 4% 多聚甲醛 | |||
| Alexa-488 鬼笔环肽 | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 抗小鼠抗体 | ThermoFisher | A31571 | |
| 抗Ankyrin G抗体 | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, 克隆 106/36 | 75-146 | |
| 抗MAP2抗体 | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji软件包 | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| 高性能盖玻片 | Marienfeld | 117530 | |
| 浸油计算器 | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-谷氨酰胺 | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal培养基 | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold封片剂 | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx去卷积软件 | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost载玻片 | Epredia | ISO 8037/1 | |
| 0.1 µm TetraSpeck微球 | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
参考文献
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