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快速将重建的细胞骨架封装到巨大单层囊泡内

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DOI：

10.3791/63332

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2021年11月10日

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1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 2John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 3Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 6Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

通讯作者： Allen P. Liu <allenliu@umich.edu>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种快速制备包封细胞骨架蛋白的巨型单层囊泡的简单方法。该方法适用于在受限环境中从头重建细胞骨架结构以及研究细胞骨架与膜之间的相互作用。

摘要

巨型单层囊泡（GUVs）常被用作生物膜的模型，因此是研究膜相关细胞过程的重要工具 体外近年来，将物质包裹于大单层囊泡（GUVs）内已被证明是细胞生物学及相关领域中进行重建实验的一种有效方法。相较于传统的生化重建方法，该技术能更好地模拟活细胞内的受限环境。然而，将物质包裹进GUVs的技术往往难以实施，且不同实验室之间的成功率可能存在显著差异。一种被称为连续液滴界面交叉包裹法（continuous droplet interface crossing encapsulation, cDICE）的技术已被证实可用于成功包裹较复杂的蛋白质系统。本文介绍了一种基于cDICE的方法，可快速高效地将细胞骨架蛋白包裹进GUVs中。该方法首先通过将目标蛋白质溶液在脂质/油混合物中乳化，生成具有脂单层的液滴；随后将这些脂单层液滴加入一个旋转的3D打印腔室中，使其在腔室内穿过水/油界面处的第二层脂单层，从而形成包含该蛋白质系统的GUVs。该方法简化了GUVs内包裹的整体操作流程，显著加快了实验进程，使我们能够限制并观察脂双层囊泡内网络组装的动态演化过程。该平台便于研究受限条件下细胞骨架与膜相互作用的力学机制。 关键词：大单层囊泡（GUVs），连续液滴界面交叉包裹法（cDICE），细胞骨架蛋白，脂双层，网络组装，受限环境，膜相互作用

引言

脂质双分子层隔室被用作研究封闭有机反应和基于膜的过程的模型合成细胞，或作为药物递送应用中的载体模块1,2利用纯化组分自下而上研究生物学需要建立简化的实验系统，以探究生物大分子（如蛋白质与脂质）之间的性质及其相互作用3,4然而，随着该领域的进步，人们越来越需要更复杂的实验系统，以更好地模拟生物细胞内的条件。将物质包裹在GUVs中是一种切实可行的方法，可通过提供可变形且具有选择性通透性的脂双层以及受限的反应空间，赋予系统某些类似细胞的特性。特别是 体外 合成细胞模型中细胞骨架系统的重建可得益于在膜隔室中的封装5许多细胞骨架蛋白可结合并相互作用于细胞膜。由于大多数细胞骨架组装形成的结构贯穿整个细胞，其形态自然受到细胞尺度限域的决定。6.

生成GUV的方法有多种，例如溶胀法7,8、小囊泡融合法9,10、乳液转移法11,12、脉冲喷射法13以及其他微流控方法14,15。尽管这些方法仍在使用，但每种方法都有其局限性。因此，亟需一种高效且简便、能实现高产率GUV包封的技术。虽然自发溶胀和电致溶胀等技术已被广泛用于GUV的制备，但这些方法主要适用于特定的脂质组成16、低盐浓度缓冲液17、较小分子尺寸的被包封物18，并且需要大量被包封物质。将多个小囊泡融合成一个GUV在能量上本质上是不利的，因此需要特定的带电脂质组成9和/或外部促融合剂（如肽类19 或其他化学物质）。而乳液转移法和微流控方法则可能分别需要通过表面活性剂稳定液滴，并在双层膜形成后去除溶剂18,20。脉冲喷射等微流控技术的实验装置和设备较为复杂，带来了额外挑战21。cDICE是一种基于乳液的方法，其原理与乳液转移法相似22,23。在旋转的圆柱形腔室（cDICE腔室）中，离心力使水相溶液（外相溶液）与脂质-油混合物分层，形成脂质饱和界面。将单层脂质包覆的水相液滴送入旋转的cDICE腔室时，当液滴穿过脂质饱和界面进入外部水相溶液，便会“拉链式”地形成双层膜22,24。cDICE方法是一种可靠的GUV包封技术。通过本文所述的改进方法，不仅实现了cDICE典型的高囊泡产率和显著缩短的包封时间（数秒），而且大幅减少了GUV生成所需时间，使得时间依赖性过程（例如肌动蛋白细胞骨架网络的形成）的观察成为可能。从开始到GUV收集与成像，整个实验流程约需15–20分钟。本文以改进的cDICE方法描述了肌动蛋白及其结合蛋白（ABPs）的GUV包封过程。然而，该技术同样适用于包封多种生物反应和膜相互作用，范围涵盖生物大分子组装、无细胞蛋白表达，以及基于膜融合的货物转运等。

方案

1. 油脂混合物的制备

注意：该步骤必须在通风橱中进行，并遵守所有关于氯仿操作的安全指南。

  1. 取0.5 mL氯仿于15 mL玻璃小瓶中。加入88 µL浓度为25 mg/mL的二油酰基磷脂酰胆碱（DOPC）、9.3 µL浓度为50 mg/mL的胆固醇，以及5 µL浓度为1 mg/mL的二油酰基磷脂酰乙醇胺-丽丝胺罗丹明B（rhodamine PE）（见材料表）至该15 mL玻璃小瓶中。
    注意：DOPC和胆固醇在硅油/矿物油中的最终摩尔分数分别为69.9%和30%。已有研究表明，20–30 mol%的胆固醇浓度是使用本方法制备的大单层脂质体（GUVs）在膜流动性与稳定性方面的优化浓度25,26。从生理学角度看，这些数值处于哺乳动物细胞质膜中胆固醇浓度的正常范围内6。脂质储备液通常以氯仿溶液形式购得，并在-20 °C下保存。使用前应将脂质储备小瓶恢复至室温。
  2. 在另一个15 mL小瓶中，用移液器加入7.2 mL硅油和1.8 mL矿物油（见材料表）。通常，此步骤需在低湿度手套箱中进行，尤其是当矿物油被重复使用时。
  3. 将油相混合物在最大转速（3200 rpm）下涡旋振荡10秒，然后将其加入含有脂质-氯仿混合物的小瓶中，并立即置于涡旋振荡器上，在最大转速（3200 rpm）下继续振荡10–15秒。所得的脂质-油混合物应略显浑浊，因为脂质并未完全溶解于油中，而是以微小聚集体的形式分散存在24。
  4. 将脂质-油分散液置于超声功率为80 W、工作频率为40 kHz的水浴超声仪中（见材料表），在室温下超声处理30分钟。配制后的混合物应立即使用，或在4 °C下保存，最长不超过24小时。

2. 囊泡制备

  1. 安装3D打印的轴（补充文件 1）由黑色树脂制成（参见 材料表在台式搅拌器上设置转速为1200 rpm。
  2. 安装3D打印的cDICE室（补充文件 2）由透明树脂制成（参见 材料表) 在轴上（图1A，B).
  3. 分别配制肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白（ABP）溶液，每种溶液总体积为 20 µL。
    1. 在球状肌动蛋白缓冲液（G缓冲液）中配制1-10 µM的肌动蛋白，其中包含10% ATTO 488标记的肌动蛋白（参见 材料表).
      注意：1× G 缓冲液包含 5 mM Tris-HCl（pH 8.0）和 0.2 mM CaCl₂2.
    2. 在冰上加入丝状肌动蛋白聚合缓冲液（F-buffer）以启动肌动蛋白聚合。在加入交联剂之前，将溶液保持在冰上以减缓肌动蛋白聚合速度。
      注意：1x F缓冲液含有50 mM KCl、2 mM MgCl₂。2，以及 10 中的 3 mM ATP mM Tris，pH 7.5
    3. 等待15分钟，使肌动蛋白在冰上开始聚合，然后按所需摩尔比加入目标交联剂。在封装前始终保持溶液处于冰上。
    4. 在微量离心管中分别制备肌动蛋白结合蛋白（ABPs）图1C).
      注意：此步骤在多种亲和探针（如肌球蛋白、α-辅肌动蛋白、束蛋白、Arp2/3复合物）与肌动蛋白共同包封时进行25,26,27在此类情况下，从各ABP的储备液中吸取所需量，并加入指定用于ABP的微量离心管中。由于总体积为20 µL，ABP的储备液分装量必须控制在总体ABP混合液体积不超过5–6 µL。本代表性结果中仅使用了fascin这一种ABP，其制备方法如下所述。
      1. 从1.75 mg/mL的fascin储备液中分装1.57 µL（参见 材料表），并直接加入第2.7步的肌动蛋白溶液中。这相当于溶液中含2.5 µM的fascin。
  4. 加入7.5%的密度梯度介质（参见 材料表在肌动蛋白溶液中加入以形成外相与内相水相之间的密度梯度，从而促进GUV沉降。
  5. 将700 µL浓度为200 mM的葡萄糖外液加入到腔室中（图1D，左侧。
    注意：内液的渗透压决定葡萄糖的浓度。在这些实验中，内液的渗透压约为 200 mOsm，因此外液使用 200 mM 葡萄糖溶液。
  6. 加入足量的脂质-油混合物（>3 mL，根据小室大小）加入小室内，直至填充至小室体积的60%–80%图1D，右侧）。在脂质-油混合物与外部溶液之间将形成一个界面。
  7. 将ABPs（在步骤2.3.4中制备）加入肌动蛋白溶液中。使用常规的100-1000 µL移液器，立即将700 µL脂质-油混合物转移至肌动蛋白-ABP混合物中图1E，左侧）。上下吹打8次，形成直径在7-100 µm范围内的细胞大小的单层脂质液滴（图1E，中段）。
    注意：步骤 2.7 需在数秒内完成，以避免封装前发生任何肌动蛋白网络组装。因此，在执行该步骤前，应确保移液器吸头已插入移液器中，并可随时用于转移混合物。
  8. 使用同一支100–1000 µL移液器，立即将全部乳状液注入旋转腔室中。液滴在穿过油-外相溶液界面的脂质单层时，会获得第二层脂质，从而形成GUVs（大单层囊泡）。图1E，右侧。
  9. 将小室从搅拌板上取下，倾斜小室使其朝向废液容器，通过小室中心的大开口倒出大部分脂质-油混合物并弃去。
    注意：通过此方法可将脂质-油混合物从室中抽出，避免在下一步中脂质-油混合物与外部溶液混合。
  10. 将样品室的盖子朝向使用者方向握住。打开样品室盖子，并将样品室略微向使用者方向倾斜。从样品室开口处（即盖子所在位置）可观察到含有GUVs的外层溶液与脂质-油混合物之间的界面。
  11. 使用移液器收集含有GUVs的外部溶液，并将50–300 µL该外部溶液加入96孔板中，以获得适宜密度的GUVs。
    注意：按照本方案，总共可获得约 2 x 105 GUVs 在腔室内的外层溶液中释放。未对 GUVs 的分散性进行量化；然而，约 90% 的 GUVs 直径在 12–30 µm 范围内。在群体中可观察到直径范围为 7–50 µm 的 GUVs。根据包封的密度梯度介质、GUVs 的大小以及孔板中溶液的深度，GUVs 沉降至表面所需时间为 2–15 分钟。含有重组肌动蛋白束的 GUVs 产率约为 90%。

3. 成像与三维图像重建

  1. 将96孔板放置在倒置显微镜的载物台上，显微镜需配备转盘式（或激光扫描）共聚焦单元、EMCCD或sCMOS相机，以及60倍油浸物镜（参见 材料表).
  2. 聚焦任意感兴趣区域（ROI），并对该区域以0.5 µm的步进间隔采集z轴层扫图像序列。
    注意：由于 GUV 在表面可能会随时间发生轻微位移，因此在对多个荧光染料进行成像时，建议在每个 z 平面同步采集多波长图像组，即在每个 z 平面同时获取 561 nm 和 488 nm 的图像，以分别捕获 ATTO 488 标记的肌动蛋白和 Rhod PE 的信号。
  3. 将每个z轴堆栈图像序列保存为.tiff格式。
  4. 在图像处理软件（ImageJ/Fiji）中打开感兴趣的图像序列。确定信号强度最高的图像。保持 "ctrl+shift+c" 调节亮度 & 对比度窗口并单击 重置.
  5. 从 ImageJ/Fiji 菜单中，前往 分析 > 设定比例尺 输入每个图像像素对应的实际物理距离及其单位。
  6. 在 ImageJ/Fiji 菜单中，前往 图像 > 堆叠 > 3D 项目 从z轴堆栈重建三维图像。设置 "投射法" 作为 亮度点, "切片间距（µm）" 作为 0.5，和对勾 插值其余设置可使用默认选项。
    注意：某些显微镜的z轴步进可能未经过校准，实际的z轴移动距离可能与输入的z轴间隔（例如0.5 µm）略有差异。在此情况下，可使用三维校准样品（如已知直径的荧光微球）来测定实际的z轴间隔。该值将被用作 "切片间距（µm）" 用于三维投影。

结果

为了验证本方案成功生成细胞骨架型大单层囊泡（GUVs），在GUVs中重构了fascin-肌动蛋白束结构。Fascin 是一种肌动蛋白丝的短交联蛋白，可形成刚性且平行排列的肌动蛋白束，通常以谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合蛋白的形式从 E. coli 中纯化获得26。首先在肌动蛋白聚合缓冲液中重构5 µM 肌动蛋白，其中包含0.53 µM 的ATTO488标记肌动蛋白以及7.5%的密度梯度介质。随后加入2.5 µM的fascin并封装fascin-肌动蛋白混合物，在GUVs中形成了肌动蛋白束结构。封装1小时后，采集了罗丹明PE标记的GUVs中所封装肌动蛋白束结构的Z轴层扫共聚焦图像序列（图2A）。此前已利用该方案证实，在封装的肌动蛋白交联蛋白α-actinin与fascin之间存在内在的竞争与分选行为，二者共同作用，可在GUVs中以依赖于囊泡尺寸的方式形成不同的肌动蛋白束模式26。

与本文介绍的改良型倒置乳化法类似，传统的cDICE方法也能高效地生成含细胞骨架的GUVs，但需要使用注射泵和管路装置，以在纳升级每秒的低流速下将蛋白溶液精确注入旋转腔室22,28。在该方法中，乳液直接在旋转的cDICE腔室内生成；将一根细毛细管插入油相中，通过注射泵将蛋白溶液注入。液滴在毛细管尖端形成并被剪切脱离，随后向外部水相迁移，并转化为GUVs，其过程与上述方法类似。图2B展示了采用此方法包裹反应混合物的囊泡。该反应混合物包含6 µM的肌动蛋白，由0.9 µM的fascin交联成束。此处并未对这两种方法及其结果进行比较，但需注意，二者均可实现GUVs的高产率生成。

带有PDMS腔室、搅拌装置和脂质单层过程示意图的静态平衡装置。
图1：生成GUVs的实验装置。（A）cDICE腔室的俯视图和侧剖面图。（B）旋转腔室装置的照片。（C-E）生成GUVs的逐步操作示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

脂质-肌动蛋白结构的荧光显微镜观察；二维与三维细胞模型的比较
图 2：肌动蛋白束结构的包封。（A）图像显示了GUVs的代表性荧光共聚焦切片（左）以及肌动蛋白和脂质通道共聚焦z-stack的最大投影（右）。Fascin，2.5 µM；肌动蛋白，5 µM（包含10% ATTO 488标记的肌动蛋白）。比例尺 = 10 µm。（B）使用传统cDICE技术包封肌动蛋白束结构。图像显示了在fascin存在下形成的包封肌动蛋白束的代表性共聚焦荧光图像最大投影。Fascin，0.9 µM；肌动蛋白，6 µM。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

补充文件1：3D打印轴设计。 请点击此处下载该文件。

补充文件 2：3D 打印 cDICE 腔室的设计文件。 请点击此处下载该文件。

讨论

为了构建合成细胞，研究人员已探索了多种生成GUV的方法 然而，现有方法仍存在诸多挑战，包括操作步骤复杂、实现包封所需时间较长、对脂质类型及被包封物质的分子组成有限制、需要使用非生理性的化学试剂以促进包封、GUV产率低以及包封效率不稳定等问题。考虑到自下而上的合成生物学领域中可开展的研究范围广泛，若能建立一种无缝、高通量的GUV包封技术，可兼容不同脂质组成，并能包封任意大小的分子，则有望推动对复杂仿生合成系统的研究。cDICE方法已克服了以往GUV生成技术中存在的大多数挑战与局限性。

采用cDICE方法制备GUVs的技术路径及其基本原理早于该平台的出现，并已在早期技术（如倒置乳液转移法12）中得以应用。然而，倒置乳液转移法存在产率低和囊泡异质性等局限性。在本文所介绍的cDICE方法中，脂质以数十纳米大小的聚集体形式分散于油相中（脂质聚集体的尺寸取决于脂质的总体浓度）24。脂质分散于两种互溶的油中，其中一种（矿物油）可溶解脂质，另一种（硅油）则不与脂质互溶。通过溶剂转移的方式形成脂质聚集体共聚物29。这种特定的分散方法有助于水相液滴迅速形成单层饱和，并在水相液滴持续穿过脂质饱和的油-水界面时，加快界面处脂质的更新速率 。这进一步促进了双层膜的“拉链式”闭合以形成GUVs，并提高了GUVs的生成通量。旋转腔室产生的离心力有利于多分散液滴高效地穿过脂质饱和界面。原始版本的cDICE方法采用微毛细管喷嘴将内相溶液注入油-脂质混合物中。在此过程中，旋转的油-脂质混合物产生的剪切力形成水相液滴，并如上所述最终转化为GUVs。然而，为了缩短注射平台的准备时间——特别是在诸如肌动蛋白网络组装等快速反应实验中，以及避免微毛细管可能发生的堵塞问题——目前改用直接将油-脂质混合物加入内相溶液并反复吹打的方式生成带有脂质单层的水相液滴。该方法消除了GUV包封过程中的时间延迟，适用于快速反应实验。

早期GUV生成方法带来的挑战之一是，根据GUV生成技术的不同，所使用的脂质类型（脂质电荷和脂质相态）受到限制。本研究测试了多种脂质类型，包括DOPC、二油酰基甘油磷脂酰丝氨酸（DOPS）、 二油酰基甘油琥珀酸酯（DGS）、二肉豆蔻酰基甘油磷脂酰胆碱（DMPC），以及不同脂质与胆固醇在不同浓度下的组合。在所有测试条件下，cDICE方法均能高效形成GUV，且封装效率高，GUV产率稳定。此外，cDICE方法还被证明可有效封装多种细胞组分，包括细胞骨架蛋白、无细胞表达反应体系、分子拥挤剂、染料以及其他不同大小的细胞分子，且不会降低封装效率或通量。此外，与常规倒置乳液转移 方法30类似，改进的cDICE方法未来有望用于生成不对称GUV。由于单层液滴可在微管内通过反复吹打预先独立形成，因此可分别为内小叶和外小叶使用不同的脂质组成，再于cDICE腔室内实现双层膜的“拉链式”闭合。 当脂质-油混合物长时间静置时，可观察到脂质发生沉降；但只需在封装前将脂质-油混合物涡旋振荡，即可重新分散脂质聚集体。需要注意的是，若脂质-油混合物存放时间过长，封装质量可能下降，这通常表现为脂质-油混合物中出现明显多于常规的脂质聚集体。尽管尚未经过实验验证，但这些聚集体可能导致双层膜“拉链”过程不完整，且可能随内相溶液一同被封装，从而破坏预期的化学环境。

该改进方法在形成水相液滴方面的局限性在于难以生成大小均一的液滴。尽管可通过在不同流速下使用微毛细管注射内相溶液来调节GUV的尺寸，从而改善这一问题，但这种方法较不适用于监测封装GUV中诸如肌动蛋白组装等快速反应。通过上下吹打移液的方式制备液滴，虽然会产生不同尺寸的GUV，但可从中分析出尺寸相近的囊泡群体。关于双分子层中可能残留油相的担忧，阻碍了大多数GUV制备技术（包括基于乳液的方法，如cDICE21）的广泛应用。然而，使用有机试剂（如1-辛醇）可减少膜中残留的油量，且该试剂可在囊泡形成后被去除31,32。未来有必要进一步研究对该方法的改进，例如通过改变溶剂组成来优化。

自下而上的合成生物学中仍有许多领域尚未被探索，可能需要利用GUVs实现类似细胞的限域环境。此类实验研究需要像cDICE这样的GUV生成平台，以稳健地生成GUVs，并高效包封多种目标分子。许多细胞过程的发生速度超过了以往GUV生成技术包封分子所需的时间。如本文所述，肌动蛋白溶液可被快速包封，从而观察到由肌动蛋白网络组装引起的囊泡形变。具有重建肌动蛋白细胞骨架的此类合成细胞已揭示了在不同交联分子存在下肌动蛋白网络组织的特征5,25,33 以及膜重塑过程25,27,28。这些成果将激励未来研究构建更为复杂的合成细胞。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

APL 感谢洪堡基金会资深研究人员研究奖学金以及美国国家科学基金会（1939310 和 1817909）和美国国立卫生研究院（R01 EB030031）提供的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯仿中的18:1 Liss Rhod PE脂质Avanti Polar Lipids810150C
96孔光学平底聚合物底板ThermoFisher Scientific165305
兔骨骼肌肌动蛋白CytoskeletonAKL99-A
ATTO 488标记的兔骨骼肌肌动蛋白Hypermol8153-01
Axygen微量管（200 µL）Fisher Scientific14-222-262用于处理ABPs
黑色树脂FormlabsRS-F2-GPBK-04
胆固醇（粉末）Avanti Polar Lipids700100P
氯仿Sigma Aldrich67-66-3
透明树脂FormlabsRS-F2-GPCL-04
CSU-X1共聚焦扫描单元YOKOGAWACSU-X1
密度梯度介质（Optiprep）Sigma-AldrichD1556
氯仿中的DOPC脂质Avanti Polar Lipids850375C
束蛋白（Fascin）自制N/A
F缓冲液（F-buffer）自制N/A
Fisherbrand微量管（1.5 mL）Fisher Scientific05-408-129
FS02超声波破碎仪Fischer ScientificFS20
G缓冲液（G-buffer）自制N/A
葡萄糖Sigma-Aldrich158968
iXon X3相机AndorDU-897E-CS0
矿物油Acros Organics8042-47-5
奥林巴斯IX81倒置显微镜OlympusIX21
奥林巴斯PlanApo N 60倍油镜物镜Olumpus1-U2B933
硅油Sigma-Aldrich317667

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