方法文章

快速将重建的细胞骨架封装到巨大单层囊泡内

DOI：

10.3791/63332

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2021年11月10日

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1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 2John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 3Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 6Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文介绍了一种快速制备包封细胞骨架蛋白的巨型单层囊泡的简单方法。该方法适用于在受限环境中从头重建细胞骨架结构以及研究细胞骨架与膜之间的相互作用。

摘要

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巨型单层囊泡（GUVs）常被用作生物膜的模型，因此是研究膜相关细胞过程的重要工具 体外近年来，将物质包裹于大单层囊泡（GUVs）内已被证明是细胞生物学及相关领域中进行重建实验的一种有效方法。相较于传统的生化重建方法，该技术能更好地模拟活细胞内的受限环境。然而，将物质包裹进GUVs的技术往往难以实施，且不同实验室之间的成功率可能存在显著差异。一种被称为连续液滴界面交叉包裹法（continuous droplet interface crossing encapsulation, cDICE）的技术已被证实可用于成功包裹较复杂的蛋白质系统。本文介绍了一种基于cDICE的方法，可快速高效地将细胞骨架蛋白包裹进GUVs中。该方法首先通过将目标蛋白质溶液在脂质/油混合物中乳化，生成具有脂单层的液滴；随后将这些脂单层液滴加入一个旋转的3D打印腔室中，使其在腔室内穿过水/油界面处的第二层脂单层，从而形成包含该蛋白质系统的GUVs。该方法简化了GUVs内包裹的整体操作流程，显著加快了实验进程，使我们能够限制并观察脂双层囊泡内网络组装的动态演化过程。该平台便于研究受限条件下细胞骨架与膜相互作用的力学机制。 关键词：大单层囊泡（GUVs），连续液滴界面交叉包裹法（cDICE），细胞骨架蛋白，脂双层，网络组装，受限环境，膜相互作用

引言

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脂质双分子层隔室被用作研究封闭有机反应和基于膜的过程的模型合成细胞，或作为药物递送应用中的载体模块1,2利用纯化组分自下而上研究生物学需要建立简化的实验系统，以探究生物大分子（如蛋白质与脂质）之间的性质及其相互作用3,4然而，随着该领域的进步，人们越来越需要更复杂的实验系统，以更好地模拟生物细胞内的条件。将物质包裹在GUVs中是一种切实可行的方法，可通过提供可变形且具有选择性通透性的脂双层以及受限的反应空间，赋予系统某些类似细胞的特性。特别是 体外 合成细胞模型中细胞骨架系统的重建可得益于在膜隔室中的封装5许多细胞骨架蛋白可结合并相互作用于细胞膜。由于大多数细胞骨架组装形成的结构贯穿整个细胞，其形态自然受到细胞尺度限域的决定。6.

生成GUV的方法有多种，例如溶胀法7,8、小囊泡融合法9,10、乳液转....

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方案

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1. 油脂混合物的制备

注意：该步骤必须在通风橱中进行，并遵守所有关于氯仿操作的安全指南。

  1. 取0.5 mL氯仿于15 mL玻璃小瓶中。加入88 µL浓度为25 mg/mL的二油酰基磷脂酰胆碱（DOPC）、9.3 µL浓度为50 mg/mL的胆固醇，以及5 µL浓度为1 mg/mL的二油酰基磷脂酰乙醇胺-丽丝胺罗丹明B（rhodamine PE）（见材料表）至该15 mL玻璃小瓶中。
    注意：DOPC和胆固醇在硅油/矿物油中的最终摩尔分数分别为69.9%和30%。已有研究表明，20–30 mol%的胆固醇浓度是使用本方法制备的大单层脂质体（GUVs）在膜流动性与稳定性方面的优化浓度25,26。从生理学角度看，这些数值处于哺乳动物细胞质膜中胆固醇浓度的正常范围内6。脂质储备液通常以氯仿溶液形式购得，并在-20 °C下保存。使用前应将脂质储备小瓶恢复至室温。
  2. 在另一个15 mL小瓶中，用移液器加入7.2 mL硅油和1.8 mL矿物油（见材料表）。通常，此步骤需在低湿度手套箱中进行，尤其是当矿物油被重复使用时。
  3. 将油相混合物在最大转速（3200 ....

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结果

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为了验证本方案成功构建了细胞骨架型大单层囊泡（GUVs），我们在GUVs中重建了fascin-肌动蛋白束结构。fascin是一种肌动蛋白丝的短交联蛋白，可形成刚性且平行排列的肌动蛋白束，通常以谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合蛋白的形式从E. coli中纯化获得26。首先在肌动蛋白聚合缓冲液中加入7.5%的密度梯度介质，重构浓度为5 µM的肌动蛋白，其中包含0.53 µM的ATTO488标记肌动蛋白。随后加入2.5 µM的fascin，并将fascin-肌动蛋白混合物包裹进GUVs，从而在GUVs内形成肌动蛋白束结构。封装1小时后，采集了罗丹明PE标记的GUVs中所包裹肌动蛋白束结构的Z轴层扫共聚焦图像序列（图2A）。此前研究已利用该方案证实，在GUVs内封装的两种肌动蛋白交联蛋白α-actinin与fascin之间存在固有的竞争与分选行为，并能依据GUV的大小形成不同的肌动蛋白束模式26。

与本文介绍的改良型.......

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讨论

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为了构建合成细胞，研究人员已探索了多种生成GUV的方法 然而，现有方法仍存在诸多挑战，包括操作步骤复杂、实现包封所需时间较长、对脂质类型及被包封物质的分子组成有限制、需要使用非生理性的化学试剂以促进包封、GUV产率低以及包封效率不稳定等问题。考虑到自下而上的合成生物学领域中可开展的研究范围广泛，若能建立一种无缝、高通量的GUV包封技术，可兼容不同脂质组成，并能包封任意大小的分子，则有望推动对复杂仿生合成系统的研究。cDICE方法已克服了以往GUV生成技术中存在的大多数挑战与局限性。

采用cDICE方法制备GUVs的技术路径及其基本原理早于该平台的出现，并已在早期技术（如倒置乳液转移法12）中得以应用。然而，倒置乳液转移法存在产率低和囊泡异质性等局限性。在本文所介绍的cDICE方法中，脂质以数十纳米大小的聚集体形式分散于油相中（脂质聚集体的尺寸取决于脂质的总体浓度）24。脂质分散于两种互溶的油中，其中一种（矿物油）可溶解脂质，另一种（硅油）则不与脂质互溶。通过溶剂转移的方式形成脂.......

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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APL 感谢洪堡基金会资深研究人员研究奖学金以及美国国家科学基金会（1939310 和 1817909）和美国国立卫生研究院（R01 EB030031）提供的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯仿中的18:1 Liss Rhod PE脂质Avanti Polar Lipids810150C
96孔光学平底聚合物底板ThermoFisher Scientific165305
兔骨骼肌肌动蛋白CytoskeletonAKL99-A
ATTO 488标记的兔骨骼肌肌动蛋白Hypermol8153-01
Axygen微量管（200 µL）Fisher Scientific14-222-262用于处理ABPs
黑色树脂FormlabsRS-F2-GPBK-04
胆固醇（粉末）Avanti Polar Lipids700100P
氯仿Sigma Aldrich67-66-3
透明树脂FormlabsRS-F2-GPCL-04
CSU-X1共聚焦扫描单元YOKOGAWACSU-X1
密度梯度介质（Optiprep）Sigma-AldrichD1556
氯仿中的DOPC脂质Avanti Polar Lipids850375C
束蛋白（Fascin）自制N/A
F缓冲液（F-buffer）自制N/A
Fisherbrand微量管（1.5 mL）Fisher Scientific05-408-129
FS02超声波破碎仪Fischer ScientificFS20
G缓冲液（G-buffer）自制N/A
葡萄糖Sigma-Aldrich158968
iXon X3相机AndorDU-897E-CS0
矿物油Acros Organics8042-47-5
奥林巴斯IX81倒置显微镜OlympusIX21
奥林巴斯PlanApo N 60倍油镜物镜Olumpus1-U2B933
硅油Sigma-Aldrich317667

参考文献

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  1. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685(2021).
  2. Diltemiz, S. E., et al. Use of art....

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重印与许可

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cDICE

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