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方法文章

从小鼠骨骼肌中分离线粒体用于呼吸测定实验

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DOI：

10.3791/63336

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2022年2月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, CSIC-UPO-JA, Universidad Pablo de Olavide, 2CIBERER, Instituto de Salud Carlos III

本文内容

摘要

本文介绍了一种从小鼠骨骼肌中分离线粒体的详细方法，以及随后利用基于微孔板的呼吸测定实验，通过氧消耗率（OCR）分析线粒体呼吸功能。该技术流程可用于研究多种环境或遗传干预对线粒体代谢的影响。

摘要

细胞所需的大部分能量是通过葡萄糖、脂肪酸和氨基酸经不同代谢途径降解后，最终汇聚于线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）系统而获得的，该过程会根据细胞需求进行调控。脂类分子辅酶Q（CoQ）在此过程中发挥关键作用，通过持续的氧化/还原循环将电子传递至电子传递链（ETC）中的复合物III。通过呼吸测定法测量ETC的氧气消耗速率，可评估线粒体状态及最终的细胞健康状况。此类研究通常在已建立的细胞系或原代细胞系中进行，这些细胞需培养数天。然而，无论是哪种情况，所获得的呼吸参数可能已偏离正常的生理状态 任何给定的器官或组织。

此外，从骨骼肌分离出的培养单根肌纤维的内在特性也阻碍了此类分析。本文提供了一种更新且详细的方案，用于分析从小鼠骨骼肌新鲜分离的线粒体的呼吸作用。我们还针对该过程中各个步骤可能出现的潜在问题提供了相应的解决方案。本文所述方法可用于比较不同转基因小鼠模型中的氧气消耗速率，并研究线粒体对药物处理或其他因素（如衰老或性别）的响应。该方法是回答有关线粒体生物能量代谢及其调控关键问题的可行手段。

引言

线粒体是细胞中的主要代谢细胞器1。这些特化的膜包被细胞器通过氧化磷酸化（OXPHOS）利用营养分子产生三磷酸腺苷（ATP）形式的能量。该过程依赖于电子从供体分子经由电子传递链（ETC）中一系列氧化还原反应进行传递2。辅酶Q（CoQ）是唯一一种在所有细胞膜和循环脂蛋白中内源性合成并具有抗氧化功能的氧化还原活性脂质3。它是电子传递链中的关键组分，负责将电子从依赖NADH的复合物I和依赖FADH2的复合物II传递至复合物III；然而，在多种细胞代谢途径中，许多其他还原酶也可催化线粒体CoQ还原为泛醇，这是其中必不可少的步骤4,5。

在整个过程中，线粒体内膜上会形成电化学质子梯度，该梯度由ATP合酶复合物V2转化为生物活性能量。因此，线粒体功能障碍会导致多种病理状态，主要影响高能量需求的组织——大脑、心脏和骨骼肌6,7。因此，建立能够准确分析线粒体生物能量学的方法至关重要，以研究其在健康和疾病中的作用，尤其是在骨骼肌等高能量需求的组织中。

克拉克型氧电极传统上被用于线粒体呼吸研究8然而，这一系统已逐渐被更高分辨率的技术所取代，其中基于微孔板的耗氧量检测技术尤为流行，如安捷伦 Seahorse XF 分析仪9在骨骼肌研究领域，这些研究通常在培养细胞中进行，主要使用C2C12永生化小鼠成肌细胞系或源自卫星细胞的原代培养细胞10,11然而，这些研究并未完全再现该情况 在体尤其是在研究特定损伤、非遗传干预或基因操作后组织水平上的线粒体生物学与功能时。

此外，由于存在其他因素，细胞呼吸测定更为复杂，这些因素包括细胞内线粒体外对ATP和测定底物的需求或信号转导事件，可能误导对实验结果的解读。另一种方法是使用从肌肉中新鲜分离的单根或成束肌纤维。然而，该分离方法在技术上具有挑战性，且仅适用于少数几种肌肉类型。在此情况下，主要使用趾短屈肌（flexor digitorum brevis, FDB）和趾长伸肌（extensor digitorum longus, EDL）肌肉10,12,13，尽管也有少数报道描述了其他类型肌肉的应用14,15。

已有研究报道对骨骼肌切片进行生物能量谱分析16。该方法的主要优势在于可研究完整的肌肉组织（作者证明，与分离的肌纤维相比，切割肌纤维并不会影响实验结果）。然而，线粒体对底物及检测抑制剂的可及性受限，因此仅能测定少数几个参数16。最后，也可使用分离的线粒体进行类似实验9,17,18,19。但在此情况下，线粒体失去了其原有的胞质环境，可能影响其功能。相比之下，该方法可确保底物和抑制剂的充分接触，能够分析多种类型的样本，且通常所需材料更少。

本文介绍了一种利用基于微孔板的呼吸测定法对小鼠骨骼肌中分离的线粒体进行生物能量谱分析的方法（图1）。具体而言，本文详细描述了三种实验方案：耦合测定法（CA），用于评估电子传递链（ETC）与氧化磷酸化（OXPHOS）系统之间的耦合程度；电子流测定法（EFA），用于测量各电子传递链复合物的活性；以及BOX测定法，用于测定线粒体的β-氧化能力。值得注意的是，与传统的呼吸测定方法相比，该方法所需样品量极少。本文所采用的线粒体分离方案是在已有文献报道的方法基础上进行改良的18。

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方案

小鼠饲养和组织采集均按照西班牙皇家法令53/2013、欧盟指令2010/63/EU及其他相关指南，在塞维利亚西班牙帕布罗·德奥拉维德大学伦理委员会（西班牙塞维利亚；方案编号24/04/2018/056和12/03/2021/033）批准的方案下进行。

1. 呼吸测定实验所需储备液、缓冲液和试剂的配制

  1. 配制以下贮存液，这些溶液可在指定温度下保存数月。使用超纯水2在所有情况下。
    1. 将磷酸盐缓冲液（PBS）片剂溶解于 H2O（每200 mL H₂O使用1片）2O）配制1× PBS。溶液经高压灭菌后，于室温（RT）保存。
    2. 将2 g NaOH颗粒溶解于50 mL H2O 配制 1 M NaOH。
    3. 配制用于pH校准的0.1 M、1 M、5 M和10 M KOH储备液。
    4. 将 14.612 g EDTA 加入 70 mL H2O. 加入 NaOH 颗粒直至 pH 达到 8.0，以使 EDTA 完全溶解。加入 H2O 适量 (QS) 至 100 mL。将所得 0.5 M EDTA (pH 8) 溶液高压灭菌后室温保存。
    5. 将19 g EGTA加入70 mL H2O. 加入 NaOH 颗粒直至 pH 达到 8.0，以使 EGTA 充分溶解。加入 H2将体积补至100 mL。将所得0.5 M EGTA（pH 8）溶液高压灭菌后室温保存。
    6. 向98 mL PBS中加入2 mL 0.5 M EDTA，将所得10 mM EDTA/PBS溶液于室温保存。
    7. 将 5.958 g HEPES 溶解于 40 mL H2O. 用 KOH 将 pH 调至 7.2，并用 H₂O 定容至 50 mL2O. 将所得的 0.5 M HEPES 缓冲液通过 0.45 µm 滤膜过滤，并在室温下保存。
    8. 溶解 3.402 g KH2PO4 最多50 mL H2O. 将所得的 0.5 M KH 溶液过滤2PO4 溶液 通过0.45 µm滤网过滤，并在室温下保存。
    9. 溶解 9.521 g 无水 MgCl₂ 于 80 mL 去离子水中。2 最多100 mL的H2O. 将所得的1 M MgCl₂溶液进行高压灭菌2 溶液并在室温下保存。
      注意：由于该反应为放热反应，操作时需谨慎，并缓慢溶解 MgCl2 置于冰上。
  2. 制备底物和抑制剂的储备液（参见 表1分装后于 -20 °C 保存。避免反复冻融。例外情况：丙酮酸必须在使用前立即配制。
    1. 在超纯 H 中配制2O：0.5 M 丙二酸、0.5 M 丙酮酸、0.5 M 苹果酸、100 mM ADP、1 M 抗坏血酸和 50 mM N,N,N′,N′-四甲基对苯二胺（TMPD）（避光保存）。
    2. 在100%二甲基亚砜（DMSO）中配制：50 mM 棕榈酰-L-肉碱、4 mM 鱼藤酮、20 mM 羰基氰化-p-三氟甲氧基苯腙（FCCP）、4 mM 寡霉素和5 mM 抗霉素A。
      注意：微孔板孔中最终 DMSO 浓度不得超过 0.1%。因此，应配制高浓度的储备液，以确保不超过此限值。
  3. 在实验当天新鲜配制用于线粒体分离和蛋白质定量的缓冲液。使用超纯水2在所有情况下均使用 O，并将所有缓冲液置于冰上，除非另有说明。
    注意：为节省时间，所有试剂可在前一天称量完毕，并按要求置于适当容器（如15 mL离心管）中，于相应温度下保存。
    1. 配制10%游离脂肪酸（FFA）BSA溶液，将150 mg FFA BSA完全溶解于1.5 mL H2通过倒置/旋转轮进行混匀。避免涡旋振荡，以防产生泡沫。
    2. 为配制1x Bradford试剂，将5x商用储备液用H2O，并在室温下避光保存。
    3. 为配制8倍浓缩线粒体缓冲液（MB），将4.112 g蔗糖和763 mg HEPES溶解于15 mL H₂O中2O. 调节pH至7.2，加入1.6 mL 10% FFA BSA，并用H₂O定容至20 mL2O.
    4. 配制 20 mL 分离缓冲液 1（IB1）（每份样品使用 4 mL），将 400 µL 0.5 M EDTA、784 mg D-甘露醇和 2.5 mL 8x MB 溶解于 15 mL H₂O 中2O. 用 H 调至 pH 7.2 并定容2O.
    5. 配制 5 mL 分离缓冲液 2（IB2）（每样本使用 500 µL），将 30 µL 0.5 M EGTA、196 mg D-甘露醇和 625 µL 8x MB 溶解于 4 mL H₂O 中2O. 用 H 调至 pH 7.2 并定容2O.
    6. 配制 5 mL 重悬缓冲液（RB）（每份样品使用 200 µL），将 120 mg 蔗糖、191.3 mg D-甘露醇、50 µL 0.5 M HEPES 和 10 µL 0.5 M EGTA 溶于 4 mL H₂O 中2O. 用 H 调至 pH 7.2 并定容2O.
    7. 准备2x 线粒体检测溶液-1（MAS-1）：溶解1.199 g蔗糖、2.8 g甘露醇、1 mL 0.5 M KH2PO4，250 µL 1 M MgCl2，200 µL 0.5 M HEPES，以及 100 µL 0.5 M EGTA 加入 20 mL H2O. 用 H 调至 pH 7.2，并定容至 25 mL2O. 短时间内置于冰上保存。如需较长时间保存，应置于 4 °C 以避免沉淀。
    8. 为配制1倍浓度的偶联测定培养基（CAM），需准备两种基于MAS-1的不同缓冲液：1）用于偶联测定实验本身的CAM+BSA，以及2）用于配制测定抑制剂的CAM-BSA。丙酮酸与苹果酸的比例应始终保持在10:1。
      注意：由于 BSA 可能堵塞注射孔，因此需将抑制剂稀释于不含 BSA 的 CAM 中。
      1. 为制备CAM+BSA，将300 µL 0.5 M丙酮酸、30 µL 0.5 M苹果酸和7.5 mL 2x MAS-1加入6 mL H₂O中稀释2O. 将pH值调整至7.2，加入300 µL 10%游离脂肪酸-BSA，用H₂O定容至15 mL2O.
      2. 为制备CAM-BSA，将120 µL 0.5 M丙酮酸、12 µL 0.5 M苹果酸和3 mL 2x MAS-1加入2 mL H₂O中稀释2O. 用 H 调节 pH 至 7.2，并定容至 6 mL2O.
    9. 为配制1倍电子传递测定培养基（EFAM），需分别配制含BSA和不含BSA的EFAM缓冲液。
      1. 为制备EFAM+BSA，将300 µL 0.5 M丙酮酸、60 µL 0.5 M苹果酸、3 µL 20 mM FCCP和7.5 mL 2x MAS-1加入6 mL H₂O中稀释2O. 将pH值调整至7.2，加入300 µL 10%游离脂肪酸牛血清白蛋白（FFA BSA），用H₂O定容至15 mL。2O.
      2. 为制备EFAM-BSA，将120 µL 0.5 M丙酮酸、24 µL 0.5 M苹果酸、1.2 µL 20 mM FCCP和3 mL 2x MAS-1加入2 mL H₂O中稀释2O. 用 H 调至 pH 7.2，并定容至 6 mL2O.
    10. 为制备1倍β-氧化培养基（BOXM），需分别配制含BSA和不含BSA的BOXM溶液。
      1. 为制备 BOXM+BSA，将 12 µL 50 mM 棕榈酰-L-肉碱、30 µL 0.5 M 苹果酸和 7.5 mL 2x MAS-1 加入 7 mL H₂O 中稀释2O. 将pH值调整至7.2，加入300 µL 10%游离脂肪酸-BSA，用H₂O定容至15 mL2O.
      2. 为制备 BOXM-BSA，将 4.8 µL 50 mM 棕榈酰-L-肉碱、12 µL 0.5 M 苹果酸和 3 mL 2x MAS-1 加入 2 mL H₂O 中2O. 用 H 调至 pH 7.2，并定容至 6 mL2O.

2. 肌肉组织的解剖、匀浆及线粒体分离

  1. 将所有材料和缓冲液置于冰上。确保整个操作过程中所有材料均保持冰冻状态，以保护线粒体免受损伤。
  2. 每个样品在冰上放置三个 50 mL 烧杯，并加入以下溶液：烧杯 1 中加入 10 mL PBS，烧杯 2 中加入 10 mL 10 mM EDTA/PBS，烧杯 3 中加入 4 mL IB1。
  3. 通过颈椎脱位法处死小鼠。避免使用 CO2 处死法，因为骨骼肌可能缺氧，从而干扰呼吸分析。
  4. 用 70% 乙醇喷洒右侧后肢以防止毛发脱落，并将肢体固定在软木解剖板上。同时将左侧前肢也固定好。
  5. 使用无菌一次性手术刀从膝部至足趾处沿皮肤做切口。
  6. 用有齿镊在踝部夹住皮肤，并用精细剪刀在踝部周围剪开皮肤。
  7. 一手用尖头镊子将皮肤从下方肌肉组织上轻轻剥离，另一手用有齿镊向上牵拉皮肤。
  8. 从踝部至膝部解剖所有骨骼肌（图 2）。
    1. 使用精细镊子和剪刀去除胫前肌（TA）表面的所有结缔组织，以便于肌肉的取出。
    2. 找到趾长伸肌（EDL）的四个远端肌腱，并在其插入趾部的位置附近切断。定位 TA 肌的远端肌腱，并在其插入点附近切断，始终在踝部以下进行。
    3. 小心向上牵拉踝部以上的 TA 和 EDL 肌腱，以释放游离端。
    4. 夹住肌腱的游离端，向上牵拉肌肉，使其与其余肌肉组织和骨骼分离。可使用精细镊子或剪刀辅助操作。操作时需小心，避免肌纤维收缩。
    5. 尽可能靠近髌骨处切断 EDL 和 TA 肌的近端肌腱。
    6. 将小鼠翻转至倒置位置，继续进行腓肠肌（GA）和比目鱼肌的取材。
    7. 用有齿镊夹住股二头肌与腓肠肌之间的间隙，使用精细剪刀分离这两块肌肉，以暴露腓肠肌的近端肌腱。
    8. 用精细镊子夹住跟腱，并用精细剪刀小心切断。通过肌腱向上牵拉，使腓肠肌和比目鱼肌从下方骨骼上分离。切断腓肠肌近端肌腱，连同其下方的比目鱼肌一并游离。
    9. 按照相同方法，从肌腱到肌腱仔细解剖其余肌肉，直至仅剩骨骼。
    10. 将小鼠重新固定于初始位置，以解剖股四头肌。
    11. 使用有齿镊和精细剪刀去除股四头肌近端侧的脂肪组织。
    12. 将精细镊子插入股四头肌与股骨之间，并沿股骨轴线双向移动，以使肌肉与骨骼分离。
    13. 用有齿镊夹住股四头肌远端肌腱，并用精细剪刀尽可能靠近髌骨处切断肌腱。
    14. 向上牵拉股四头肌，并用精细剪刀在近端附着点处将其游离。
  9. 对左侧后肢重复本节步骤 4–8 。
  10. 先将所有肌肉在烧杯 1 中漂洗，再在烧杯 2 中漂洗。
  11. 将所有肌肉转移至烧杯 3，并在冰上用锋利剪刀将肌肉精细剪碎。
  12. 将悬液转移至 C 管（紫色盖），始终保持其处于冰上。
  13. 紧密关闭 C 管，并将其倒置固定在匀浆器套管上。确保样品位于转子/定子区域。选择名为 m_mito_tissue_01 的 1 分钟程序。
  14. 将匀浆液分装至两个预冷的 2 mL 微量离心管中，在台式离心机中于 4 °C 以 700 × g 离心 10 分钟。
  15. 将上清液小心转移至新的预冷 2 mL 管中，避免转移脂肪和未匀浆组织。将沉淀物储存于 -80 °C，用于碎片纯度测定（组分 N）（图 3）。
  16. 将上清液在 4 °C 以 10,500 × g 离心 10 分钟。
  17. 将上清液转移至新的预冷 2 mL 管中，标记为上清液 1（SN1）。储存于 -80 °C，用于碎片纯度测定（图 3）。
  18. 在冰上用 IB2 缓冲液将两个沉淀物重悬并合并，总体积为 500 µL。
  19. 在 4 °C 以 10,500 × g 离心 10 分钟。
  20. 将上清液转移至新的预冷 2 mL 管中，标记为上清液 2（SN2）。储存于 -80 °C，用于碎片纯度测定（图 3）。
  21. 将最终的线粒体沉淀物重悬于 200 µL RB 缓冲液中。立即取出 10 µL 用于蛋白定量，并立即向剩余线粒体悬液中加入 10 µL 10% FFA BSA，以防止损伤。
  22. 使用 Bradford 法测定蛋白浓度。
    1. 为标准曲线制备 RB 缓冲液中已知浓度蛋白的 30 µL 系列稀释液。例如，使用 1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL 和 0 mg/mL 的 BSA。
    2. 在 RB 缓冲液中对线粒体样品进行 1:3 和 1:6 的系列稀释。
    3. 在 96 孔平底板中，每孔先加入 2.5 µL 样品或标准品。然后向每个样品中加入 10 µL 1 M NaOH，最后加入 200 µL 1× Bradford 试剂。充分混匀，避免产生气泡。目视检查样品颜色是否在标准曲线范围内。所有分析均需设三个重复。
    4. 在室温避光条件下孵育 5 分钟，使用酶标仪在 595 nm 处读取吸光度。
    5. 通过绘制吸光度值（y 轴）与本节步骤 22.1 中所配制稀释液对应的蛋白浓度（x 轴）的关系图，计算标准曲线。
    6. 利用标准曲线外推法计算线粒体样品中的总蛋白量。

3. 基于微孔板的呼吸测定实验的准备

  1. 实验前至少12小时，用每孔1 mL校准缓冲液水合呼吸测定法传感器。在37 °C下孵育（无需CO2）。
    注意：水合后的传感器可在72小时内使用。此步骤中应小心操作 cartridge：若任何物体接触传感器，可能影响测量灵敏度。
  2. 将配有摆桶式微孔板转子及相应微孔板适配器的制备型离心机预冷至4 °C。
  3. 打开计算机，启动分析软件，并选择所需的实验方案。
    注意：当软件连接至耗氧量测定仪器时会听到一声提示音。实验开始前，加热传感器应显示为绿色且温度达到37 °C。
  4. 根据待执行的实验方案，从第1节第2步中指定的母液配制抑制剂溶液 。每种溶液需准备足够的体积。参见表1和表2作为参考。
  5. 向每个加样孔中加入相应体积的抑制剂，将cartridge插入耗氧量测定仪器中，并开始校准。
    注意：向cartridge中添加抑制剂并将其插入仪器的过程需15–20分钟。确保正确安装cartridge的各个组件。cartridge盖和hydro booster可丢弃，而sensor cartridge和utility plate需保留使用。
  6. 将第2节第21步 获得的浓缩线粒体悬液在4 °C下以10,500 × g离心10分钟。
  7. 根据所执行的实验方案，用100 µL的1x CAM+BSA、1x EFAM+BSA或1x BOXM+BSA重悬线粒体沉淀。
  8. 进一步 将浓缩的线粒体样品用相应的测定培养基稀释至终浓度为0.2 µg/µL。
  9. 在预冷的24孔微孔板中，每孔接种50 µL悬液（总蛋白量10 µg），并将微孔板置于冰上。背景校正孔中不加线粒体，仅加入相应的测定培养基。剩余的线粒体悬液储存于-80 °C，用于后续碎片纯度检测（图3）。
  10. 将微孔板在预冷的制备型离心机中于4 °C、2,000 × g离心20分钟。注意配平对称放置。
  11. 在微孔板离心过程中，将剩余的测定培养基预热至37 °C。
  12. 离心结束后，将微孔板置于实验台上静置5分钟以平衡温度。随后每孔缓慢加入450 µL预热的测定培养基，使每孔终体积为500 µL（室温）。操作时应小心缓慢，将培养基沿孔壁加入，避免冲起已沉降的线粒体。
  13. 立即取下微孔板盖，将微孔板放入耗氧量测定仪器中并启动实验程序（表3）。确保第一步为10分钟的孵育期，以便微孔板升温至设定温度。
  14. 实验结束后，取出cartridge和微孔板，关闭仪器，开始数据分析。

4. 结果分析

  1. 对于CA和BOX检测，执行以下分析：
    1. 记录非线粒体氧消耗率2 消耗量，对应于加入抗霉素A和鱼藤酮后所获得数值的平均值。
      ​注意：抗霉素A和鱼藤酮分别为复合体III和复合体I的抑制剂。
    2. 通过减去非线粒体氧消耗量来计算基础呼吸率2 从基础值开始的消耗量（测量点1和2）。
    3. 扣除非线粒体氧消耗2 通过测定加入复合体 V 底物 ADP（注射 A）后耗氧量的变化，以确定线粒体状态 III。
    4. 扣除非线粒体氧消耗2 通过注射复合体V抑制剂寡霉素（注射B）后的呼吸值，计算线粒体状态IVo的耗氧量。
    5. 通过减去非线粒体氧消耗率来计算线粒体状态 IIIu2 FCCP 注射后（注射 C）由呼吸作用引起的消耗量
      注意：FCCP 是一种强效的线粒体氧化磷酸化解偶联剂。在 FCCP 存在时，ATP 合成被绕过，电子传递链达到最大活性。
    6. 从线粒体状态IIIu值中减去基础呼吸值，以获得线粒体备用呼吸能力，即在能量需求增加时生成额外ATP的能力。
    7. 将线粒体状态 IIIu 除以状态 IVo 的值，以获得呼吸控制比（RCR）。
      注意：负值或零值的 RCR 表明线粒体偶联受到影响。
  2. 参照EFA，进行以下计算：
    1. 通过计算鱼藤酮和抗霉素A注射后（注射A和C）的平均值，获得残余活性。
    2. 通过从基础值（测量点1和2）中减去残余活性来计算复合物I至IV（CI-CIV）的活性。
    3. 从琥珀酸（注射B）作为CII底物注射后的数值中减去残余活性，以获得CII-CIII-CIV活性。
    4. 通过从加入细胞色素c还原剂抗坏血酸和TMPD（D注射）后测得的数值中减去残余活性，计算CIV活性。
  3. 使用柱状图表示所有结果，如 图4，以得出恰当的结论。

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结果

本方案通过分离小鼠骨骼肌中的线粒体，实现了对线粒体呼吸功能的体内分析。方法概要见图1。从后肢分离骨骼肌组织（图2）后，在等渗条件下通过连续离心对组织进行匀浆并纯化线粒体。分离过程中获得的不同组分的纯度可通过蛋白质印迹法（Western blot）分析，使用针对不同细胞器标志物的抗体进行检测。图3A展示了不同组分的总体蛋白质谱，显示各分离组分中存在不同的蛋白质群体。

图3B 显示所有线粒体成分均存在于线粒体组分中，这由外膜（VDAC 和 TOMM20）、内膜（TIMM23）标志物以及线粒体核样结构相关蛋白（mtTFA）的强信号所证实。所有细胞核及细胞骨架成分（β-actin）均存在于组分 N 中，该组分代表细胞核及未破碎的物质（图3C）。此外，大部分内质网（ER）标志物（...

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讨论

所有用于研究线粒体呼吸的方法均存在一定的局限性，因此，选择最适合特定实验问题的方法至关重要。本文提供了一种更新且详细的方案，用于从小鼠骨骼肌中分离线粒体，以开展多种呼吸测定实验，从而探究线粒体功能。事实上，利用基于微孔板的技术对分离的线粒体进行线粒体生物能量学研究，在可重复性、可靠性和复杂性方面，对于研究组织特异性呼吸具有重要价值。此外，使用分离的线粒体可精确控制底物的可利用性，有助于深入理解潜在的生物学过程。使用分离线粒体的另一个优势在于可以研究III态呼吸，因为在加入ADP后生成的ATP不会被重新转化为新的ADP，因为大部分跨膜ATP酶已在分离过程中丢失。此外，在本文所述的测定中，会加入寡霉素以阻断潜在的非特异性ATP合成20。

本方案有几个重要事项需要特别说明。首先，分离得到的线粒体极为敏感，操作时应格外小心。所用缓冲液中含有高浓度的蔗糖和甘露醇，可确保最佳渗透压条件，从而保护分离的线粒体免受损伤。尽管如此，仍应尽量缩短检测时间，以维持线粒体活性，并防止其接种到微孔板后发生脱落。因此，鉴于实验步骤（如检测培养基、底物和抑制剂溶液...

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披露

作者声明不存在任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Juan J. Tena 提供匀浆器，以及 CABD 蛋白质组学与动物饲养设施提供的技术支持。本工作由西班牙教育、文化与体育部通过授予 J.D.H.C. 的博士奖学金 FPU16/03264、法国肌肉疾病协会（AFM）通过授予 C.V.-G. 的奖学金项目 #22450、机构资助 MDM-2016-0687（玛丽亚·德·马埃斯图卓越单位，CABD 基因调控与形态发生系）以及 BFU2017-83150-P 项目资助（J.J.C.）提供支持。同时感谢安达卢西亚政府资助 P18-RT-4572、欧洲联盟欧洲区域发展基金（FEDER）资助计划，以及西班牙科学、创新与大学部资助 RED2018-102576-T（P.N.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ADPSigmaA5285-20 °C 保存
AKT 抗体Cell Signaling TechnologyC67E7兔（宿主物种）
抗山羊 HRPSigma401504兔（宿主物种）
抗小鼠 HRPCell Signaling#7076马（宿主物种）
抗霉素 ASigmaA8674-20 °C 保存
抗兔 HRPCell Signaling#7074山羊（宿主物种）
抗坏血酸SigmaA5960室温保存
Bactin 抗体SigmaMBS4-48085山羊（宿主物种）
Bio-Rad 蛋白定量试剂盒 IIBio-Rad5000002包含 5x Bradford 试剂和已知浓度的 BSA，用于标准曲线
BSA，组分 V，无脂肪酸Calbiochem1265754 °C 保存
C 管Miltenyi Biotec130-093-237紫色盖
钙联蛋白抗体ThermoFisherMA3-027小鼠（宿主物种）
D-甘露醇SigmaM4125室温保存
EDTABDH280254D4 °C 保存
EGTASigmaE-4378室温保存
FCCPSigmaC2920-20 °C 保存
gentleMACS 组织解离器Miltenyi Biotec130-093-235匀浆器
HEPESSigmaH3375室温保存
HSP70 抗体Proteintech10995-1-AP兔（宿主物种）
LDH-A 抗体Santa Cruz BiotechnologySC27230山羊（宿主物种）
氯化镁ChemCruzsc-255260A室温保存
苹果酸SigmaP1645室温保存
微孔板分光光度计BMG LABTECH GmbHPOLARstar OMEGA S/N 415-0292室温保存
Milli-Q 水Millipore 系统F7HA17757A超纯水
mtTFA 抗体Santa Cruz BiotechnologySC23588山羊（宿主物种）
Na+/K+-ATPase α1 抗体Novus BiologicalsNB300-14755小鼠（宿主物种）
寡霉素SigmaO4876-20 °C 保存
棕榈酰-L-肉碱SigmaP1645-20 °C 保存
PBS 片剂SigmaP4417-100TAB1x 溶液，室温保存
磷酸二氢钾ChemCruzsc-203211室温保存
氢氧化钾Sigma60377室温保存
丙酮酸Sigma1073604 °C 保存
鱼藤酮SigmaR8875-20 °C 保存
Seahorse XF24 线粒体通量分析仪Agilent Technologies420179XFe24 型号
Seahorse XFe24 FluxPak 微型试剂盒Agilent Technologies102342-100试剂盒包含探针卡、微孔板和校准液
琥珀酸SigmaS7626室温保存
蔗糖SigmaS9378室温保存
TIMM23 抗体Abcamab230253兔（宿主物种）
TMPDSigmaT7394-20 °C 保存
TOMM20 抗体Abcamab56783小鼠（宿主物种）
VDAC 抗体Abcamab15895兔（宿主物种）

参考文献

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