从小鼠骨骼肌中分离线粒体用于呼吸测定实验

摘要

本文介绍了一种从小鼠骨骼肌中分离线粒体的详细方法，以及随后利用基于微孔板的呼吸测定实验，通过氧消耗率（OCR）分析线粒体呼吸功能。该技术流程可用于研究多种环境或遗传干预对线粒体代谢的影响。

摘要

细胞所需的大部分能量是通过葡萄糖、脂肪酸和氨基酸经不同代谢途径降解后，最终汇聚于线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）系统而获得的，该过程会根据细胞需求进行调控。脂类分子辅酶Q（CoQ）在此过程中发挥关键作用，通过持续的氧化/还原循环将电子传递至电子传递链（ETC）中的复合物III。通过呼吸测定法测量ETC的氧气消耗速率，可评估线粒体状态及最终的细胞健康状况。此类研究通常在已建立的细胞系或原代细胞系中进行，这些细胞需培养数天。然而，无论是哪种情况，所获得的呼吸参数可能已偏离正常的生理状态 任何给定的器官或组织。

此外，从骨骼肌分离出的培养单根肌纤维的内在特性也阻碍了此类分析。本文提供了一种更新且详细的方案，用于分析从小鼠骨骼肌新鲜分离的线粒体的呼吸作用。我们还针对该过程中各个步骤可能出现的潜在问题提供了相应的解决方案。本文所述方法可用于比较不同转基因小鼠模型中的氧气消耗速率，并研究线粒体对药物处理或其他因素（如衰老或性别）的响应。该方法是回答有关线粒体生物能量代谢及其调控关键问题的可行手段。

引言

线粒体是细胞中的主要代谢细胞器¹。这些特化的膜包被细胞器通过氧化磷酸化（OXPHOS）利用营养分子产生三磷酸腺苷（ATP）形式的能量。该过程依赖于电子从供体分子经由电子传递链（ETC）中一系列氧化还原反应进行传递²。辅酶Q（CoQ）是唯一一种在所有细胞膜和循环脂蛋白中内源性合成并具有抗氧化功能的氧化还原活性脂质³。它是电子传递链中的关键组分，负责将电子从依赖NADH的复合物I和依赖FADH₂的复合物II传递至复合物III；然而，在多种细胞代谢途径中，许多其他还原酶也可催化线粒体CoQ还原为泛醇，这是其中必不可少的步骤^4,5。

在整个过程中，线粒体内膜上会形成电化学质子梯度，该梯度由ATP合酶复合物V²转化为生物活性能量。因此，线粒体功能障碍会导致多种病理状态，主要影响高能量需求的组织——大脑、心脏和骨骼肌^6,7。因此，建立能够准确分析线粒体生物能量学的方法至关重要，以研究其在健康和疾病中的作用，尤其是在骨骼肌等高能量需求的组织中。

方案

小鼠饲养和组织采集均按照西班牙皇家法令53/2013、欧盟指令2010/63/EU及其他相关指南，在塞维利亚西班牙帕布罗·德奥拉维德大学伦理委员会（西班牙塞维利亚；方案编号24/04/2018/056和12/03/2021/033）批准的方案下进行。

1. 呼吸测定实验所需储备液、缓冲液和试剂的配制

1. 配制以下贮存液，这些溶液可在指定温度下保存数月。使用超纯水₂在所有情况下。
   1. 将磷酸盐缓冲液（PBS）片剂溶解于 H₂O（每200 mL H₂O使用1片）₂O）配制1× PBS。溶液经高压灭菌后，于室温（RT）保存。
   2. 将2 g NaOH颗粒溶解于50 mL H₂O 配制 1 M NaOH。
   3. 配制用于pH校准的0.1 M、1 M、5 M和10 M KOH储备液。
   4. 将 14.612 g EDTA 加入 70 mL H₂O. 加入 NaOH 颗粒直至 pH 达到 8.0，以使 EDTA 完全溶解。加入 H₂O 适量 (QS) 至 100 mL。将所得 0.5 M EDTA (pH 8) 溶液高压灭菌后室温保存。
   5. 将19 g EGTA加入70 mL H₂....

结果

本方案通过分离小鼠骨骼肌中的线粒体，实现了对线粒体呼吸功能的体内分析。方法概要见图1。从后肢分离骨骼肌组织（图2）后，在等渗条件下通过连续离心对组织进行匀浆并纯化线粒体。分离过程中获得的不同组分的纯度可通过蛋白质印迹法（Western blot）分析，使用针对不同细胞器标志物的抗体进行检测。图3A展示了不同组分的总体蛋白质谱，显示各分离组分中存在不同的蛋白质群体。

图3B 显示所有线粒体成分均存在于线粒体组分中，这由外膜（VDAC 和 TOMM20）、内膜（TIMM23）标志物以及线粒体核样结构相关蛋白（mtTFA）的强信号所证实。所有细胞核及细胞骨架成分（β-actin）均存在于组分 N 中，该组分代表细胞核及未破碎的物质（图3C）。此外，大部分内质网（ER）标志物（.......

讨论

所有用于研究线粒体呼吸的方法均存在一定的局限性，因此，选择最适合特定实验问题的方法至关重要。本文提供了一种更新且详细的方案，用于从小鼠骨骼肌中分离线粒体，以开展多种呼吸测定实验，从而探究线粒体功能。事实上，利用基于微孔板的技术对分离的线粒体进行线粒体生物能量学研究，在可重复性、可靠性和复杂性方面，对于研究组织特异性呼吸具有重要价值。此外，使用分离的线粒体可精确控制底物的可利用性，有助于深入理解潜在的生物学过程。使用分离线粒体的另一个优势在于可以研究III态呼吸，因为在加入ADP后生成的ATP不会被重新转化为新的ADP，因为大部分跨膜ATP酶已在分离过程中丢失。此外，在本文所述的测定中，会加入寡霉素以阻断潜在的非特异性ATP合成²⁰。

本方案有几个重要事项需要特别说明。首先，分离得到的线粒体极为敏感，操作时应格外小心。所用缓冲液中含有高浓度的蔗糖和甘露醇，可确保最佳渗透压条件，从而保护分离的线粒体免受损伤。尽管如此，仍应尽量缩短检测时间，以维持线粒体活性，并防止其接种到微孔板后发生脱落。因此，鉴于实验步骤（如检测培养基、底物和抑制剂溶液.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ADP	Sigma	A5285	-20 °C 保存
AKT 抗体	Cell Signaling Technology	C67E7	兔（宿主物种）
抗山羊 HRP	Sigma	401504	兔（宿主物种）
抗小鼠 HRP	Cell Signaling	#7076	马（宿主物种）
抗霉素 A	Sigma	A8674	-20 °C 保存
抗兔 HRP	Cell Signaling	#7074	山羊（宿主物种）
抗坏血酸	Sigma	A5960	室温保存
Bactin 抗体	Sigma	MBS4-48085	山羊（宿主物种）
Bio-Rad 蛋白定量试剂盒 II	Bio-Rad	5000002	包含 5x Bradford 试剂和已知浓度的 BSA，用于标准曲线
BSA，组分 V，无脂肪酸	Calbiochem	126575	4 °C 保存
C 管	Miltenyi Biotec	130-093-237	紫色盖
钙联蛋白抗体	ThermoFisher	MA3-027	小鼠（宿主物种）
D-甘露醇	Sigma	M4125	室温保存
EDTA	BDH	280254D	4 °C 保存
EGTA	Sigma	E-4378	室温保存
FCCP	Sigma	C2920	-20 °C 保存
gentleMACS 组织解离器	Miltenyi Biotec	130-093-235	匀浆器
HEPES	Sigma	H3375	室温保存
HSP70 抗体	Proteintech	10995-1-AP	兔（宿主物种）
LDH-A 抗体	Santa Cruz Biotechnology	SC27230	山羊（宿主物种）
氯化镁	ChemCruz	sc-255260A	室温保存
苹果酸	Sigma	P1645	室温保存
微孔板分光光度计	BMG LABTECH GmbH	POLARstar OMEGA S/N 415-0292	室温保存
Milli-Q 水	Millipore 系统	F7HA17757A	超纯水
mtTFA 抗体	Santa Cruz Biotechnology	SC23588	山羊（宿主物种）
Na+/K+-ATPase α1 抗体	Novus Biologicals	NB300-14755	小鼠（宿主物种）
寡霉素	Sigma	O4876	-20 °C 保存
棕榈酰-L-肉碱	Sigma	P1645	-20 °C 保存
PBS 片剂	Sigma	P4417-100TAB	1x 溶液，室温保存
磷酸二氢钾	ChemCruz	sc-203211	室温保存
氢氧化钾	Sigma	60377	室温保存
丙酮酸	Sigma	107360	4 °C 保存
鱼藤酮	Sigma	R8875	-20 °C 保存
Seahorse XF24 线粒体通量分析仪	Agilent Technologies	420179	XFe24 型号
Seahorse XFe24 FluxPak 微型试剂盒	Agilent Technologies	102342-100	试剂盒包含探针卡、微孔板和校准液
琥珀酸	Sigma	S7626	室温保存
蔗糖	Sigma	S9378	室温保存
TIMM23 抗体	Abcam	ab230253	兔（宿主物种）
TMPD	Sigma	T7394	-20 °C 保存
TOMM20 抗体	Abcam	ab56783	小鼠（宿主物种）
VDAC 抗体	Abcam	ab15895	兔（宿主物种）