使用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针和流式细胞术定量穆勒胶质细胞中的活性氧物种

摘要

本文提出了一种系统化、易于操作且可重复的实验方案，用于通过2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针（DCFH-DA）检测穆勒胶质细胞（MGCs）中的细胞内活性氧（ROS）。该方法利用流式细胞仪对细胞内总活性氧水平进行定量分析。本方案操作简便，适用性强，且具有良好的可重复性。

摘要

氧化还原平衡在维持细胞稳态中具有重要作用。活性氧（ROS）的过量生成可导致蛋白质、脂质和DNA的修饰，最终可能引起细胞功能改变及细胞死亡。因此，细胞通过激活抗氧化通路（如Keap1/Nrf2通路）或增强氧化还原清除剂（如维生素A、C和E、β-胡萝卜素以及多酚类等）来提升抗氧化防御能力，以应对有害刺激，这对细胞是有益的。炎症和氧化应激参与了多种视网膜病变（如糖尿病视网膜病变（DR）和早产儿视网膜病变（ROP））的发生和发展过程。由于穆勒胶质细胞（MGCs）在神经视网膜组织稳态中发挥关键作用，因此被认为是研究这些细胞保护机制的理想模型。在此背景下，采用一种可重复且简便的方法定量检测ROS水平，对于评估参与细胞抗氧化防御机制的通路或分子的作用至关重要。本文详细描述了在MGCs中使用DCFH-DA探针结合流式细胞术检测ROS所需的操作步骤，并提供了利用软件进行流式细胞术数据分析的关键步骤，使读者能够测量ROS水平（FITC的几何均值）并分析荧光强度直方图。这些工具不仅有助于评估细胞受到损伤后ROS水平的升高情况，还可用于研究某些分子对细胞可能提供的保护作用及其抗氧化效应。

引言

神经视网膜是一种结构高度有序的组织，具有明确分层的神经元层。在这些层次中，神经元（包括节细胞、无长突细胞、双极细胞、水平细胞和光感受器细胞）相互连接，同时也与穆勒胶质细胞（MGCs）和星形胶质细胞相连接，从而实现有效的光信号转导和视觉信息处理^1,2。已知MGCs在维持视网膜稳态中发挥重要作用，因为它们贯穿整个视网膜切面，能够与所有类型的细胞相互作用，调节多种保护性过程。研究表明，MGCs对视网膜神经元的维持和存活具有多种重要功能，包括通过糖酵解为神经元提供能量、清除神经元代谢废物、回收神经递质以及释放神经营养因子等^3,4,5。

另一方面，炎症、氧化应激和亚硝基化应激参与了多种人类疾病（包括视网膜病变）的发病机制和进展过程^{6,7,8,9,10,11}。细胞内的氧化还原平衡依赖于对活性氧（ROS）水平的严格调控。在生理条件下，ROS主要作为有氧呼吸的副产物持续生成。ROS家族的主要成员包括活性自由基，如超氧阴离子（O_2͘͘͘͘^•−）、羟基自由基（^•OH）、各种过氧化物（ROOR′）、氢过氧化物（ROOH），以及非自由基形式的过氧化氢（H₂O₂）^12,13。近年来的研究表明，ROS在细胞中通过调控关键生物学过程发挥重要的信号传导作用。Müller胶质细胞（MGCs）可通过激活转录因子核因子E2相关因子2（Nrf2），继而表达抗氧化蛋白，从而在病理条件下清除过量产生的ROS，形成强大的抗氧化防御系统^14,15,16。当细胞因ROS过度生成或清除能力缺陷而失去氧化还原平衡时，氧化应激的累积会导致蛋白质、脂质和DNA发生有害修饰，进而引发细胞应激或细胞死亡。增强视网膜抗氧化防御系统的功能有助于改善并预防早产儿视网膜病变（ROP）和视网膜脱离（RD）等视网膜疾病^{17,18,19,20,21,22,23,24}。因此，实时检测ROS的生成是一种强大且实用的研究工具。

检测细胞内活性氧（ROS）生成或氧化应激的方法有多种。其中，2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针是直接定量细胞氧化还原状态最常用的技术之一^25,26,27,28。该探针具有脂溶性且无荧光。探针可扩散穿过细胞膜，并被细胞内酯酶在两个酯键处水解，生成相对极性较强且不能透过细胞膜的产物——2′,7′-二氯荧光素（H₂DCF）。该无荧光分子在细胞内蓄积，随后被活性氧氧化，生成高度荧光的产物DCF。探针的氧化反应由多种活性氧共同作用所致（如过氧亚硝酸盐、羟基自由基、一氧化氮或过氧化物），其荧光信号可通过流式细胞术或共聚焦显微镜检测（发射波长530 nm，激发波长485 nm）。该技术的局限性在于，超氧阴离子和过氧化氢与H₂DCF的反应较弱^25,29。本文中，我们采用DCFH-DA探针结合流式细胞术来检测和定量ROS。为此，在加载荧光探针前，我们使用ROS诱导剂A或B刺激MGCs以诱导ROS产生。此外，我们还使用了一种抗氧化化合物。最后，我们展示了采用本方案获得的代表性且可靠的数据。

方案

注意：缓冲液成分见表1。

1. 细胞培养准备

注意：此处描述的是MIO-M1细胞的培养制备方法，MIO-M1是一种自发永生化的人类穆勒胶质细胞系（Moorfield's/Institute of Ophthalmology-Müller 1）。操作时务必采用规范的无菌技术，并在层流罩内进行。

1. 配制 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）完全培养基。在含有 4.5 g/L D-葡萄糖和 110 mg/L 丙酮酸钠的 DMEM 中，加入 10% 灭活胎牛血清（FBS）、10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、2 mM L-谷氨酰胺和 50 U/mL 青霉素/链霉素。在 MIO-M1 细胞解冻当天新鲜配制该培养基。
2. 第1天，将冻存的MIO-M1细胞解冻。
   1. 为此，取出含有 5 x 10⁵ 从液氮中取出含10% DMSO的FBS保存的MIO-M1细胞，立即放入37 °C水浴中。
      注意：由于储存于液氮中的冻存管在解冻时存在爆炸风险，操作时务必佩戴口罩或护目镜。
   2. 将MIO-M1细胞迅速解冻（少于1分钟），即将冻存管置于37 °C水浴中温育，直至管内仅剩少量冰晶。
   3. 用70%乙醇擦拭小瓶外表面，并将其转移至超净工作台。
   4. 将解冻的细胞从冻存管转移至无菌15 mL离心管中，然后逐滴加入6 mL预热的完全DMEM培养基。
   5. 将细胞悬液在约 600 x g 离心5分钟。离心后可见清晰的上清液和完整的沉淀。用移液器弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
   6. 轻轻重悬沉淀，将细胞悬浮于10 mL完全DMEM培养基中。将该细胞悬液转移至直径100 mm的组织培养皿中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育约2天。₂.
3. 当MIO-M1细胞在第4天达到80%-90%融合度时，执行以下步骤。
   1. 将培养板从培养箱转移至超净工作台。小心吸除上清液，用5 mL无菌预热的PBS洗涤2次，吸除PBS。
   2. 加入1 mL 0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C的CO₂培养箱中孵育₂ 孵育 3-5 分钟以解离细胞。
   3. 加入7 mL完全DMEM培养基以终止胰蛋白酶作用。用移液器（P1000）缓慢吹打使消化后的MGC细胞团分散，将细胞悬液收集至15 mL离心管中。
   4. 以 600 x g 离心 g 5 分钟后弃去上清液。用 2 mL 完全 DMEM 培养基轻轻重悬细胞沉淀。取 1 mL 该细胞悬液加入含有 9 mL 预热完全 DMEM 培养基的 100 mm 培养皿中。
   5. 用另一块100 mm培养皿重复上述操作。将培养皿置于37 °C、5% CO₂条件下孵育约1天。₂ 培养箱
4. 当两个培养板的细胞融合度达到80%–90%时（第6天），将培养板转移至超净工作台。按照步骤1.3操作，获得细胞沉淀。
5. 轻轻重悬沉淀，并将细胞用5 mL完全DMEM培养基重新悬浮。使用血细胞计数板（Neubauer计数室）和台盼蓝溶液，按以下步骤对MIO-M1细胞进行计数。
   1. 将玻璃盖片盖在血细胞计数板（Neubauer chamber）中央区域。将计数板置于平坦表面（如桌面或实验台）。
   2. 将台盼蓝染液与细胞悬液等体积混合。例如，取60 µL台盼蓝与60 µL细胞混合，实现1:2稀释。
   3. 从该混合液中，用微量移液器吸取10 µL加入血细胞计数板（Neubauer chamber）。
   4. 将加样后的血细胞计数板置于显微镜载物台上，打开光源并调节亮度。
   5. 将显微镜载物台移动至最佳位置，并调节焦距，直至获得清晰的细胞图像。
   6. 计数血细胞计数板四个角的方格内（每个方格进一步分为16个小格）的细胞数量（体积：0.1 mm³）³ 每个）
   7. 使用以下公式计算细胞浓度。
      浓度 = （细胞数量 × 10,000）/ 计数方格数
      浓度 = （细胞数量 × 10,000）/ 4
      浓度 = 细胞数量 × 2500
      注意：如果进行了细胞稀释，则应将测得的浓度换算为稀释前的原始浓度。
      ​浓度 =（细胞数量 × 2500 × 2）=（细胞数量 × 5000 个细胞/毫升）
   8. 将细胞悬液调整至 1 x 10⁵ 个/mL 的完全 DMEM 培养基中，取 2 mL 该细胞悬液接种于 6 孔板中（2 × 10⁵ 细胞/孔）。轻轻摇动培养板，使细胞均匀分布。将6孔板在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。₂ 培养箱

2. 检测条件与对照

1. 每次实验均需设置以下实验对照：
   1. 自发荧光对照（不加 DCFH-DA 探针的细胞，用于设定流式细胞仪 参数）。
   2. 基础对照（未刺激的细胞）。
   3. 阳性对照（用 ROS 诱导剂 A 或 B 处理的细胞）。
   4. 阴性对照（用抗氧化化合物处理的细胞）。
   5. 样本组（同时用抗氧化化合物和 ROS 诱导剂 A 或 B 处理的细胞）。

3. 实施检测

注意：该检测在第7天进行。除非另有说明，操作时务必采用适当的无菌技术，并在层流罩内进行。

1. 准备低血清DMEM培养基。在含有4.5 g/L D-葡萄糖和110 mg/L丙酮酸钠的DMEM中添加0.5%热灭活FBS、10 mM HEPES、2 mM L-谷氨酰胺和50 U/mL青霉素/链霉素。在MIO-M1细胞处理当天新鲜配制该培养基。
2. 将6孔板（60%-70%融合度）从培养箱转移至超净工作台。吸除上清液，并用PBS洗涤细胞1次。每孔加入2 mL低血清DMEM，于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 h。此步骤用于饥饿细胞。
3. 血清饥饿处理后，用抗氧化化合物处理细胞6 h。
   1. 吸除上清液，向以下各组加入2 mL稀释后的储备液：阴性对照组（仅用抗氧化化合物处理的细胞）和样品组（用抗氧化化合物与ROS诱导剂A或B共同处理的细胞）。
   2. 将6孔板于37 °C、5% CO₂条件下孵育6 h。
      注：若使用其他抗氧化化合物或ROS抑制剂，需标准化刺激的最佳时间和浓度。
4. 孵育6 h后，用ROS诱导剂A或B处理细胞30 min。
   1. 向以下各组加入刺激物：阳性对照组（仅用ROS诱导剂A或B处理的细胞）和样品孔（用抗氧化化合物与ROS诱导剂A或B共同处理的细胞）。
      注：储备液需保持在冰上。
   2. 将6孔板于37 °C、5% CO₂条件下孵育30 min。
      注：若使用其他ROS诱导剂，应正确标准化刺激的最佳时间和浓度。
5. 用DCFH-DA探针负载细胞。
   1. 吸除上清液，并用PBS将6孔板中的细胞洗涤3次，以彻底去除所有刺激物。
   2. 关闭超净工作台的照明，在避光条件下操作。在15 mL离心管中，将5 mM DCFH-DA储备液按1:1000比例稀释，使用不含酚红的DMEM配制终浓度为5 µM的DCFH-DA工作液。
   3. 轻轻涡旋混匀，然后向以下各孔各加入1 mL该溶液：基础对照组（未刺激细胞）、阳性对照组（用ROS诱导剂处理的细胞）、阴性对照组（用抗氧化化合物处理的细胞）以及样品孔（用抗氧化化合物与ROS诱导剂A或B共同处理的细胞）。
   4. 向自发荧光对照组细胞中加入1 mL不含酚红的DMEM。
   5. 将6孔板于37 °C、5% CO₂条件下孵育30 min。
      ​注：该探针对光敏感。所有未使用的探针溶液应弃去。

4. 流式细胞术的细胞准备

1. 6 小时后，将培养板置于冰上。从这一步开始，无需再使用无菌技术，也不必在超净工作台内操作。
2. 每孔用 2 mL 冷 PBS 洗涤细胞 3 次。每孔加入 0.5 mL 冷解离缓冲液。使用 P1000 移液器轻轻吹打，收集细胞。
3. 将细胞收集至已标记的 1.5 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 600 × g 离心 5 分钟。
   注意：收集细胞时，将 P1000 移液器调至 0.4 mL，以避免产生气泡。从这一步开始，操作需迅速。
4. 离心结束后，将装有细胞的已标记 1.5 mL 离心管置于冰上。小心弃去上清液，并通过轻弹管壁轻轻分散细胞沉淀。
5. 每根已标记的 1.5 mL 离心管中加入 1 mL FACS 缓冲液以洗涤细胞。如有必要，使用涡旋振荡器以最低强度充分分散细胞沉淀。在 4 °C 条件下以 600 × g 离心 5 分钟。重复上述步骤 2 次（共洗涤 3 次）。
6. 最后一次洗涤结束后，为所有实验条件（见步骤 2）标记 5 mL 圆底 聚苯乙烯管（流式细胞术专用管）。
7. 离心结束后，将细胞沉淀重悬于 200 µL FACS 缓冲液中。使用涡旋振荡器轻轻分散每根 1.5 mL 离心管中的沉淀，然后转移至已标记的 5 mL 圆底管中。将管子置于冰上，直至在流式细胞仪上进行分析。

5. 在流式细胞仪中进行数据采集

1. 使用流式细胞仪软件创建新实验。具体操作为，在菜单栏中选择 实验 并点击 新实验 （Ctrl+E）
2. 此外，在菜单栏中，转到 查看 并点击以下选项： 工具栏, 状态栏, 浏览器, 流式细胞仪, 检查员, 工作表, 采集仪表板 和 双指数编辑器 在工作区中查看这些窗口。
3. 在软件左侧，单击 样本_001 . 这将打开一个试管列表（Tube_001、Tube_002 等）。为对照组和不同实验条件的试管标记标签，请双击 Tube_001, Tube_002等，并重命名它们（参见步骤2）。
4. 选择第一个管中要分析的通道/参数（FSC、SSC、FITC 和 APC 或其他任何荧光染料）以查看象限 细胞仪设置 实验的。
5. 点击 当前移液管指示器 图标以选择试管，图标将变为绿色。放置 "自发荧光对照" 将试管置于吸液臂上，小心地仅向左移动底座。
   1. 运行 "自发荧光对照" 样本，转到采集仪表板窗口并点击 获取数据. 打开一个点图，横轴为 FSC，纵轴为 SSC。
   2. 快速调整前向散射和侧向散射电压，以确保事件出现在图中。在采集仪表板窗口中点击 停止采集本实验中使用的电压设置如下：FSC - 200 V，SSC - 423 V。
6. 为设定FITC电压，运行 "阳性对照（经活性氧诱导剂A或B处理的细胞）"调节电压，使所有事件均显示在FITC的直方图上。本实验中使用280 V电压。在采集仪表板窗口中，点击 停止采集.
7. 再次放置 "自发荧光对照" 吸液臂上的管子。在采集仪表板窗口中，单击 获取数据，然后 记录数据，并选择所需的终止条件（例如，50,000 个事件）。在目标细胞周围绘制门控，排除死细胞和碎片。
   注意：这些事件比主要细胞群小得多，在图中位于左下角。
8. 当采集结束后，从吸液臂上取下管子。设备将自动进行自清洗。在采集控制面板窗口中，点击 下一管 并运行 基础对照（未刺激细胞）. 点击 获取数据 然后 记录数据.
   1. 从初始门控（排除死细胞和碎片的门控）开始，创建另一个点图，以FITC为横轴、APC为纵轴。绘制象限门并调整坐标，以显示FITC与APC点图中左下象限的事件。
9. 记录下一个样本时，取出试管并点击 下一个试管 > 获取数据 > 记录数据.
   注意：此处使用的流式细胞仪（参见 材料表) 最多记录 1 × 10⁶ 每管事件数
10. 当所有试管的记录结束后，将数据导出至D盘。操作方法为点击 文件 > 导出 > FCS 文件 > 选择 3.0 或 3.1 版本.
    注意：尽管使用一种软件进行数据采集（参见 材料表本方案中详细描述了相关操作，但也可使用其他流式细胞术软件。可通过设置相同的采集参数（FSC、SSC 和 FITC）来获得结果。

6. 所获数据的分析

1. 打开软件，使用任务栏或导航栏中的 添加样本 操作按钮添加样本。
   1. 点击 添加样本。
   2. 使用文件浏览器，导航至实验文件夹。
   3. 选择实验文件夹，然后点击 选择。
      注意：样本文件将作为"所有样本"组的一部分加载到工作区中。
2. 在工作区中双击第一个样本：自发荧光对照。
   注意：此操作将打开一个图形窗口，以正向散射（FSC-A，横轴）对侧向散射（SSC-A，纵轴）参数绘制事件分布图。
3. 绘制多边形门以分离目标细胞，排除死细胞和碎片。
   1. 点击 多边形门 工具。
   2. 在图上点击以构建多边形门，边数可根据需要设定。
   3. 在最后一个点处双击以闭合多边形，创建所需的门。
   4. 为该门命名，例如"MIO-M1 细胞"，然后点击 确定。
      ​注意：将出现一个新的图形窗口，仅显示 MIO-M1 事件，不含死细胞和碎片。
   5. 对所有待分析样本重复此操作。
4. 将图形更改为直方图。为此，请点击 X 轴参数标签 并选择 FITC-A；点击 Y 轴参数标签 并选择 直方图。这会将图形更改为一维直方图。
5. 使用 添加统计窗口 添加统计信息。
   1. 在直方图下方，点击 添加统计。程序将打开一个新的统计窗口。
   2. 在新窗口左侧选择统计类型 几何均值。
   3. 选择 群体 MIO-M1 细胞。
   4. 从可用参数列表中选择 FITC-C。
   5. 点击 添加 按钮以将其应用于分析。
      注意：这将在样本门控树中创建新的统计项"几何均值：FITC"，其数值将在工作区中显示。
6. 将这些几何均值导入统计软件中进行分析。
7. 点击 L 图标 以打开布局编辑器；该图标位于工作区的 菜单选项卡 中。将工作区窗口与布局编辑器并排显示。
   注意：布局编辑器是一个独立的工作区窗口，包含用于在简单图形报告中显示多个图形和统计信息的工具。该报告可导出为所需的文件格式，如 PDF 或 JPG 等。
   1. 从工作区窗口中某个样本的门控树中，将 MIO-M1 细胞群体 拖拽至布局编辑器中。
   2. 确保在布局编辑器中显示包含门内事件的直方图。附加的基本信息将在下方的文本框中详细列出。
   3. 将所有样本拖入以在同一图形中进行比较，程序将自动叠加显示。
   4. 右键点击直方图并选择 属性。程序将打开一个新的图形定义窗口，该窗口包含四个选项卡（注释、字体、图例和指定）。点击 指定 选项卡，并将纵轴从“自动”更改为“众数”。点击 应用。
   5. 右键点击样本，更改颜色、线型、线宽等，以个性化图形显示。
   6. 要导出图像，请点击文件选项卡，然后立即在文档栏中选择 保存图像。选择所需的图像文件类型（例如 PDF）。
      注意：将弹出保存对话框，提示您选择保存位置。点击 保存。
8. 将分析结果保存为工作区 (.wsp) 文件。
   1. 在左上角，点击 流式细胞分析 图标并选择 另存为。
   2. 选择 保存为工作区 (WSP)，以保存包含数据和分析结果的文档。
   3. 为工作区文件输入名称。
   4. 点击 保存。

结果

如方案部分所述，我们展示了具有代表性的定量数据，通过荧光探针DCFH-DA检测经ROS诱导剂A或B刺激的MIO-M1细胞中活性氧（ROS）的产生。结果表明，未刺激细胞的FITC荧光强度高于自发荧光水平（图1A，比较“基础对照”与“自发荧光对照”，散点图）。这归因于MIO-M1细胞存在基础水平的ROS生成（图1B，比较“基础对照”与“自发荧光对照”，直方图）。

有趣的是，当细胞经活性氧诱导剂A或B刺激后，观察到FITC荧光显著增强（图1B，比较“ROS inducer A”样本与“basal control”以及“ROS inducer B”样本与“basal control”，柱状图）。此外，当细胞在使用活性氧诱导剂A或B之前预先用抗氧化化合物处理，荧光水平降低至接近基础水平（图1B，分别比较“ROS inducer A”与“pretreatme...

讨论

多种病理状况（如癌症、炎症性疾病、缺血/再灌注损伤、缺血性心脏病、糖尿病和视网膜病变）以及衰老等生理状态均可导致活性氧（ROS）的过度产生^{6,7,8,9,10,11}。因此，检测、测定并理解参与调控ROS的通路，已成为多种疾病研究的重要目标。使用探针（如DCFH-DA）来测定ROS水平的方法在科学文献中已有广泛描述，且易于实施并被普遍接受^26,27,28。本文中，我们介绍一种详细且可重复的实验方案，用于通过流式细胞术在MGCs中检测和定量ROS水平。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2′,7′DCFH-DA	Sigma	35845-1G
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）	Gibco（隶属于 Life Technologies）	15630-080
BD FACSCanto II 流式细胞仪	BD 生物科学	FACSCanto
BD FACSDiva 软件	BD 生物科学
细胞培养皿 100×20 mm	细胞星-格瑞纳生物一线	664 160
离心	赛默飞世尔科技	Sorvall legend micro 17 R
离心管（15 ml）	BIOFIL	CFT011150
离心管（50 ml）	BIOFIL	CFT011500
冻存管	CRYO.S - Greiner Bio-One	126263
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	W387520-1KG
七水合磷酸氢二钠	默克	106575
不含酚红的DMEM	Gibco（隶属于 Life Technologies）	31053-028
杜尔贝科’s 改良的 Eagle’DMEM培养基	Gibco（生命技术公司）	11995065
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物	默克	324503
胎牛血清	Internegocios
FlowJo v10 软件	BD 生物科学
葡萄糖	默克	108337
血细胞计数板，Neubauer 计数室	BOECO，德国
层流罩	ESCO	AC2-6E8
L-谷氨酰胺（GlutaMAX）	Gibco（隶属于 Life Technologies）	A12860-01
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008
青霉素/链霉素	Gibco（隶属于 Life Technologies）	15140-122
氯化钾	默克	104936
磷酸二氢钾	默克	4878
5 ml 圆底聚苯乙烯管（流式细胞术管）	Falcon - Corning	BD-352008
叠氮化钠	默克	822335
氯化钠	默克	106404
氢氧化钠	默克	106462
SPINWIN 微型离心管 1.5 ml	塔尔森	500010-N
6 孔组织培养板	BIOFIL	TCP011006
台盼蓝	默克	111732
0.5% 胰蛋白酶-EDTA 10倍浓缩液	Gibco（隶属于 Life Technologies）	15400-054
涡旋混合器	Labnet International, Inc.