使用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针和流式细胞术定量穆勒胶质细胞中的活性氧物种

摘要

本文提出了一种系统化、易于操作且可重复的实验方案，用于通过2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针（DCFH-DA）检测穆勒胶质细胞（MGCs）中的细胞内活性氧（ROS）。该方法利用流式细胞仪对细胞内总活性氧水平进行定量分析。本方案操作简便，适用性强，且具有良好的可重复性。

摘要

氧化还原平衡在维持细胞稳态中具有重要作用。活性氧（ROS）的过量生成可导致蛋白质、脂质和DNA的修饰，最终可能引起细胞功能改变及细胞死亡。因此，细胞通过激活抗氧化通路（如Keap1/Nrf2通路）或增强氧化还原清除剂（如维生素A、C和E、β-胡萝卜素以及多酚类等）来提升抗氧化防御能力，以应对有害刺激，这对细胞是有益的。炎症和氧化应激参与了多种视网膜病变（如糖尿病视网膜病变（DR）和早产儿视网膜病变（ROP））的发生和发展过程。由于穆勒胶质细胞（MGCs）在神经视网膜组织稳态中发挥关键作用，因此被认为是研究这些细胞保护机制的理想模型。在此背景下，采用一种可重复且简便的方法定量检测ROS水平，对于评估参与细胞抗氧化防御机制的通路或分子的作用至关重要。本文详细描述了在MGCs中使用DCFH-DA探针结合流式细胞术检测ROS所需的操作步骤，并提供了利用软件进行流式细胞术数据分析的关键步骤，使读者能够测量ROS水平（FITC的几何均值）并分析荧光强度直方图。这些工具不仅有助于评估细胞受到损伤后ROS水平的升高情况，还可用于研究某些分子对细胞可能提供的保护作用及其抗氧化效应。

引言

神经视网膜是一种结构高度有序的组织，具有明确分层的神经元层。在这些层次中，神经元（包括节细胞、无长突细胞、双极细胞、水平细胞和光感受器细胞）相互连接，同时也与穆勒胶质细胞（MGCs）和星形胶质细胞相连接，从而实现有效的光信号转导和视觉信息处理^1,2。已知MGCs在维持视网膜稳态中发挥重要作用，因为它们贯穿整个视网膜切面，能够与所有类型的细胞相互作用，调节多种保护性过程。研究表明，MGCs对视网膜神经元的维持和存活具有多种重要功能，包括通过糖酵解为神经元提供能量、清除神经元代谢废物、回收神经递质以及释放神经营养因子等^3,4,5。

另一方面，炎症、氧化应激和亚硝基化应激参与了多种人类疾病（包括视网膜病变）的发病机制和进展过程^{6,7,8,9,10,<....}

方案

注意：缓冲液成分见表1。

1. 细胞培养准备

注意：此处描述的是MIO-M1细胞的培养制备方法，MIO-M1是一种自发永生化的人类穆勒胶质细胞系（Moorfield's/Institute of Ophthalmology-Müller 1）。操作时务必采用规范的无菌技术，并在层流罩内进行。

1. 配制 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）完全培养基。在含有 4.5 g/L D-葡萄糖和 110 mg/L 丙酮酸钠的 DMEM 中，加入 10% 灭活胎牛血清（FBS）、10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、2 mM L-谷氨酰胺和 50 U/mL 青霉素/链霉素。在 MIO-M1 细胞解冻当天新鲜配制该培养基。
2. 第1天，将冻存的MIO-M1细胞解冻。
   1. 为此，取出含有 5 x 10⁵ 从液氮中取出含10% DMSO的FBS保存的MIO-M1细胞，立即放入37 °C水浴中。
      注意：由于储存于液氮中的冻存管在解冻时存在爆炸风险，操作时务必佩戴口罩或护目镜。
   2. 将MIO-M1细胞迅速解冻（少于1分钟），即将冻存管置于37 °C水浴中温育，直至管内仅剩少量冰晶。
   3. 用70%乙醇擦拭小瓶....

结果

如实验方案部分所述，我们展示了具有代表性的定量数据，通过荧光探针 DCFH-DA 检测经 ROS 诱导剂 A 或 B 刺激的 MIO-M1 细胞中活性氧（ROS）生成的流式细胞术结果。图 1A 显示，在未刺激细胞中，FITC 荧光信号高于自发荧光水平（比较“基础对照”与“自发荧光对照”，散点图）。这归因于 MIO-M1 细胞存在基础水平的 ROS 生成。图 1B 进一步证实了该现象（比较“基础对照”与“自发荧光对照”，直方图）。

有趣的是，当细胞经活性氧诱导剂A或B刺激后，观察到FITC荧光显著增强图1B，比较“ROS诱导剂A”样本与“基础对照”以及“ROS诱导剂B”样本与“基础对照”，直方图）。此外，在用抗氧化化合物预处理细胞后再给予ROS诱导剂A或B，荧光水平降低至接近基础水平图1B，比较“ROS诱导剂A”与“抗氧化化合物预处理6 h + R.......

讨论

多种病理状况（如癌症、炎症性疾病、缺血/再灌注损伤、缺血性心脏病、糖尿病和视网膜病变）以及衰老等生理状态均可导致活性氧（ROS）的过度产生^{6,7,8,9,10,11}。因此，检测、测定并理解参与调控ROS的通路，已成为多种疾病研究的重要目标。使用探针（如DCFH-DA）来测定ROS水平的方法在科学文献中已有广泛描述，且易于实施并被普遍接受^26,27,28。本文中，我们介绍一种详细且可重复的实验方案，用于通过流式细胞术在MGCs中检测和定量ROS水平。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2′,7′DCFH-DA	Sigma	35845-1G
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）	Gibco（隶属于 Life Technologies）	15630-080
BD FACSCanto II 流式细胞仪	BD 生物科学	FACSCanto
BD FACSDiva 软件	BD 生物科学
细胞培养皿 100×20 mm	细胞星-格瑞纳生物一线	664 160
离心	赛默飞世尔科技	Sorvall legend micro 17 R
离心管（15 ml）	BIOFIL	CFT011150
离心管（50 ml）	BIOFIL	CFT011500
冻存管	CRYO.S - Greiner Bio-One	126263
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	W387520-1KG
七水合磷酸氢二钠	默克	106575
不含酚红的DMEM	Gibco（隶属于 Life Technologies）	31053-028
杜尔贝科’s 改良的 Eagle’DMEM培养基	Gibco（生命技术公司）	11995065
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物	默克	324503
胎牛血清	Internegocios
FlowJo v10 软件	BD 生物科学
葡萄糖	默克	108337
血细胞计数板，Neubauer 计数室	BOECO，德国
层流罩	ESCO	AC2-6E8
L-谷氨酰胺（GlutaMAX）	Gibco（隶属于 Life Technologies）	A12860-01
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008
青霉素/链霉素	Gibco（隶属于 Life Technologies）	15140-122
氯化钾	默克	104936
磷酸二氢钾	默克	4878
5 ml 圆底聚苯乙烯管（流式细胞术管）	Falcon - Corning	BD-352008
叠氮化钠	默克	822335
氯化钠	默克	106404
氢氧化钠	默克	106462
SPINWIN 微型离心管 1.5 ml	塔尔森	500010-N
6 孔组织培养板	BIOFIL	TCP011006
台盼蓝	默克	111732
0.5% 胰蛋白酶-EDTA 10倍浓缩液	Gibco（隶属于 Life Technologies）	15400-054
涡旋混合器	Labnet International, Inc.