方法文章

使用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针和流式细胞术定量穆勒胶质细胞中的活性氧物种

DOI：

10.3791/63337

⸱

2022年5月13日

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, 2Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra (INIMEC), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

本文内容

摘要

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本文提出了一种系统化、易于操作且可重复的实验方案，用于通过2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针（DCFH-DA）检测穆勒胶质细胞（MGCs）中的细胞内活性氧（ROS）。该方法利用流式细胞仪对细胞内总活性氧水平进行定量分析。本方案操作简便，适用性强，且具有良好的可重复性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

氧化还原平衡在维持细胞稳态中具有重要作用。活性氧（ROS）的过量生成可导致蛋白质、脂质和DNA的修饰，最终可能引起细胞功能改变及细胞死亡。因此，细胞通过激活抗氧化通路（如Keap1/Nrf2通路）或增强抗氧化清除物质（如维生素A、C和E，β-胡萝卜素以及多酚类等）来提升抗氧化防御能力，以应对有害刺激，这对细胞是有益的。炎症和氧化应激参与了多种视网膜病变（如糖尿病视网膜病变（DR）和早产儿视网膜病变（ROP））的发生和发展过程。由于穆勒胶质细胞（MGCs）在神经视网膜组织稳态中发挥关键作用，因此被认为是研究这些细胞保护机制的理想模型。在此背景下，采用一种可重复且简便的方法定量检测ROS水平，对于评估参与细胞抗氧化防御机制的通路或分子的作用至关重要。本文详细描述了在MGCs中使用DCFH-DA探针结合流式细胞术检测ROS所需的操作步骤，并提供了利用软件进行流式细胞术数据分析的关键步骤，使读者能够测量ROS水平（FITC的几何均值）并分析荧光强度直方图。这些工具不仅有助于评估细胞受到损伤后ROS水平的升高情况，还可用于研究某些分子可能对细胞提供的抗氧化保护效应。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经视网膜是一种高度有序的组织，具有明确分层的神经元结构。在这些层次中，神经元（包括节细胞、无长突细胞、双极细胞、水平细胞和光感受器细胞）相互连接，同时也与穆勒胶质细胞（MGCs）和星形胶质细胞相连接，从而实现有效的光信号转导和视觉信息处理1,2。已知穆勒胶质细胞在维持视网膜稳态中发挥重要作用，因为它们贯穿整个视网膜各层，能够与所有类型的细胞相互作用，调节多种保护性过程。研究表明，穆勒胶质细胞对视网膜神经元的维持和存活具有多种重要功能，包括通过糖酵解为神经元提供能量、清除神经元代谢废物、神经递质的再循环以及释放神经营养因子等3,4,5。

另一方面，炎症、氧化应激和亚硝基化应激参与了多种人类疾病（包括视网膜病变）的发生和发展6,7,8,9,10,11。细胞内的氧化还原平衡依赖于对活性氧（ROS）水平的严格调控。在生理条件下，ROS主要作为有氧呼吸的副产物持续生成。ROS家族的主要成员包括活性自由基，如超氧阴离子（O2͘͘͘͘•−）、羟基自由基（•OH）、各类过氧化物（ROOR′）、氢过氧化物（ROOH），以及非自由基形式的过氧化氢（H2O2）12,13。近年来的研究表明，ROS在细胞内通过调控关键生物学过程发挥重要的信号传导作用。Müller胶质细胞（MGCs）可通过激活转录因子核因子E2相关因子2（Nrf2），继而表达抗氧化蛋白，从而在病理条件下清除过量产生的ROS，形成强大的抗氧化防御系统14,15,16。当细胞因ROS过度生成或清除能力缺陷而失去氧化还原平衡时，氧化应激的累积会导致蛋白质、脂质和DNA发生有害修饰，进而引发细胞应激或细胞死亡。增强视网膜抗氧化防御系统有助于改善并预防早产儿视网膜病变（ROP）和视网膜脱离（RD）等视网膜疾病17,18,19,20,21,22,23,24。因此，实时检测ROS的生成是一种强大且实用的工具。

检测细胞内活性氧（ROS）生成或氧化应激的方法有多种。其中，2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针是直接定量细胞氧化还原状态最常用的技术之一25,26,27,28。该探针具有脂溶性且无荧光。探针可扩散穿过细胞膜，并被细胞内酯酶在两个酯键处水解，生成一种极性较高且不能透过细胞膜的产物——2′,7′-二氯荧光素（H2DCF）。这种无荧光的分子在细胞内积累，随后被活性氧氧化，生成高度荧光的产物DCF。该探针的氧化反应由多种活性氧共同作用所致（如过氧亚硝酸盐、羟基自由基、一氧化氮或过氧化物），其荧光信号可通过流式细胞术或共聚焦显微镜检测（发射波长530 nm，激发波长485 nm）。该技术的局限性在于，超氧阴离子和过氧化氢与H2DCF的反应较弱25,29。本文中，我们采用DCFH-DA探针结合流式细胞术来检测和定量ROS。为此，在加载荧光探针前，我们使用ROS诱导剂A或B刺激MGCs以诱导ROS的产生。此外，我们还使用了一种抗氧化化合物。最后，我们展示了采用该实验方案获得的代表性且可靠的数据。

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方案

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注意：缓冲液成分见表1。

1. 细胞培养准备

注意：此处描述的是MIO-M1细胞的培养制备，MIO-M1是一种自发永生化的人类穆勒胶质细胞系（Moorfield's/Institute of Ophthalmology-Müller 1）。操作时务必采用规范的无菌技术，并在层流罩内进行。

  1. 配制 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）完全培养基。在含有 4.5 g/L D-葡萄糖和 110 mg/L 丙酮酸钠的 DMEM 培养基中，加入 10% 灭活胎牛血清（FBS）、10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、2 mM L-谷氨酰胺和 50 U/mL 青霉素/链霉素。在 MIO-M1 细胞解冻当天新鲜配制该培养基。
  2. 第1天，解冻冻存的MIO-M1细胞。
    1. 为此，取出含有 5 x 105 从液氮中取出含10% DMSO的FBS保存的MIO-M1细胞，立即放入37 °C水浴中。
      注意：由于储存于液氮中的冻存管在解冻时存在爆炸风险，操作时务必佩戴口罩或护目镜。
    2. 将MIO-M1细胞冻存管置于37 °C水浴中快速解冻（不到1分钟），直至管内仅剩少量冰晶。
    3. 用70%乙醇擦拭小瓶外表面，并将其转移至超净工作台。
    4. 将解冻的细胞从冻存管转移至无菌的15 mL离心管中，然后逐滴加入6 mL预热的完全DMEM培养基。
    5. 将细胞悬液在约 600 x g 离心5分钟。离心后可见清晰的上清液和完整的沉淀。用移液器弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
    6. 轻轻重悬沉淀，并将细胞重悬于10 mL完全DMEM培养基中。将该细胞悬液转移至直径100 mm的组织培养皿中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育约2天2.
  3. 当MIO-M1细胞在第4天达到80%–90%融合度时，执行以下步骤。
    1. 将培养板从培养箱转移至超净工作台。小心吸除上清液，用5 mL无菌预热的PBS洗涤2次，吸除PBS。
    2. 加入1 mL 0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C在CO₂培养箱中孵育2 孵育 3-5 分钟以解离细胞。
    3. 加入7 mL完全DMEM培养基以终止胰蛋白酶作用。用移液器（P1000）缓慢吹打使消化后的MGC细胞团分散，将细胞悬液收集至15 mL离心管中。
    4. 以 600 x g 离心 g 5 分钟后弃去上清液。将细胞沉淀轻轻重悬于 2 mL 完全 DMEM 培养基中。取 1 mL 该细胞悬液加入含有 9 mL 预热完全 DMEM 培养基的 100 mm 培养皿中。
    5. 用另一块100 mm培养皿重复上述操作。将培养皿置于37 °C、5% CO₂条件下孵育约1天。2 培养箱
  4. 当两个培养板的细胞融合度达到80%–90%时（第6天），将培养板转移至超净工作台。按照步骤1.3操作，获得细胞沉淀。
  5. 轻轻重悬沉淀，将细胞悬浮于5 mL完全DMEM培养基中。使用血细胞计数板（Neubauer板）和台盼蓝溶液，按以下步骤对MIO-M1细胞进行计数。
    1. 将玻璃盖片盖在血细胞计数板（Neubauer chamber）中央区域。将计数板置于平坦表面（如桌面或实验台）。
    2. 将台盼蓝染液与细胞悬液等体积混合。例如，取60 µL台盼蓝染液与60 µL细胞悬液混合，得到1:2的稀释比例。
    3. 从该混合液中，用微量移液器吸取10 µL加入血细胞计数板（Neubauer chamber）。
    4. 将加样后的血细胞计数板置于显微镜载物台上，打开光源并调节亮度。
    5. 将显微镜载物台移动至最佳位置，并调节焦距，直至获得清晰的细胞图像。
    6. 计数血细胞计数板四个角的方格内（每个方格进一步分为16个小格）的细胞数量（体积：0.1 mm³）3 每个）
    7. 使用以下公式计算细胞浓度。
      浓度 = （细胞数量 × 10,000）/ 计数方格数
      浓度 =（细胞数量 × 10,000）/ 4
      浓度 = 细胞数量 × 2500
      注意：如果进行了细胞稀释，则应将测得的浓度换算为稀释前的原始浓度。
      ​浓度 =（细胞数量 × 2500 × 2）=（细胞数量 × 5000 个细胞/毫升）
    8. 将细胞悬液调整至 1 x 105 细胞/mL，加入2 mL完全DMEM培养基，将2 mL该细胞悬液接种于6孔板中（2 × 105 细胞/孔）。轻轻摇动培养板，使细胞均匀分布。将6孔板在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。2 培养箱

2. 检测条件与对照

  1. 每次实验均需设置以下实验对照：
    1. 自发荧光对照（不加 DCFH-DA 探针的细胞，用于设定流式细胞仪 参数）。
    2. 基础对照（未刺激的细胞）。
    3. 阳性对照（用活性氧诱导剂 A 或 B 处理的细胞）。
    4. 阴性对照（用抗氧化化合物处理的细胞）。
    5. 样品组（同时用抗氧化化合物和活性氧诱导剂 A 或 B 处理的细胞）。

3. 实施检测

注意：该检测在第7天进行。除非另有说明，操作时务必采用规范的无菌技术，并在层流罩内进行。

  1. 配制低血清DMEM培养基。在含有4.5 g/L D-葡萄糖和110 mg/L丙酮酸钠的DMEM中添加0.5%热灭活FBS、10 mM HEPES、2 mM L-谷氨酰胺和50 U/mL青霉素/链霉素。在MIO-M1细胞处理当天新鲜配制该培养基。
  2. 将6孔板（60%-70%融合度）从培养箱转移至超净工作台。吸除上清液，并用PBS洗涤细胞1次。每孔加入2 mL低血清DMEM，于37 °C、5% CO2条件下孵育2 h。此步骤用于饥饿细胞。
  3. 血清饥饿处理后，用抗氧化化合物处理细胞6 h。
    1. 吸除上清液，向以下各组加入2 mL稀释后的储备液：阴性对照组（仅用抗氧化化合物处理的细胞）和样品组（用抗氧化化合物与ROS诱导剂A或B共同处理的细胞）。
    2. 将6孔板于37 °C、5% CO2条件下孵育6 h。
      注：若使用其他抗氧化化合物或ROS抑制剂，需标准化刺激的最佳时间和浓度。
  4. 孵育6 h后，用ROS诱导剂A或B处理细胞30 min。
    1. 向以下各组加入刺激物：阳性对照组（仅用ROS诱导剂A或B处理的细胞）和样品孔（用抗氧化化合物与ROS诱导剂A或B共同处理的细胞）。
      注：储备液需保持在冰上。
    2. 将6孔板于37 °C、5% CO2条件下孵育30 min。
      注：若使用其他ROS诱导剂，应正确标准化刺激的最佳时间和浓度。
  5. 用DCFH-DA探针负载细胞。
    1. 吸除上清液，并用PBS将6孔板中的细胞洗涤3次，以彻底去除所有刺激物。
    2. 关闭超净工作台的照明，在避光条件下操作。在15 mL离心管中，将5 mM DCFH-DA储备液按1:1000比例稀释，使用不含酚红的DMEM配制终浓度为5 µM的DCFH-DA工作液。
    3. 轻轻涡旋混匀，然后向以下各孔每孔加入1 mL该溶液：基础对照组（未刺激细胞）、阳性对照组（用ROS诱导剂处理的细胞）、阴性对照组（用抗氧化化合物处理的细胞）以及样品孔（用抗氧化化合物与ROS诱导剂A或B共同处理的细胞）。
    4. 向自发荧光对照组细胞中加入1 mL不含酚红的DMEM。
    5. 将6孔板于37 °C、5% CO2条件下孵育30 min。
      ​注：该探针对光敏感。所有未使用的探针溶液应弃去。

4. 流式细胞术的细胞准备

  1. 6 小时后，将培养板置于冰上。从这一步开始，无需再使用无菌技术，也不必在超净工作台内操作。
  2. 用每孔 2 mL 冷的 PBS 洗涤细胞 3 次。向每孔加入 0.5 mL 冷的消化缓冲液。使用 P1000 移液器轻轻吹打，使细胞脱离。
  3. 将细胞收集至已标记的 1.5 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 600 × g 离心 5 分钟。
    注意：收集细胞时，将 P1000 移液器调至 0.4 mL，以避免产生气泡。从这一步开始，操作需迅速。
  4. 离心结束后，将装有细胞的已标记 1.5 mL 离心管置于冰上。小心弃去上清液，并通过轻弹管壁轻轻分散细胞沉淀。
  5. 向每个已标记的 1.5 mL 离心管中加入 1 mL FACS 缓冲液以洗涤细胞。如有必要，使用最低转速的涡旋振荡器使细胞沉淀完全分散。在 4 °C 条件下以 600 × g 离心 5 分钟。重复上述步骤 2 次（共洗涤 3 次）。
  6. 最后一次洗涤结束后，为所有实验条件（见步骤 2）标记 5 mL 圆底 聚苯乙烯管（流式细胞术专用管）。
  7. 离心结束后，将细胞沉淀重悬于 200 µL FACS 缓冲液中。使用涡旋振荡器轻轻分散每个 1.5 mL 离心管中的沉淀，然后转移至已标记的 5 mL 圆底管中。将管子置于冰上，直至在流式细胞仪上进行分析。

5. 在流式细胞仪中进行数据采集

  1. 使用流式细胞术软件创建新实验。具体操作为：在菜单栏中选择 实验，然后点击 新建实验（Ctrl+E）。
  2. 同样在菜单栏中，选择 视图，然后依次点击以下选项：工具栏、状态栏、浏览器、流式细胞仪、检查器、工作表、采集仪表板 和 双指数编辑器，以便在工作区中显示这些窗口。
  3. 在软件左侧点击 Specimen_001，将展开一个试管列表（Tube_001、Tube_002 等）。为对照组和不同实验条件的试管命名，请双击 Tube_001、Tube_002 等，并重命名（参见步骤 2）。
  4. 在实验的 流式细胞仪设置 中，为第一个试管选择需要分析的通道/参数（FSC、SSC、FITC 和 APC，或用于观察象限图的其他荧光染料）。
  5. 点击 当前试管指针 图标以选中试管，图标将变为绿色。将 "自发荧光对照" 试管放置于进样臂上，仅小心地向左移动试管底部。
    1. 运行 "自发荧光对照" 样本时，进入采集仪表板窗口并点击 采集数据。创建一个FSC（横轴）对SSC（纵轴）的散点图。
    2. 快速调整前向散射和侧向散射电压，以确保事件出现在图中。在采集仪表板窗口中点击 停止采集。本实验中使用的电压设置如下：FSC - 200 V，SSC - 423 V。
  6. 为设定FITC电压，运行 "阳性对照（经ROS诱导剂A或B处理的细胞）"。调整电压，使所有事件均显示在FITC直方图上。本实验中使用280 V电压。在采集仪表板窗口中点击 停止采集。
  7. 再次将 "自发荧光对照" 试管放置于进样臂上。在采集仪表板窗口中点击 采集数据，然后点击 记录数据，并选择所需的停止条件（例如，50,000 个事件）。围绕目标细胞绘制门控，排除死细胞和碎片。
    注：死细胞和碎片的事件尺寸明显小于主细胞群，通常出现在图的左下区域。
  8. 采集结束后，将试管从进样臂上取下。仪器将自动清洗。在采集仪表板窗口中点击 下一试管，然后运行 基础对照（未刺激细胞）。点击 采集数据，然后点击 记录数据。
    1. 基于初始门控（排除死细胞和碎片的门控），创建一个FITC（横轴）对APC（纵轴）的散点图。绘制象限门控并调整坐标，使事件显示在FITC对APC图的左下象限。
  9. 为记录后续样本，取下试管并点击 下一试管 > 采集数据 > 记录数据。
    注：本实验所用的流式细胞仪（见 材料表）每管最多可记录 1 × 106 个事件。
  10. 当所有试管记录完成后，将数据导出至D盘。具体操作为：点击 文件 > 导出 > FCS文件 > 选择3.0或3.1版本。
    注：尽管本方案详细描述了使用某一软件（见 材料表）进行数据采集的过程，但也可使用其他流式细胞术软件。采集参数（FSC、SSC 和 FITC）可按相同方式设置以获得相应结果。

6. 所获数据的分析

  1. 打开软件，使用位于任务栏或“Navigate”工具带中的 添加样本（Add Samples） 操作按钮添加样本；
    1. 点击 添加样本（Add Samples）。
    2. 使用文件浏览器，导航至“Experimental”文件夹。
    3. 选择“Experimental”文件夹，然后点击 选择（Choose）。
      注：样本文件将作为 "所有样本（All Samples）" 组的一部分加载到工作区中。
  2. 在工作区中双击第一个样本：自发荧光对照（Autofluorescence Control）。
    注：此操作将打开一个图形窗口，以正向散射（FSC-A，横轴）与侧向散射（SSC-A，纵轴）参数绘制细胞事件分布图。
  3. 绘制多边形门控以分离目标细胞，排除死细胞和碎片。
    1. 点击 多边形门控（Polygon Gate） 工具。
    2. 在图中点击以构建多边形门控，边数可根据需要设定。
    3. 在最后一个点双击以闭合多边形，生成所需的门控。
    4. 为门控命名，例如 "MIO-M1 细胞（MIO-M1 cells）"，然后点击 确定（OK）。
      ​注：将出现一个新的图形窗口，仅显示无死细胞和碎片的 MIO-M1 细胞事件。
    5. 对所有待分析样本重复此操作。
  4. 将图形更改为直方图。点击 X 轴参数标签 并选择 FITC-A；点击 Y 轴参数标签 并选择 直方图（Histogram）。此操作将图形更改为一维直方图。
  5. 使用 添加统计量窗口（Add Statistic Window） 添加统计信息。
    1. 在直方图下方点击 添加统计量（Add Statistics），程序将打开一个新的统计窗口。
    2. 在新窗口左侧选择统计类型 几何均值（Geometric Mean）。
    3. 选择 群体 MIO-M1 细胞（Population MIO-M 1 cells）。
    4. 从可用参数列表中选择 FITC-C（FIT-C）。
    5. 点击 添加（Add） 按钮以应用至分析。
      注：将在样本门控树中创建新的统计量 "几何均值：FITC（geometric mean: FITC）"，其数值将在工作区中显示。
  6. 将这些几何均值导入统计软件中进行进一步分析。
  7. 点击 L 图标 以打开布局编辑器（Layout Editor）；该图标位于工作区的 菜单选项卡（Menu tab） 中。将工作区窗口与布局编辑器并排显示。
    注：布局编辑器是一个独立的工作区窗口，可用于以简单的图形报告形式展示多个图形和统计结果。该报告可导出为所需的文件格式，如 PDF 或 JPG 等。
    1. 从工作区窗口中某个样本的门控树中，将 MIO-M1 细胞群体（MIO-M 1 cells population） 拖拽至布局编辑器中。
    2. 确保在布局编辑器中显示包含门内事件的直方图。附加的基本信息将在下方的文本框中列出。
    3. 将所有样本拖入以在同一图形中进行比较，程序将自动叠加显示。
    4. 右键点击直方图并选择 属性（Properties），程序将打开一个新的“图形定义”窗口。该窗口包含四个选项卡（注释、字体、图例和指定）。点击 指定（Specify） 选项卡，将 y 轴从“自动（Auto）”更改为“众数（Modal）”，然后点击 应用（Apply）。
    5. 右键点击样本，调整颜色、线型、线宽等参数以自定义图形。
    6. 导出图像时，点击“文件”选项卡，随后在“文档”工具带中选择 保存图像（Save Image），并选择所需的图像格式（例如 PDF）。
      注：将弹出保存对话框，提示选择保存位置。点击 保存（Save）。
  8. 将分析结果保存为工作区文件（.wsp）。
    1. 在左上角点击 流式细胞分析（Cytometry Analysis） 图标，并选择 另存为（Save As）。
    2. 选择 保存为工作区（Save as Workspace）（WSP）以保存包含数据和分析结果的文档。
    3. 为工作区文件输入名称。
    4. 点击 保存（Save）。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

如方案部分所述，我们展示了具有代表性的定量数据，通过荧光探针DCFH-DA检测经ROS诱导剂A或B刺激的MIO-M1细胞中活性氧（ROS）的产生。结果表明，未刺激细胞的FITC荧光强度高于自发荧光水平（图1A，比较“基础对照”与“自发荧光对照”，散点图）。这归因于MIO-M1细胞存在基础水平的ROS生成（图1B，比较“基础对照”与“自发荧光对照”，直方图）。

有趣的是，当细胞经活性氧诱导剂A或B刺激后，观察到FITC荧光显著增强（图1B，比较“ROS inducer A”样本与“basal control”以及“ROS inducer B”样本与“basal control”，柱状图）。此外，当细胞在使用活性氧诱导剂A或B之前预先用抗氧化化合物处理，荧光水平降低至接近基础水平（图1B，分别比较“ROS inducer A”与“pretreatme...

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讨论

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多种病理状态（如癌症、炎症性疾病、缺血/再灌注损伤、缺血性心脏病、糖尿病和视网膜病变）以及生理过程（如衰老）均可导致活性氧（ROS）的过度产生6,7,8,9,10,11。因此，检测、测定并理解参与调控ROS的信号通路，已成为多种疾病研究中的重要目标。利用探针检测ROS水平（如DCFH-DA）的方法在科学文献中已有广泛描述，且易于实施并被普遍接受26,27,28。本文中，我们介绍一种详细且可重复的实验方案，用于通过流式细胞术在MGCs中检测和定量ROS水平。

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The authors would like to thank María Pilar Crespo and Paula Alejandra Abadie of CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) for assistance in flow cytometry and Gabriela Furlan and Noelia Maldonado for cell culture assistance. We also thank Victor Diaz (Pro-Secretary of Institutional Communication of FCQ) for the video production and editing.

This article was funded by grants from Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), and Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (all to M.C.S.).

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2′,7′-DCFH-DA西格玛35845-1G
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES)生命技术公司吉博科15630-080
BD FACSCanto II 流式细胞仪BD 生物科学FACSCanto
BD FACSDiva 软件BD 生物科学
细胞培养皿 100×20 mmCell Star- Greiner Bio-One664 160
离心机赛默飞Sorvall legend micro 17 R
离心管 (15 ml)BIOFILCFT011150
离心管 (50 ml)BIOFILCFT011500
冻存管CRYO.S - Greiner Bio-One126263
二甲基亚砜西格玛-奥德里奇W387520-1KG
磷酸氢二钠七水合物默克106575
无酚红 DMEM 培养基生命技术公司吉博科31053-028
Dulbecco’s 改良伊格尔’s 培养基 (DMEM)生命技术公司吉博科11995065
乙二胺四乙酸 (EDTA) 二钠盐二水合物默克324503
胎牛血清Internegocios
FlowJo v10 软件BD 生物科学
葡萄糖默克108337
血细胞计数板，Neubauer 计数室BOECO，德国
层流罩ESCOAC2-6E8
L-谷氨酰胺 (GlutaMAX)生命技术公司吉博科A12860-01
MitoSOX 红英伟特根 M36008
青霉素/链霉素生命技术公司吉博科15140-122
氯化钾默克104936
磷酸二氢钾默克4878
5 ml 圆底聚苯乙烯管（流式细胞术管）Falcon - CorningBD-352008
叠氮化钠默克822335
氯化钠默克106404
氢氧化钠默克106462
SPINWIN 微量离心管 1.5 mlTarson500010-N
6 孔组织培养板BIOFILTCP011006
台盼蓝默克111732
胰蛋白酶-EDTA 0.5% 10X生命技术公司吉博科15400-054
涡旋混合器Labnet International, Inc.

参考文献

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