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方法文章

吸附性生物工艺提高黑色素产率 Pseudomonas stutzeri

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DOI：

10.3791/63339

⸱

2022年1月12日

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, National Institute of Technology, 2Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology

本文内容

摘要

本文介绍一种用于生产生物产品的吸附性生物工艺，特别是生产一种会抑制自身生物合成并抑制产生该色素的微生物生长的色素。

摘要

黑色素是一类天然色素，其分子结构中含有吲哚环和多种功能基团，因此在紫外线防护剂、护肤产品、化妆品等多个领域具有广泛应用前景。Pseudomonas stutzeri 是一种海洋细菌，能够在不添加酪氨酸的条件下产生黑色素。在产黑色素的海洋细菌 Pseudomonas stutzeri 的培养过程中，观察到黑色素对自身产生的反馈抑制作用。此外，黑色素还表现出对微生物生长的抑制效应。基于 Han-Levenspiel 模型的分析表明，黑色素对细胞生长具有非竞争性产物抑制作用。能够催化黑色素生成的酪氨酸酶，其活性亦受到黑色素的抑制。通过在不同浓度黑色素存在下绘制酶促反应的双倒数图，证实了该酶反应中存在非竞争性产物抑制。为此，开发了一种基于吸附剂的吸附型生物工艺，以减轻黑色素引起的反馈抑制。通过筛选多种吸附剂，选出了最适合吸附黑色素的材料，并对吸附剂用量和作用时间进行了优化，最终建立了高效的吸附型生物工艺。该工艺使海洋细菌 Pseudomonas stutzeri 的黑色素产量在未添加酪氨酸和酵母提取物的条件下提升了 8.8 倍，从 153 mg/L 提高至 1349 mg/L。

引言

黑色素是一类以吲哚环为单体单元的多酚类化合物。黑色素负责植物、动物和微生物中大多数黑色、棕色和灰色的着色1。最常见的黑色素是真黑色素，这是一种在脊椎动物和无脊椎动物中广泛分布的深棕色或黑色色素2。头足类动物、植物和微生物是黑色素的主要来源3。与来自头足类动物和植物的黑色素相比，微生物来源的黑色素具有多种优势：微生物生长速度快，且不会受到季节变化的影响；此外，它们能够根据所提供的培养基和操作条件进行自我调整。综合考虑这些因素，微生物来源被开发为主要的黑色素来源，具有潜在的商业应用价值4,5,6。Guo 等人利用重组的 Streptomyces kathirae SC-1，在优化的培养基中实现了高达 28.8 g/L 的黑色素产量7。Lagunas-Muñoz 等人在重组 E. coli 中获得了约 6 g/L 的黑色素8。Wang 等人通过培养基优化，获得了约 4.2 g/L 的可溶性黑色素9。研究人员还探索了海洋微生物培养物生产黑色素的可能性。Kiran 等人从海洋假单胞菌（Pseudomonas）物种中成功生产出黑色素10。Kumar 等人从海洋海藻中分离出 Pseudomonas stutzeri HMGM-7，该菌株可在营养肉汤中产生黑色素。然而，所有已报道的黑色素生产菌株均需要在培养基中添加补充物，如酵母提取物和/或蛋白胨，这可能限制生物工艺的放大。Raman 等人研究了 Aspergillus fumigatus AFGRD105 生产黑色素的能力，该菌株无需昂贵的添加剂即可产黑色素11。

一种从海藻中分离得到的海洋细菌——Pseudomonas stutzeri，被选用于黑色素的生产。该微生物在生产可溶性黑色素时无需额外添加酪氨酸和酵母提取物，且可在以海水为基础的培养基中生长，从而减少了对饮用水资源的依赖并降低了培养基成本。Thaira 等人在先前的研究中报道了一项优化的生物工艺，利用椰子粕作为原料，通过该海洋细菌生产黑色素纳米颜料12。所生产的黑色素被用于高效去除合成地下水中重金属。然而，在培养基优化过程中，发现黑色素可能对菌体生长和产物形成存在反馈抑制作用。因此，在本实验方案中，采用广义的 Han-Levenspiel 模型对黑色素的反馈抑制效应进行研究与量化。同时，开发了一种简单且高效的吸附性生物工艺方案，以最大程度地减轻反馈抑制的影响。

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方案

1. 培养与维持Pseudomonas stutzeri菌种。

  1. 从昌迪加尔微生物保藏中心（MTCC Chandigarh）获取细菌 Pseudomonas stutzeri（以冻干安瓿瓶形式提供）。
    1. 用70%酒精对安瓿瓶表面进行消毒。在安瓿瓶中部附近做标记，并在标记处折断。
      注意：开启安瓿瓶时需格外小心，因为瓶内为真空状态。折断安瓿瓶时应采取预防措施，快速开启可能导致棉塞被吸入瓶内，而仓促开启则可能使微生物的冻干细粉释放到空气中。
    2. 用灭菌镊子小心取出棉塞，向安瓿瓶中加入0.3 mL的LB（Luria Bertani）液体培养基，静置30分钟。
    3. 取100 µL菌液接种至装有10 mL LB液体培养基的100 mL三角瓶中，置于37 °C、180 rpm的摇床中培养。同时，将100 µL菌液接种到固体LB琼脂平板上，涂布以获得单菌落。在37 °C下培养过夜。
  2. 待菌种培养生长后，于4 °C保存。
  3. 每隔4周进行一次传代培养：挑取单菌落划线接种至新鲜的LB琼脂平板上，于37 °C培养过夜，使菌落生长。

2. 黑色素对生长和酶活性的抑制研究

  1. 在人工海水中加入51.4 g/L葡萄糖、49.8 g/L椰子粕粉、0.09 g/L CuSO4、0.03 g/L FeSO4 和 0.05 g/L MgSO4，配制培养基（材料表）。所有实验均在250 mL摇瓶中进行，装液量为15 mL，转速200 rpm，温度37 °C，初始pH为7。
  2. 在生物过程开始时，向每种培养基中添加不同浓度的黑色素（100 mg/L、200 mg/L、500 mg/L 和 1000 mg/L）。
  3. 在生物过程的不同时间点，测定各添加黑色素浓度下的比生长速率、细胞酶活性以及黑色素含量（第3.2节）。

3. 建模黑色素抑制动力学

  1. 使用 Han 和 Levenspiel 提出的以下通用方程13对黑色素生成的抑制动力学进行建模，
    微生物生长方程；公式；数学模型；生物过程；发酵分析 (1)
    其中，
    µ = 表观比生长速率 (1/h)
    µmax = 最大比生长速率 (1/h)
    p = 产物浓度 (g/L)
    p *= 生长停止时的关键产物浓度 (g/L)
    s = 底物浓度 (g/L)
    m,n = 参数
    上述方程可重写为：
    微生物生长速率方程；符号；用于教育和研究；动力学模型分析 (2)
    其中，
    细菌生长速率方程：μobs=μmax(1−p/p*)^n；用于微生物动力学研究 (3)
    和 静态平衡方程，K_obs = K_s(1-p/p*)^m，适用于科学研究中的数据分析 (4)
    上述方程可重新整理为 1/µ 对 1/s 的双倒数图，如下所示：
    酶动力学方程；速度与浓度的倒数；公式分析 (5)
  2. 利用不同比生长速率和底物浓度的数据，根据上述方程绘制一条直线。Y 轴和 X 轴上的截距分别给出 μmax 和 Ks，可将其代入方程 3 和方程 4，分别求得 µobs 和 Kobs。
    方程 (3) 可写为：
    对数形式的微生物生长方程，用于科学分析中计算观察生长速率的公式 (6)
  3. 计算在步骤 2.2 中培养的菌体的比生长速率，并将其命名为 µobs。
  4. 将步骤 3.3 中获得的比生长速率值代入方程 (6)。将数据拟合为线性方程，并计算斜率和截距。
  5. 使用方程 (3) 计算无黑色素存在时的最大比生长速率。

4. 吸附生物工艺的开发

  1. 在250 mL摇瓶中进行所有实验，装液量为15 mL，转速200 rpm，温度37 °C，初始pH为7。
  2. 在5 L搅拌式生物反应器中进行最终优化的生物过程，装液量为3 L。在生物反应器研究中，维持培养物的pH在7–7.5之间，溶解氧保持在饱和度的50%–60%。

5. 从不同可选吸附剂中筛选最佳吸附剂

  1. 在含有培养液的不同烧瓶中加入不同的吸附剂，如氧化铝、沸石、硅藻土、漂白土和活性炭。
  2. 将每种吸附剂分别以 1 g/L 的浓度加入培养液中，并在 150 rpm 条件下置于旋转摇床中处理 12 小时。
  3. 在 5000 × g 条件下离心 10 分钟，分离吸附剂，然后使用分光光度计在 400 nm 处测定上清液的吸光度。
  4. 选择从培养液中吸附黑色素量最大的吸附剂。

6. 吸附剂给药时间的影响

  1. 启动生物过程，并加入对培养物中黑色素吸附效果最佳的吸附剂（在第5节后选定）。初始步骤选择的浓度为1 g/L。
  2. 根据先前发表的方案12测定黑色素的最大产量。
  3. 重复步骤6.1，在生物过程开始12小时后加入吸附剂，并在生物过程的不同时间点测定黑色素产量。
  4. 重复步骤6.3，分别在生物过程开始24小时、36小时和48小时后加入吸附剂。
  5. 比较每次生物过程运行中产生的黑色素量，确定实现最大黑色素产量和回收率的最佳加药时间。

7. 吸附剂用量的影响

  1. 在第6节确定的时间，向培养物中加入不同浓度的最佳吸附剂（0.5、1、2、4、6、8和10 g/L）。
  2. 在5000 × g 条件下离心10分钟，收获生物反应产物。
  3. 收集上清液，并通过测定400 nm处的吸光度计算黑色素含量。
  4. 用蒸馏水和乙醇分别洗涤含有吸附剂的沉淀两次，以去除附着在吸附剂上的细胞及其他化合物。每次洗涤均在5000 × g 条件下离心10分钟完成。
  5. 向洗涤后的吸附剂中加入0.1 M NaOH溶液，以解吸黑色素。
  6. 将混合物在5000 × g 条件下离心10分钟，并使用分光光度计在400 nm处测定上清液中的黑色素含量。
  7. 重复解吸过程三次，或直至吸附剂恢复至其原始颜色。
  8. 在磁力搅拌条件下，逐滴加入1 N HCl，将浓缩的解吸黑色素溶液pH值降低至3或更低，以沉淀黑色素。如有需要，将酸性溶液置于冰箱中保存1小时，以促进沉淀。
  9. 将所得沉淀的黑色素通过离心（5000 × g，10分钟）用蒸馏水洗涤三次，干燥后于4 °C保存。

8. 生物过程的数学建模

  1. 生物量生长动力学
    1. 使用以下针对产物抑制现象改进的Verhulset模型来量化生物量生长速率，该模型如下方程所示14,15,16,17,
      Logistic growth equation, \( \frac{dx}{dt} = \mu_{obs} \cdot x \cdot \left(\frac{x_m-x}{x_m}\right) \). (7)
      其中，
      x = 生物量浓度 (g/L)
      xm = 最大生物量浓度 (g/L)
      µobs = 最大比生长速率 (1/h)，由方程(2)给出
      Vazques 等人（2008年）进一步从方程(7)推导出以下用于生物量浓度的方程：
      Equation for dynamic equilibrium in statistical mechanics; mathematical formula analysis. (8)
      其中，
      vx = 生物量生长速率 (g/L/h) = µobs·x
      µobs       = 观测比生长速率 (1/h)
      τx = 延滞时间 (h)
      t = 时间 (h)
    2. 使用方程(8)计算生物过程中不同时间点的生物量浓度，并模拟Pseudomonas stutzeri的生长曲线。
  2. 底物消耗动力学
    注意：在生物过程中，底物用于生物量生长、产物形成以及维持代谢。
    1. 使用以下方程平衡生物过程中的底物利用：
      Equation for microbial growth; metabolic rate analysis; stoichiometric formula. (9)
      大部分葡萄糖用于生物量生成；因此，为简化起见，忽略产物形成所消耗的底物，可将方程(9)简化为：
      Bioreactor kinetics equation; symbolic formula for substrate conversion rate in culture process. (10)
      其中，
      S = 底物浓度 (g/L)
      YP/S = 产物得率系数，即黑色素得率系数 (g/g)
      P = 产物浓度 (g/L)，即黑色素浓度 (g/L)
      YX/S = 生物量得率系数 (g/g)
      ms = 维持系数 (g/g/h)
      将上述方程从时间 t = 0 积分至 t = t，并代入方程(8)中的x值，可得以下底物浓度变化方程17：
      Equation of dynamic system behavior, detailing mathematical model for process analysis. (11)
      其中，s0 = 初始底物浓度 (g/L)，x0 = 初始生物量浓度 (g/L)
    2. 使用方程(11)计算生物过程中不同时间间隔的底物浓度；或在已知底物浓度的情况下，使用该方程估算其中的参数。
  3. 黑色素生成动力学
    1. 使用Ludeking-Pirt方程模拟黑色素的生成。由于黑色素生成与生长相关，因此忽略非生长相关的产物生成项，简化后的方程可写为：
      Equation for motion analysis, dp/dt = α·dx/dt, physics concept, formula image. (12)
      其中，
      α = 与生长相关产物生成相关的Ludeking-Pirt常数 (g/g)
      将方程(12)从时间 t = 0 积分至 t = t，可得以下产物浓度变化方程：
      Linear elasticity equation: p = α · (x - x₀), mathematical formula, research and study analysis. (13)
    2. 使用方程(13)计算α。
  4. 动力学参数估计
    1. 使用任何合适的软件工具（例如 Microsoft Excel 求解器工具），通过非线性最小二乘法估计上述所有参数。
    2. 利用批次实验数据进行参数估计，并使用求解器工具最小化平方误差和（SSE），如以下方程所示：
      最小化，
      Sum of Squared Errors formula, SSE=Σ(x_sim-x_exp)^2, statistical error analysis equation. (14)
      其中，
      xsim = 模拟值，xexp = 实验值

9. 分析技术

  1. 黑色素提取
    1. 将培养物在5000 × g 条件下离心10分钟，以去除生物量。
    2. 向 supernatant 中加入等体积的1 M NaOH。
    3. 用1 N HCl将碱性上清液酸化至pH 2，使黑色素沉淀。
    4. 将酸化后的上清液在12000 × g 条件下离心20分钟，收集黑色素。
    5. 用5 mL蒸馏水洗涤收集的黑色素三次，在室温（RT）下干燥过夜，并于4 °C保存18。
  2. 黑色素定量
    1. 通过将适量黑色素溶解于人工海水中（pH 8），配制不同浓度的黑色素溶液（0–500 mg/L）。
    2. 使用分光光度计在400 nm处测定吸光度18。
    3. 利用上述数据绘制标准曲线。
    4. 将培养物在5000 × g 条件下离心10分钟以去除生物量，并在400 nm处测定上清液的吸光度。使用步骤9.2.3中制备的标准曲线计算培养物中的黑色素浓度。
  3. 酪氨酸酶活性测定
    1. 按照Ren等（2013）19 建立的酪氨酸酶活性测定方案，测定从 Pseudomonas stutzeri 培养液中提取的酪氨酸酶的酶活性。
    2. 将细菌培养物在5,000 × g 条件下离心，收集细胞。
    3. 在冰浴中用pH 6.5的100 mM磷酸缓冲液超声破碎细胞，然后将匀浆在9000 × g 条件下离心15分钟，收集上清液，即为酪氨酸酶来源。
    4. 将上一步获得的酶溶液0.2 mL加入含有1 mM L-酪氨酸（底物）的2.8 mL 0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 6.5）中。
    5. 通过在475 nm处测定吸光度，观察多巴色素的生成。
    6. 按如下方法计算酪氨酸酶活性。一个国际单位（IU）的酪氨酸酶活性定义为每分钟催化1 µmol L-酪氨酸氧化为多巴色素所需的酶量。使用多巴色素的摩尔消光系数（3600 L·M-1·cm-1）和以下公式进行计算：
      酶活性计算公式；基于吸光度的测定方程；酶学分析方法。 （15）
  4. 生物量测定
    1. 在生物安全柜中每隔4小时取样5 mL，保持无菌操作。取样前后对锥形瓶的棉塞进行火焰灭菌，以减少污染风险。测定所有样品在660 nm处的光密度（OD）。
      注：未接种的培养基作为空白对照。这些读数将用于研究微生物的生长情况。
    2. 将培养液在4 °C、5000 × g 条件下离心10分钟，收集细胞沉淀，并在60 °C的热风烘箱中干燥8小时，得到干细胞质量。
    3. 利用步骤9.4.1测得的OD值和步骤9.4.2获得的相应生物量绘制标准曲线。
    4. 使用标准曲线（OD = 0.82 × 生物量（g/L））通过测定任意时间点培养液的光密度来测定未知生物量。
  5. DNA含量测定
    1. 通过测定样品在260 nm处的光密度来估算DNA含量。
    2. 使用以下公式计算DNA含量：
      DNA定量公式：总DNA（µg）=（A260）×（50 µg/mL）×（稀释倍数）× 0.1 mL。 （16）
      其中，
      A260 = 260 nm处的吸光度
      0.1 = 样品体积（mL）
      1 = 浓度为50 µg/mL的DNA标准溶液在260 nm处的吸光度
  6. 蛋白质含量测定
    1. 使用Bradford蛋白质测定试剂盒（材料表）测定样品中的蛋白质含量。
    2. 向0.1 mL上清液中加入5 mL Bradford试剂，静置5分钟。上清液中的蛋白质与Bradford试剂反应生成有色复合物。
    3. 使用分光光度计在595 nm处测定吸光度20。
  7. 总还原糖（TRS）测定
    1. 采用二硝基水杨酸（DNS）法测定总还原糖21。
    2. 将1 g DNS溶于50 mL蒸馏水中配制DNS溶液。分批加入30 g酒石酸钠钾，直至溶液颜色变为乳黄色，再加入20 mL 2 N NaOH，使溶液变为透明的橙黄色。用蒸馏水定容至100 mL，并避光保存。
    3. 在容量瓶中将180 mg葡萄糖溶于100 mL蒸馏水中，配制0.01 M葡萄糖工作液。
    4. 分别移取0.2、0.4、0.6、0.8和1 mL葡萄糖标准溶液至5支不同的试管中。另设一支含1 mL蒸馏水的试管作为空白对照。
    5. 用蒸馏水将每支试管的体积补至2 mL。
    6. 向每支试管中加入1 mL DNS试剂，并用铝箔封口。
    7. 将试管置于沸水浴中加热5分钟，然后冷却至室温（RT）。
    8. 向每支试管中加入9 mL蒸馏水，充分混匀。使用分光光度计在575 nm处测定各管内容物的OD值。
    9. 利用以葡萄糖量为横坐标（X轴）、575 nm处吸光度（A575）为纵坐标（Y轴）绘制的标准曲线测定样品浓度。
  8. 粒径分析
    1. 使用超声波仪将生物合成的黑色素分散于1 mL蒸馏水中。
    2. 将分散后的样品溶液（1 mL）加入纳米颗粒分析仪中，按照仪器制造商的操作说明测定粒径。
  9. 透射电子显微镜（TEM）分析
    1. 将提取后获得的黑色素粉末在60 °C下干燥8小时。
    2. 将黑色素粉末装入TEM样品台，按照操作规程使用透射电子显微镜测定其尺寸。

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结果

图1A、B展示了不同初始黑色素浓度影响下的细胞生长和黑色素生成情况。随着初始黑色素浓度的增加，细胞生长和黑色素生成显著下降。当培养基中初始黑色素浓度为500 mg/L时，生物量和黑色素产量降至对照组最大值的约50%。当初始黑色素浓度达到1000 mg/L时，黑色素生成量极低。在1000 mg/L初始黑色素浓度下，生物量生长速率也显著降低。图1C显示了在不同初始黑色素浓度下，培养液中胞内酪氨酸酶的活性。如图所示，与对照组相比，当培养液中存在1000 mg/L初始黑色素浓度时，酪氨酸酶活性下降了4倍。这些结果明确表明，培养体系中较高的黑色素浓度会对酪氨酸酶活性及细胞生长产生不利影响。

有必要确定抑制类型，以便相应地找到解决方案。因此，采用 Han-Levenspiel 模型（方案第 3.1 节，公式 (3)）鉴定了黑色素对酪氨酸酶的反馈抑制作用。图 1D 定量描述了黑色素抑制...

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讨论

产物抑制是生物加工过程中的主要瓶颈，会导致生产效率降低。目前存在多种减轻产物抑制的方法，例如连续式生物工艺和原位产物移除技术。然而，这些方法通常需要对现有的生物加工设施进行彻底改造23,24,25,26,27,28。吸附式生物工艺则无需对现有设施进行大规模改造，易于实施。黑色素对酪氨酸酶表现出反馈抑制作用，同时抑制了恶臭假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）的生长。完全抑制该菌生长的黑色素临界浓度约为 1050 mg/L。从裂褶菌（Schizophyllum commune）中分离得到的胞外黑色素对皮肤癣菌，如小孢子菌（Trichophyton simii）和红色毛癣菌（...

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披露

作者不存在任何利益冲突

致谢

感谢印度科学技术部（DST/TSG/WP/2014/58）和卡纳塔克国家理工学院为本方案的开发提供资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
 氧化铝+A15A26A3:A13A3:A16A3:A17HiMediaGRM1909
活性炭HiMediaPCT1001
人工海水培养基HiMediaM1942
Bradford 试剂盒HiMediaML106
硅藻土HiMediaGRM226
离心机REMICM-8
离心管HiMediaPW1207
二硝基水杨酸HiMediaGRM1582
锥形瓶Borosil4980021
漂白土HiMediaGRM232
葡萄糖HiMediaMB037
HClHiMediaAS004
L-酪氨酸HiMediaRM069
Microsoft ExcelMicrosoft
纳米颗粒分析仪HORIBA ScientificNanopartica SZ-100
营养琼脂培养基HiMediaM001
培养皿HiMediaPW054
磷酸盐缓冲液HiMediaM1452
氢氧化钠HiMediaMB095
分光光度计ThermofisherGenesys 10
搅拌式生物反应器ScigenicsBioferm LS
TE 缓冲液HiMediaML060
透射电子显微镜JEOLJEM-2100
沸石HiMediaGRM3834

参考文献

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