分离大鼠脂肪组织间充质干细胞并诱导其分化为胰岛素生成细胞

摘要

脂肪组织来源的间充质干细胞（Ad-MSCs）可能是分化为胰岛素生成细胞（IPCs）的一种潜在MSC来源。在本方案中，我们提供了分离和鉴定大鼠附睾Ad-MSCs的详细步骤，随后采用一种简单、快速的方案，由相同的大鼠Ad-MSCs诱导生成IPCs。

摘要

间充质干细胞（MSCs）——尤其是从脂肪组织中分离得到的间充质干细胞（Ad-MSCs）——因其来源丰富、可再生，且不涉及伦理问题，已受到特别关注。然而，目前分离Ad-MSCs的方法尚未标准化，且通常采用需要特殊设备的复杂操作流程。我们采用一种简单且可重复的方法，从Sprague-Dawley大鼠的附睾脂肪组织中分离出Ad-MSCs。分离得到的Ad-MSCs通常在分离后3天内出现，表现为贴壁生长、具有成纤维细胞样形态的细胞。这些细胞在分离后1周内可达到80%的融合度。随后，在第3至第5代（P3-5）时，对分离的Ad-MSCs进行全面表征：通过免疫表型分析检测典型的MSC分化群（CD）表面标志物（如CD90、CD73和CD105），并诱导这些细胞向成骨、成脂和成软骨方向分化，从而验证其多向分化潜能。此外，我们通过一种简单且相对短程的诱导方案，将分离的Ad-MSCs诱导分化为胰岛素生成细胞（IPCs），该方案包括使用高糖Dulbecco改良Eagle培养基（HG-DMEM）、β-巯基乙醇、烟酰胺和艾塞那肽-4。对IPCs分化的评估首先在基因水平进行，包括检测特异性β细胞标志物（如MafA、NKX6.1、Pdx-1和Ins1）的表达水平，并对生成的IPCs进行二氮杂苯染色。其次，通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）实验进行功能评估。综上所述，Ad-MSCs易于分离，具备MSC的所有鉴定特征，并且确实可作为实验室中糖尿病研究所需的丰富且可再生的IPCs来源。

引言

间充质干细胞（MSCs），也称为间充质基质细胞，是再生医学中最常用的细胞类型之一^1,2。它们被归类为成体干细胞，具有多向分化潜能和自我更新能力³。MSCs 可从多种来源分离获得，包括脂肪组织、骨髓、外周血、脐带组织和脐血、毛囊以及牙齿^4,5。

从脂肪组织中分离干细胞因其易于获取和快速扩增而被认为具有吸引力和广阔前景 体外，且产量高⁶脂肪组织来源的间充质干细胞（Ad-MSCs）可从不同物种中分离获得，包括人类、牛、小鼠、大鼠，以及近年来的山羊。⁷已证实，脂肪源性间充质干细胞（Ad-MSCs）目前是组织工程和基因/细胞治疗的潜在候选材料，甚至可用于开发自体替代疗法，以实现软组织损伤或缺损的长期修复。^7,8.

国际细胞与基因治疗学会（ISCT）定义了间充质干细胞（MSCs）全面表征所必须满足的三个最低标准

方案

所有实验均按照批准的指南进行，所有操作均经埃及开罗英国大学（BUE）药学院伦理委员会批准。Ad-MSC分离方案参照Lopez和Spencer的方法并加以修改¹⁵。

1. 从大鼠附睾脂肪垫中分离脂肪间充质干细胞（Ad-MSCs）

1. 使用体重为250–300 g、年龄不超过1个月的雄性Sprague-Dawley大鼠（每次分离使用两只）。麻醉动物后，通过颈椎脱位法处死。用70%乙醇喷洒已处死的动物。剥离腹部下部的皮肤和肌肉，然后取出两个睾丸以暴露附睾脂肪垫。
2. 小心切割附睾脂肪垫，注意不要损伤血管。
3. 分离附睾周围脂肪组织，然后将其置于含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。
4. 在生物安全柜中，使用镊子和手术刀将这些脂肪垫切成小块。将切碎的脂肪组织转移至含有10 mL无菌PBS的50 mL离心管中。
5. 每次用10 mL PBS对剪碎的脂肪组织进行洗涤，共洗涤5次 ，以去除污染的血液。以下洗涤步骤必须仔细执行。
   1. 向组织中加入10 mL PBS，充分混匀45秒。然后将离心管直立静置5分钟，使组织依靠重力沉降并分层为两层。
   2. 使用10 mL注射器吸除下层液体（infranatant）中的PBS，并更换为新鲜的10 mL PBS进行下一次洗涤。

结果

脂肪间充质干细胞（Ad-MSCs）的分离与表征
如图2所示，从脂肪组织中分离出的细胞在分离后的第二天即呈现出由圆形细胞和成纤维细胞样细胞组成的异质性细胞群体（图2A）。分离后第4天，成纤维细胞样细胞数量和体积开始增加，并在第1代时形成均一的细胞群体（图2B、C）。这些细胞在传代至第3代期间持续表现为贴壁生长、形态类似成纤维细胞的细胞（图2D），符合间充质干细胞（MSCs）特性的第一个标准。这些Ad-MSCs表现出良好的体外培养特性，表明本实验方案是一种有效、简便且相对快速地从附睾脂肪垫中分离Ad-MSCs的方法。

下一步是对分离得到的Ad-MSCs进行表征。根据ISCT的标准，MSCs应满足三项标准：贴壁生长特性、表达间充质细胞标志物CD分子而不表达造血系标志物，以及具有.......

讨论

在本实验方案中，我们详细介绍了从大鼠附睾脂肪组织中分离脂肪间充质干细胞（Ad-MSCs）并将其诱导分化为胰岛样细胞团（IPCs）的具体步骤。事实上，大鼠附睾脂肪是一种易于获取的脂肪组织来源，可用于分离Ad-MSCs，且在组织采集和处理过程中无需特殊设备^15,26,27。所分离的Ad-MSCs具有良好的体外扩增能力，并符合间充质干细胞的所有鉴定标准。本研究所采用的方案此前已有报道，仅进行了轻微修改¹⁵，且已被证实有效且可重复。细胞自分离后第1天即呈现成纤维细胞样形态，并持续增殖，最终形成均一的细胞群体。有趣的是，我们使用相同的方案从人脂肪抽吸物中分离Ad-MSCs，获得了与大鼠组织相当的成功率（数据未显示）。该方法唯一的局限性在于采用了胶原酶化学消化法，与某些其他方案中使用的机械消化法相比存在差异²⁸。此外，该步骤也是一个关键环节，因为化学消化可能对细胞活力产.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白 V 组分	MP Biomedicals
阿利新蓝 8GX	Sigma-Aldrich, USA	A3157
茜素红 S	Sigma-Aldrich, USA	A5533
氢氧化铵	Fisher Scientific, Germany
大鼠 CD90 抗体，FITC 标记	Stem Cell Technologies	60024FI
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A3912
氯化钙	Fisher Scientific, Germany
CD105 单克隆抗体，FITC 标记	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA	MA1-19594
CD34 多克隆抗体	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA	PA5-85917
氯仿	Fisher Scientific, USA
I 型胶原酶，粉末	Gibco, Thermo Fisher, USA	17018029
无水 D-葡萄糖，特纯	Fisher Scientific, Germany	G/0450/53
二甲基亚砜 (DMSO)	Fisher Scientific, Germany	BP231-100
二硫腙染色液	Sigma-Aldrich, USA	D5130
DMEM - 高糖 4.5 g/L	Lonza, Switzerland	12-604F
DMEM - 低糖 1 g/L	Lonza, Switzerland	12-707F
DMEM/F12 培养基	Lonza, Switzerland	BE12-719F
无 DNA 酶/RNA 酶水	Gibco Thermo Fisher, USA	10977-035
绝对乙醇，分子生物学级	Sigma-Aldrich, Germany	24103
艾塞那肽-4 (Exendin-4)	Sigma-Aldrich, Germany	E7144
胎牛血清 (FBS)	Gibco Thermo Fisher, 巴西	10270-106
甲醛 37%	Fisher Scientific
盐酸 (HCl)	Fisher Scientific, Germany
异丙醇，分子生物学级	Fisher Scientific, USA	BP2618500
L-谷氨酰胺	Gibco Thermo Fisher, USA	25030-024
氯化镁（无水）	Fisher Scientific, Germany
间充质干细胞功能鉴定试剂盒	R&D systems Inc., MN, USA	SC006
烟酰胺	Sigma-Aldrich, Germany	N0636
油红 O 染色液	Sigma-Aldrich, USA	O0625
青霉素-链霉素-两性霉素	Gibco Thermo Fisher, USA	15240062
磷酸盐缓冲液 (PBS)，1X，不含 Ca/Mg	Lonza, Switzerland	BE17-516F
氯化钾	Fisher Scientific, Germany
大鼠胰岛素 ELISA 试剂盒	Cloud-Clone Corp., USA	CEA682Ra
碳酸氢钠	Fisher Scientific, Germany
氯化钠	Fisher Scientific, Germany
磷酸氢二钠（无水）	Fisher Scientific, Germany
磷酸二氢钠（无水）	Fisher Scientific, Germany
SYBR Green Maxima	Thermo Scientific, USA	K0221
注射器滤器，0.2 微米	Corning, USA	431224
TRIzol	Thermo Scientific, USA	15596026
台盼蓝	Gibco Thermo Fisher, USA	15250061
胰蛋白酶-Versene-EDTA，1X	Lonza, Switzerland	CC-5012
Verso cDNA 合成试剂盒	Thermo Scientific, USA	AB-1453/A
β-巯基乙醇	Sigma-Aldrich, Germany	M3148