脂肪组织来源的间充质干细胞(Ad-MSCs)可能是分化为胰岛素生成细胞(IPCs)的一种潜在MSC来源。在本方案中,我们提供了分离和鉴定大鼠附睾Ad-MSCs的详细步骤,随后采用一种简单、快速的方案,由相同的大鼠Ad-MSCs诱导生成IPCs。
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脂肪组织来源的间充质干细胞(Ad-MSCs)可能是分化为胰岛素生成细胞(IPCs)的一种潜在MSC来源。在本方案中,我们提供了分离和鉴定大鼠附睾Ad-MSCs的详细步骤,随后采用一种简单、快速的方案,由相同的大鼠Ad-MSCs诱导生成IPCs。
间充质干细胞(MSCs)——尤其是从脂肪组织中分离得到的间充质干细胞(Ad-MSCs)——因其来源丰富、可再生,且不涉及伦理问题,已受到特别关注。然而,目前分离Ad-MSCs的方法尚未标准化,且通常采用需要特殊设备的复杂操作流程。我们采用一种简单且可重复的方法,从Sprague-Dawley大鼠的附睾脂肪组织中分离出Ad-MSCs。分离得到的Ad-MSCs通常在分离后3天内出现,表现为贴壁生长、具有成纤维细胞样形态的细胞。这些细胞在分离后1周内可达到80%的融合度。随后,在第3至第5代(P3-5)时,对分离的Ad-MSCs进行全面表征:通过免疫表型分析检测典型的MSC分化群(CD)表面标志物(如CD90、CD73和CD105),并诱导这些细胞向成骨、成脂和成软骨方向分化,从而验证其多向分化潜能。此外,我们通过一种简单且相对短程的诱导方案,将分离的Ad-MSCs诱导分化为胰岛素生成细胞(IPCs),该方案包括使用高糖Dulbecco改良Eagle培养基(HG-DMEM)、β-巯基乙醇、烟酰胺和艾塞那肽-4。对IPCs分化的评估首先在基因水平进行,包括检测特异性β细胞标志物(如MafA、NKX6.1、Pdx-1和Ins1)的表达水平,并对生成的IPCs进行二氮杂苯染色。其次,通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)实验进行功能评估。综上所述,Ad-MSCs易于分离,具备MSC的所有鉴定特征,并且确实可作为实验室中糖尿病研究所需的丰富且可再生的IPCs来源。
间充质干细胞(MSCs),也称为间充质基质细胞,是再生医学中最常用的细胞类型之一1,2。它们被归类为成体干细胞,具有多向分化潜能和自我更新能力3。MSCs 可从多种来源分离获得,包括脂肪组织、骨髓、外周血、脐带组织和脐血、毛囊以及牙齿4,5。
从脂肪组织中分离干细胞因其易于获取和快速扩增而被认为具有吸引力和广阔前景 体外,且产量高6脂肪组织来源的间充质干细胞(Ad-MSCs)可从不同物种中分离获得,包括人类、牛、小鼠、大鼠,以及近年来的山羊。7已证实,脂肪源性间充质干细胞(Ad-MSCs)目前是组织工程和基因/细胞治疗的潜在候选材料,甚至可用于开发自体替代疗法,以实现软组织损伤或缺损的长期修复。7,8.
国际细胞与基因治疗学会(ISCT)定义了间充质干细胞(MSCs)全面表征所必须满足的三个最低标准9。第一,MSCs必须具有贴壁生长特性。第二,MSCs应表达间充质干细胞表面标志物,如CD73、CD90和CD105,且不表达造血细胞标志物CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19以及HLA-DR。最后,MSCs应具备向三种间充质谱系分化的能力:脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。有趣的是,MSCs还可分化为其他谱系,如神经细胞、心肌细胞、肝细胞和上皮细胞10,11。
事实上,间充质干细胞(MSCs)具有独特的特性,使其可作为不同疾病再生治疗中的潜在治疗剂。MSCs能够分泌可溶性因子,诱导产生免疫调节环境,从而提供治疗益处12。此外,MSCs能够向损伤部位和肿瘤微环境迁移,实现靶向治疗;然而,其机制尚未完全阐明13。另外,MSCs具有分泌外泌体的能力,这些外泌体是纳米级的细胞外囊泡,携带非编码RNA、蛋白质和可溶性因子,近年来被发现是MSCs在多种疾病中发挥治疗潜力的新机制14。
更重要的是,间充质干细胞(MSCs)因其能够分化为胰岛素生成细胞(IPCs)的潜力而受到广泛关注,这种分化可通过基因修饰实现15,16 或通过在培养基中利用多种外源性诱导因子 体外17IPC的诱导期存在显著差异,因其取决于所采用的诱导方案及使用的外源性因素。分化过程可持续数天至数月,需要在不同阶段添加和/或撤除多种外源性诱导因子。许多用于内分泌胰腺分化的因子均为具有生物活性的化合物,已被证实可促进胰岛素分泌β细胞的增殖或分化/新生,和/或增加IPC的胰岛素含量18,19,20,21值得注意的是,间充质干细胞(MSCs)已被报道可通过多种机制对糖尿病及其并发症产生治疗作用,包括其分泌组以及广泛的免疫调节功能。22,23,24.
在本实验方案中,我们提供了一种从大鼠附睾脂肪中分离和鉴定脂肪间充质干细胞(Ad-MSCs)的详细分步操作流程,随后介绍了一种由Ad-MSCs诱导生成胰岛样细胞团(IPCs)的简单且相对快速的实验方法。
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所有实验均按照批准的指南进行,所有操作均经埃及开罗英国大学(BUE)药学院伦理委员会批准。Ad-MSC分离方案参照Lopez和Spencer的方法并加以修改15。
1. 从大鼠附睾脂肪垫中分离脂肪间充质干细胞(Ad-MSCs)
2. 通过流式细胞术进行免疫表型分析对腺源性间充质干细胞(Ad-MSCs)的特性鉴定
3. 分离获得的脂肪间充质干细胞向多种间充质谱系分化潜能的评估
4. 脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞分化
5. 双硫腙染色
6. 通过 RT-qPCR 检测 β 细胞标志物的基因表达
| cDNA 合成主混合液 | 体积 (µl) |
| 5x cDNA 合成缓冲液 | 4 |
| dNTP | 2 |
| RNA 引物 | 1 |
| Verso 酶混合液 | 1 |
| 逆转录增强剂 | 1 |
| 无核酸酶水 | 可变 |
| 总 RNA | 可变 |
| 总反应体积 | 20 |
表1:cDNA合成主混合液的体积。
| RT-qPCR 反应体系 | 体积 (µl) | 10 µL 体系中的终浓度 |
| cDNA | 2 | 2 ng/孔 |
| RT-qPCR 正向引物 (3 µM) | 1 | 300 nM |
| RT-qPCR 反向引物 (3 µM) | 1 | 300 nM |
| 无核酸酶水 | 1 | ------- |
| 2x SYBR Green 预混液 | 5 | 1x |
| 总反应体积 | 10 |
表2:RT-qPCR反应体系。
| 基因 | 上游引物 | 下游引物 |
| FOXA2 | GAGCCGTGAAGATGGAAGG | ATGTTGCCGGAACCACTG |
| PDX-1 | ATCCACCTCCCGGACCTTTC | CCTCCGGTTCTGCTGCGTAT |
| NKX6.1 | ACACCAGACCCACATTCTCCG | ATCTCGGCTGCGTGCTTCTT |
| MafA | TTCAGCAAGGAGGAGGTCAT | CCGCCAACTTCTCGTATTTC |
| Ins-1 | CACCTTTGTGGTCCTCACCT | CTCCAGTGCCAAGGTCTGA |
| β-actin | TGGAGAAGATTTGGCACCAC | AACACAGCCTGGATGGCTAC |
表3:上游和下游引物序列。
7. 葡萄糖刺激的胰岛素分泌
| 组分 | 浓度 |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | 0.0468 g/L |
| Potassium Chloride | 0.34 g/L |
| Sodium Chloride | 7.00 g/L |
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | 0.1 g/L |
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | 0.18 g/L |
| Sodium Bicarbonate | 1.26 g/L |
| Calcium Chloride | 0.2997 g/L |
表4:配制KRB缓冲液所用的组分。
8. 统计分析
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脂肪间充质干细胞(Ad-MSCs)的分离与表征
如图2所示,从脂肪组织中分离出的细胞在分离后的第二天即呈现出由圆形细胞和成纤维细胞样细胞组成的异质性细胞群体(图2A)。分离后第4天,成纤维细胞样细胞数量和体积开始增加,并在第1代时形成均一的细胞群体(图2B、C)。这些细胞在传代至第3代期间持续表现为贴壁生长、形态类似成纤维细胞的细胞(图2D),符合间充质干细胞(MSCs)特性的第一个标准。这些Ad-MSCs表现出良好的体外培养特性,表明本实验方案是一种有效、简便且相对快速地从附睾脂肪垫中分离Ad-MSCs的方法。
下一步是对分离得到的Ad-MSCs进行表征。根据ISCT的标准,MSCs应满足三项标准:贴壁生长特性、表达间充质细胞标志物CD分子而不表达造血系标志物,以及具有...
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在本实验方案中,我们详细介绍了从大鼠附睾脂肪组织中分离脂肪间充质干细胞(Ad-MSCs)并将其诱导分化为胰岛样细胞团(IPCs)的具体步骤。事实上,大鼠附睾脂肪是一种易于获取的脂肪组织来源,可用于分离Ad-MSCs,且在组织采集和处理过程中无需特殊设备15,26,27。所分离的Ad-MSCs具有良好的体外扩增能力,并符合间充质干细胞的所有鉴定标准。本研究所采用的方案此前已有报道,仅进行了轻微修改15,且已被证实有效且可重复。细胞自分离后第1天即呈现成纤维细胞样形态,并持续增殖,最终形成均一的细胞群体。有趣的是,我们使用相同的方案从人脂肪抽吸物中分离Ad-MSCs,获得了与大鼠组织相当的成功率(数据未显示)。该方法唯一的局限性在于采用了胶原酶化学消化法,与某些其他方案中使用的机械消化法相比存在差异28。此外,该步骤也是一个关键环节,因为化学消化可能对细胞活力产...
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所有共同作者声明本研究不存在利益冲突。
我们感谢埃及英国大学(BUE)药学院兽医专家 Rawda Samir Mohamed 博士(理学硕士)在大鼠解剖过程中提供的帮助。
我们还要感谢并高度评价埃及英国大学(BUE)大众传播学院为本论文视频的制作与编辑所付出的努力。
我们谨感谢埃及英国大学(BUE)英语助教、理学硕士法特玛·马苏德女士对稿件的修改和英文语言校对。
本工作部分由埃及开罗英国大学(BUE)药学院药物研发中心(CDRD)资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白 V 组分 | MP Biomedicals | ||
| 阿利新蓝 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| 茜素红 S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| 氢氧化铵 | Fisher Scientific, Germany | ||
| 大鼠 CD90 抗体,FITC 标记 | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A3912 | |
| 氯化钙 | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 单克隆抗体,FITC 标记 | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 多克隆抗体 | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| 氯仿 | Fisher Scientific, USA | ||
| I 型胶原酶,粉末 | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| 无水 D-葡萄糖,特纯 | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| 二硫腙染色液 | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM - 高糖 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM - 低糖 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 培养基 | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| 无 DNA 酶/RNA 酶水 | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| 绝对乙醇,分子生物学级 | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| 艾塞那肽-4 (Exendin-4) | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| 胎牛血清 (FBS) | Gibco Thermo Fisher, 巴西 | 10270-106 | |
| 甲醛 37% | Fisher Scientific | ||
| 盐酸 (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| 异丙醇,分子生物学级 | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| 氯化镁(无水) | Fisher Scientific, Germany | ||
| 间充质干细胞功能鉴定试剂盒 | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| 油红 O 染色液 | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| 青霉素-链霉素-两性霉素 | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS),1X,不含 Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| 氯化钾 | Fisher Scientific, Germany | ||
| 大鼠胰岛素 ELISA 试剂盒 | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| 碳酸氢钠 | Fisher Scientific, Germany | ||
| 氯化钠 | Fisher Scientific, Germany | ||
| 磷酸氢二钠(无水) | Fisher Scientific, Germany | ||
| 磷酸二氢钠(无水) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| 注射器滤器,0.2 微米 | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| 台盼蓝 | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| 胰蛋白酶-Versene-EDTA,1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA 合成试剂盒 | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
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