方法文章

分离大鼠脂肪组织间充质干细胞并诱导其分化为胰岛素生成细胞

DOI：

10.3791/63348

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2022年8月29日

 ,  ,  , 
1Biochemistry Department, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2Pharmacology and Biochemistry Department, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 3Center for Drug Research and Development (CDRD), Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脂肪组织来源的间充质干细胞（Ad-MSCs）可能是分化为胰岛素生成细胞（IPCs）的一种潜在MSC来源。在本方案中，我们提供了分离和鉴定大鼠附睾Ad-MSCs的详细步骤，随后采用一种简单、快速的方案，由相同的大鼠Ad-MSCs诱导生成IPCs。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

间充质干细胞（MSCs）——尤其是从脂肪组织中分离得到的间充质干细胞（Ad-MSCs）——因其来源丰富、可再生，且不涉及伦理问题，已受到特别关注。然而，目前分离Ad-MSCs的方法尚未标准化，且通常采用需要特殊设备的复杂操作流程。我们采用一种简单且可重复的方法，从Sprague-Dawley大鼠的附睾脂肪组织中分离出Ad-MSCs。分离得到的Ad-MSCs通常在分离后3天内出现，表现为贴壁生长、具有成纤维细胞样形态的细胞。这些细胞在分离后1周内可达到80%的融合度。随后，在第3至第5代（P3-5）时，对分离的Ad-MSCs进行全面表征：通过免疫表型分析检测典型的MSC分化群（CD）表面标志物（如CD90、CD73和CD105），并诱导这些细胞向成骨、成脂和成软骨方向分化，从而验证其多向分化潜能。此外，我们通过一种简单且相对短程的诱导方案，将分离的Ad-MSCs诱导分化为胰岛素生成细胞（IPCs），该方案包括使用高糖Dulbecco改良Eagle培养基（HG-DMEM）、β-巯基乙醇、烟酰胺和艾塞那肽-4。对IPCs分化的评估首先在基因水平进行，包括检测特异性β细胞标志物（如MafA、NKX6.1、Pdx-1和Ins1）的表达水平，并对生成的IPCs进行二氮杂苯染色。其次，通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）实验进行功能评估。综上所述，Ad-MSCs易于分离，具备MSC的所有鉴定特征，并且确实可作为实验室中糖尿病研究所需的丰富且可再生的IPCs来源。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

间充质干细胞（MSCs），也称为间充质基质细胞，是再生医学中最常用的细胞类型之一1,2。它们被归类为成体干细胞，具有多向分化潜能和自我更新能力3。MSCs 可从多种来源分离获得，包括脂肪组织、骨髓、外周血、脐带组织和脐血、毛囊以及牙齿4,5。

从脂肪组织中分离干细胞因其易于获取和快速扩增而被认为具有吸引力和广阔前景 体外，且产量高6脂肪组织来源的间充质干细胞（Ad-MSCs）可从不同物种中分离获得，包括人类、牛、小鼠、大鼠，以及近年来的山羊。7已证实，脂肪源性间充质干细胞（Ad-MSCs）目前是组织工程和基因/细胞治疗的潜在候选材料，甚至可用于开发自体替代疗法，以实现软组织损伤或缺损的长期修复。7,8.

国际细胞与基因治疗学会（ISCT）定义了间充质干细胞（MSCs）全面表征所必须满足的三个最低标准9。第一，MSCs必须具有贴壁生长特性。第二，MSCs应表达间充质干细胞表面标志物，如CD73、CD90和CD105，且不表达造血细胞标志物CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19以及HLA-DR。最后，MSCs应具备向三种间充质谱系分化的能力：脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。有趣的是，MSCs还可分化为其他谱系，如神经细胞、心肌细胞、肝细胞和上皮细胞10,11。

事实上，间充质干细胞（MSCs）具有独特的特性，使其可作为不同疾病再生治疗中的潜在治疗剂。MSCs能够分泌可溶性因子，诱导产生免疫调节环境，从而提供治疗益处12。此外，MSCs能够向损伤部位和肿瘤微环境迁移，实现靶向治疗；然而，其机制尚未完全阐明13。另外，MSCs具有分泌外泌体的能力，这些外泌体是纳米级的细胞外囊泡，携带非编码RNA、蛋白质和可溶性因子，近年来被发现是MSCs在多种疾病中发挥治疗潜力的新机制14。

更重要的是，间充质干细胞（MSCs）因其能够分化为胰岛素生成细胞（IPCs）的潜力而受到广泛关注，这种分化可通过基因修饰实现15,16 或通过在培养基中利用多种外源性诱导因子 体外17IPC的诱导期存在显著差异，因其取决于所采用的诱导方案及使用的外源性因素。分化过程可持续数天至数月，需要在不同阶段添加和/或撤除多种外源性诱导因子。许多用于内分泌胰腺分化的因子均为具有生物活性的化合物，已被证实可促进胰岛素分泌β细胞的增殖或分化/新生，和/或增加IPC的胰岛素含量18,19,20,21值得注意的是，间充质干细胞（MSCs）已被报道可通过多种机制对糖尿病及其并发症产生治疗作用，包括其分泌组以及广泛的免疫调节功能。22,23,24.

在本实验方案中，我们提供了一种从大鼠附睾脂肪中分离和鉴定脂肪间充质干细胞（Ad-MSCs）的详细分步操作流程，随后介绍了一种由Ad-MSCs诱导生成胰岛样细胞团（IPCs）的简单且相对快速的实验方法。

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方案

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所有实验均按照批准的指南进行，所有操作均经埃及开罗英国大学（BUE）药学院伦理委员会批准。Ad-MSC分离方案参照Lopez和Spencer的方法并加以修改15。

1. 从大鼠附睾脂肪垫中分离脂肪间充质干细胞（Ad-MSCs）

  1. 使用体重为250–300 g、年龄不超过1个月的雄性Sprague-Dawley大鼠（每次分离使用两只）。麻醉动物后，通过颈椎脱位法处死。用70%乙醇喷洒已处死的动物。剥离腹部下部的皮肤和肌肉，然后取出两个睾丸以暴露附睾脂肪垫。
  2. 小心切割附睾脂肪垫，注意不要损伤血管。
  3. 分离附睾周围脂肪组织，然后将其置于含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。
  4. 在生物安全柜中，使用镊子和手术刀将这些脂肪垫切成小块。将切碎的脂肪组织转移至含有10 mL无菌PBS的50 mL离心管中。
  5. 每次用10 mL PBS对剪碎的脂肪组织进行洗涤，共洗涤5次 ，以去除污染的血液。以下洗涤步骤必须仔细执行。
    1. 向组织中加入10 mL PBS，充分混匀45秒。然后将离心管直立静置5分钟，使组织依靠重力沉降并分层为两层。
    2. 使用10 mL注射器吸除下层液体（infranatant）中的PBS，并更换为新鲜的10 mL PBS进行下一次洗涤。
    3. 重复此洗涤步骤4–5次 ，直至PBS中无血迹残留。这表明大部分甚至全部血液已被去除。
  6. 洗涤完成后，将脂肪组织重悬于10 mL胶原酶溶液中（PBS中含0.1% I型胶原酶）。用封口膜严密封闭离心管，然后在摇床水浴中孵育（37 °C，80 rpm，45分钟），直至组织几乎完全均质化。
    注意：避免组织完全消化（即溶液完全均质化且所有组织残渣/碎片完全消失），因为这会对后续细胞培养产生不利影响。通常消化时间为30–45分钟。
  7. 胶原酶消化完成后，涡旋震荡离心管15秒，然后在300 × g 条件下离心5分钟。再次涡旋震荡10秒，随后再进行一次5分钟的离心。此时可观察到三层结构。小心弃去油层，接着弃去水层，注意不要扰动基质血管组分（SVF）沉淀。
    注意：去除含有脂肪细胞和胶原酶溶液的上清液。首先使用10 mL移液器移除脂肪细胞及其伴随的油层，确保完全清除油滴，然后移除下方的水层。
  8. 将离心管底部的SVF沉淀重悬于10 mL无菌BSA溶液中（PBS中含1%牛血清白蛋白V组分），然后在300 × g 条件下离心5分钟。
  9. 离心后弃去上清液，将SVF沉淀重悬于8.5 mL间充质干细胞完全培养基（Ad-MSCs完全培养基，由DMEM/F12培养基[DMEM/F12]组成，并添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、0.25 µg/mL两性霉素B和2 mM L-谷氨酰胺）中。
  10. 将细胞接种于25 cm2培养瓶中，在37 °C、5% CO2条件下培养。次日检查贴壁细胞，去除未贴壁的悬浮细胞，并更换培养基。此后每隔一天更换一次培养基。
  11. 当细胞融合度达到80%–90%时，每5–7天传代一次，使用胰蛋白酶-EDTA进行消化。本实验方案后续实验应使用第3–5代细胞。所有分离步骤的示意图见图1。
    注意：不同供应商提供的胰蛋白酶-EDTA活性可能存在差异，因此应尽量缩短胰酶消化时间，以避免对细胞产生毒性作用。

2. 通过流式细胞术进行免疫表型分析对腺源性间充质干细胞（Ad-MSCs）的特性鉴定

  1. 第3代时，使用胰蛋白酶-EDTA消化细胞，用PBS洗涤2次 ，然后用血细胞计数板计数细胞。
  2. 将100,000个细胞与标记了异硫氰酸荧光素（FITC）的小鼠抗大鼠CD90或CD105（间充质细胞标志物）或CD34（造血细胞标志物）单克隆抗体在4 °C避光孵育20分钟。
  3. 洗涤细胞后，重悬于500 µL FACS缓冲液中，通过流式细胞术进行分析25。

3. 分离获得的脂肪间充质干细胞向多种间充质谱系分化潜能的评估

  1. 脂肪细胞分化
    1. 将细胞重悬于完全培养基中（如步骤1.9所述），然后以3.7 × 10⁵个细胞/mL的密度培养细胞4 24孔组织培养板中每孔接种细胞。在37 °C、5% CO₂的湿化气氛中孵育。2. 接下来，每3天更换一次培养基，直至细胞融合度接近100%，通常需要3天。
    2. 当细胞达到所需汇合度时，将增殖培养基更换为成脂分化培养基（由低糖DMEM培养基添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、0.25 µg/mL两性霉素B和2 mM L-谷氨酰胺，并加入1×成脂诱导补充剂，补充剂来自间充质干细胞功能鉴定试剂盒）以诱导成脂分化。此后每3天更换一次培养基（每孔0.5 mL），更换时应轻柔操作，避免破坏脂质空泡。
    3. 21天后，通过显微镜观察脂滴形成情况以及油红O染色来评估成脂分化。
    4. 配制油红O储备液：将30 mg油红O染料溶解于10 mL异丙醇中，室温静置至少20分钟。随后，通过将3份储备液与2份双蒸水（ddH₂O）混合配制工作液。2O），充分混匀，室温静置10分钟，随后用滤纸过滤。
    5. 为记录脂肪成脂分化过程，用 PBS 清洗细胞 2 次，然后加入 10% 中性缓冲福尔马林（0.75 ml/孔）固定 15 分钟。随后，再次用 PBS 清洗细胞 2 次 用1 mL/孔的PBS洗涤，每次孵育5分钟。在加入油红工作液之前，必须彻底吸除PBS。
    6. 最后一次洗涤后，向细胞中加入油红工作液，在 37 °C 孵育 60 分钟。随后去除染色液，轻轻洗涤细胞 2 次 用 PBS 清洗。在显微镜下观察染色的脂滴。
  2. 成骨分化
    1. 种子 7.4 × 103 细胞/孔（每孔0.5 mL培养基）接种于24孔板中，在37 °C、5% CO₂的湿化气氛中培养2 在完全培养基（如步骤1.9所述）中培养3天，使其融合度达到约70%。
    2. 使用成骨诱导添加剂（随试剂盒提供）诱导细胞 在添加了10% FBS、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、0.25 µg/mL两性霉素B和2 mM L-谷氨酰胺的LG-DMEM培养基中
    3. 继续成骨诱导21天，每3天更换一次分化培养基。
    4. 将 200 mg 阿尔新蓝 S 染料溶于 9 mL ddH₂O 中，配制阿尔新蓝 S 染色工作液2O，然后使用氨水和 HCl 将 pH 调至 4.1–4.3。接着用 ddH₂O 定容至 10 mL。2O. 随后，使用滤纸过滤去除任何沉淀物。
    5. 洗涤细胞2次 用 PBS 洗涤，然后加入 10% 中性缓冲福尔马林（每孔 0.75 mL）固定 15 分钟。随后，洗涤细胞 2 次 用 PBS（1 mL/孔）孵育细胞，每次 5 分钟。
    6. 将固定后的细胞与配制好的2%茜素红S溶液在37 °C培养箱中孵育30分钟。
    7. 之后，移除染色液，用缓冲液洗涤细胞2次 用ddH₂O2用 PBS 洗涤一次，然后在显微镜下观察染色的富钙细胞外基质，以评估成骨分化。
  3. 软骨形成分化
    1. 接种 7.4 × 103 细胞/孔（每孔0.5 mL培养基），置于24孔板中，在37 °C、5% CO₂的湿化气氛中培养2 在完全培养基（如步骤1.9所述）中培养3天，使其融合度达到约70%。
    2. 当达到所需汇合度时，使用无血清的DMEM/F12培养基诱导细胞软骨向分化，该培养基含有胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、软骨分化补充剂（随试剂盒提供）、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、0.25 µg/mL 两性霉素B和2 mM L-谷氨酰胺21.
    3. 将细胞在软骨诱导培养基中培养21天，每3天更换一次软骨诱导分化培养基。
    4. 按如下步骤配制阿尔新蓝8GX染色工作液：首先，用ddH₂O配制3%冰醋酸溶液2O，通过将3 mL冰醋酸加入97 mL ddH₂O中2然后，通过将0.1 g阿尔新蓝8GX溶于100 mL 3%冰醋酸溶液中配制染色工作液，并使用滤纸过滤去除任何沉淀物。
    5. 洗涤细胞2次 用 PBS 洗涤，然后加入 10% 中性缓冲福尔马林（每孔 0.75 mL）固定 15 分钟。随后，洗涤细胞 2 次 用 PBS（1 mL/孔）孵育细胞，每次 5 分钟。
    6. 下一步是将细胞在已配制的含3%冰醋酸的0.1%阿尔新蓝8GX染液中37 °C孵育60分钟。用ddH₂O洗涤染色后的细胞2次。2O 和 PBS 各洗涤一次，然后在显微镜下观察染色的硫酸化蛋白聚糖。

4. 脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞分化

  1. 第3代时，使用胰蛋白酶-EDTA消化分离Ad-MSCs。首先移除培养基，然后在培养瓶中用5 mL PBS洗涤仍贴壁的细胞。接着向75 cm2培养瓶中加入5 mL胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育3–10分钟。
    注意：建议在早期代次（通常为P3–P5）进行细胞诱导，因为晚期代次会不利地影响细胞特性及分化能力17,24。
  2. 随后观察细胞是否已脱落并形成单细胞悬液。向培养瓶中加入5 mL完全DMEM/F12培养基以终止胰蛋白酶作用。收集细胞悬液并转移至15 mL离心管中，再向管中加入5 mL完全DMEM/F12培养基。
  3. 以300 × g离心2分钟，使细胞沉淀。
  4. 用PBS洗涤细胞一次，再次以300 × g离心2分钟，然后将细胞沉淀重悬于3–5 mL完全DMEM/F12培养基中。
  5. 使用台盼蓝染色液和血细胞计数板对细胞进行计数。
  6. 随后将细胞接种至6孔板（每孔1 × 106个细胞）和12孔板（用于GSIS检测；每孔1 × 106个细胞），在完全培养基中（如步骤1.9所述）于37 °C、5% CO2培养箱中培养3天，直至细胞融合度接近90%。
  7. 诱导当天，移除培养基，用PBS洗涤细胞，然后使用预诱导培养基（DMEM/F12添加10% FBS、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、0.25 µg/mL两性霉素B、2 mM L-谷氨酰胺、10 mM烟酰胺[NA]和1 mM β-巯基乙醇[β-ME]）对细胞进行为期2天的预诱导处理。
  8. 使用高糖DMEM（HG-DMEM，葡萄糖浓度4.5 g/L）进一步诱导细胞1天，该培养基添加2.5% FBS、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、0.25 µg/mL两性霉素B、2 mM L-谷氨酰胺、10 mM NA和1 mM β-ME。在此阶段结束时收集细胞沉淀（本方案中称为D3细胞）。
  9. 将细胞继续在终末分化诱导培养基中孵育7天，该培养基为HG-DMEM添加2.5% FBS、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、0.25 µg/mL两性霉素B、2 mM L-谷氨酰胺、10 mM NA、1 mM β-ME以及10 nM艾塞那肽-4（exendin-4）。
  10. 在指定时间结束后，收集细胞沉淀（本方案中称为Final），并通过DTZ染色和GSIS检测评估细胞分化的成功情况，具体方法如下。
  11. 按照下方步骤5 和6 评估所生成的胰岛样细胞簇（IPCs）。

5. 双硫腙染色

  1. 配制二苯硫腙（DTZ）染色储备液：将25 mg DTZ完全溶解于2.5 mL二甲基亚砜（DMSO）中，分装成若干 aliquot，于−20 °C避光保存，直至使用。
  2. 染色时，将储备液用完全培养基（高糖DMEM，添加5%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、0.25 µg/mL两性霉素B和2 mM L-谷氨酰胺）按1:100（体积/体积）稀释，制备工作液，然后用0.2 µm注射器滤器过滤。
  3. 接下来，对6孔板中指定的细胞进行DTZ染色，吸除培养基后，用PBS洗涤细胞一次，每孔加入2 mL DTZ工作液，在37 °C、CO2培养箱中孵育至少2小时。
  4. 用PBS小心洗涤细胞2次 。最后一次洗涤后，每孔加入2 mL PBS，然后在倒置显微镜下观察呈深红色染色的胰岛样细胞团（IPCs）。以最初在完全生长培养基（10% FBS - DMEM/F12）中培养的未诱导Ad-MSCs作为对照。

6. 通过 RT-qPCR 检测 β 细胞标志物的基因表达

  1. RNA 提取
    1. 分化完成后，收集细胞沉淀并将其在 −80 °C 下保存至使用。将每个细胞沉淀（来自一个 6 孔板中六个孔的合并样本）悬浮于 1.5 mL 无核酸酶管中的 1 mL 异硫氰酸胍 RNA 提取试剂中，并反复吹打数次。将裂解后的样品在室温下孵育 5 分钟，以确保核蛋白复合物完全解离。
    2. 每 1 mL RNA 提取试剂中加入 200 µL 氯仿，盖紧管盖后用力振荡 15 秒。随后在室温下孵育 3 分钟。
    3. 在 4 °C 下以 13,800 xg 离心 15 分钟。此步骤将使混合物分离为下层氯仿相、中间相和无色上层水相，RNA 保留在水相中。
    4. 将上层水相转移至新管中，注意避免接触中间相。
    5. 向水相中加入 600 µL 100% 异丙醇（体积比 1:1），通过反复颠倒混匀 25 次，充分混匀样品，并在室温下孵育 10 分钟。
    6. 在 4 °C 下以 18,800 xg 离心 30 分钟。沉淀的 RNA 将在管壁形成微小的凝胶状沉淀。
    7. 移除上清液，并用 1 mL 冰冷的 80% 乙醇洗涤沉淀。加入乙醇后，缓慢吹打 RNA 沉淀 10 秒。
    8. 在 4 °C 下以 9,600 xg 离心 5 分钟。弃去上清液，将 RNA 沉淀在空气中干燥 5–10 分钟。
    9. 干燥后，根据初始沉淀大小，用 25–100 µL 无 RNase 水将 RNA 沉淀溶解于 1.5 mL 无核酸酶管中，通过反复吹打数次直至完全溶解。避免 RNA 沉淀过度干燥。
      注：通常，沉淀干燥后会变得透明。一旦透明，应立即重悬，以防止沉淀过度干燥。
    10. 使用无核酸酶水作为空白对照，测定 260 nm 和 280 nm 处的光密度（OD）以定量 RNA。
    11. 确保样品的 OD260/OD280 比值为 1.8–2.0。
  2. cDNA 合成
    1. 使用 cDNA 合成试剂盒，从分离的总 RNA 合成 cDNA。
    2. 根据试剂盒说明书进行 cDNA 合成反应。在 200 µL PCR 管中，加入含有 0.5 µg 总 RNA 的 RNA 溶液至反应主混合液中，主混合液组成见表 1。
    3. 将 RNA 加入主混合液后，使用热循环仪进行如下程序：50 °C 孵育 30 分钟（1 个循环），随后 95 °C 灭活 2 分钟（1 个循环）。
    4. 用无核酸酶水将 cDNA 稀释至终浓度为 2 ng/µL。于 −20 °C 保存，用于后续 RT-qPCR 分析。
  3. 使用 SYBR Green 主混合液进行 RT-qPCR
    1. 根据表 2所示反应体系，使用 cDNA 模板对每个目标基因进行 RT-qPCR 反应。所有操作均设三个重复。
    2. 所用引物序列见表 3。所有 RT-qPCR 操作均在冰上进行。
    3. 使用实时荧光定量 PCR 仪，在默认程序设置下进行 RT-qPCR 反应。热循环条件包括：95 °C 预变性 10 分钟，随后进行 45 个循环（95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火/延伸 1 分钟）。
    4. 根据 2-ΔΔCt 法确定 Ct 值并计算基因表达水平，以 β-actin 作为内参对照。

cDNA 合成主混合液体积 (µl)
5x cDNA 合成缓冲液4
dNTP2
RNA 引物1
Verso 酶混合液1
逆转录增强剂1
无核酸酶水可变
总 RNA可变
总反应体积20

表1：cDNA合成主混合液的体积。

RT-qPCR 反应体系体积 (µl)10 µL 体系中的终浓度
cDNA22 ng/孔
RT-qPCR 正向引物 (3 µM)1300 nM
RT-qPCR 反向引物 (3 µM)1300 nM
无核酸酶水1-------
2x SYBR Green 预混液51x
总反应体积10

表2：RT-qPCR反应体系。

基因上游引物下游引物
FOXA2GAGCCGTGAAGATGGAAGGATGTTGCCGGAACCACTG
PDX-1ATCCACCTCCCGGACCTTTCCCTCCGGTTCTGCTGCGTAT
NKX6.1ACACCAGACCCACATTCTCCGATCTCGGCTGCGTGCTTCTT
MafATTCAGCAAGGAGGAGGTCATCCGCCAACTTCTCGTATTTC
Ins-1CACCTTTGTGGTCCTCACCTCTCCAGTGCCAAGGTCTGA
β-actinTGGAGAAGATTTGGCACCACAACACAGCCTGGATGGCTAC

表3：上游和下游引物序列。

7. 葡萄糖刺激的胰岛素分泌

  1. 克雷布斯-林格碳酸氢盐（KRB）缓冲液的制备
    1. 为进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）实验，分别配制含2 mM葡萄糖（低葡萄糖）和20 mM葡萄糖（高葡萄糖）浓度的克雷布斯-林格碳酸氢盐（KRB）缓冲液。KRB缓冲液的组分见表4。
    2. 使用1 N HCl将缓冲液pH调节至约7.25–7.35（即比目标pH值7.4低0.1–0.2个单位，因为在过滤过程中pH可能上升）。
    3. 新鲜加入牛血清白蛋白（BSA），终浓度为0.1%（质量/体积）。
    4. 随后加入葡萄糖（配制50 mL KRB缓冲液时，低葡萄糖组加入18 mg，高葡萄糖组加入180 mg，分别得到2 mM和20 mM的KRB缓冲液）。
    5. 将配制好的低葡萄糖（LG）和高葡萄糖（HG）KRB缓冲液通过0.2 µm针头滤器过滤除菌，以备GSIS实验使用。
  2. GSIS实验
    1. 最初在12孔细胞培养板中以每孔1 × 105个细胞的密度接种细胞，并采用完全相同的分化诱导方案对这些细胞进行诱导。
    2. 诱导程序结束后，用PBS轻柔洗涤所获得的胰岛样细胞团（IPCs，位于培养板中）2次 ，再用LG-KRB缓冲液洗涤1次。
    3. 随后，每孔加入300 µL LG-KRB缓冲液，于37°C孵育1小时，然后弃去该缓冲液。
    4. 接着，每孔加入300 µL 2 mM（LG）或20 mM（HG）KRB缓冲液，继续孵育1小时。孵育结束后，收集上清液，并于−80 °C保存，用于后续使用商用ELISA试剂盒检测分泌的胰岛素，操作步骤需遵循制造商说明书。
      注意：在GSIS实验过程中，吸取或添加PBS及KRB缓冲液时应尽可能轻柔操作。
组分浓度
Magnesium Chloride (Anhydrous)0.0468 g/L
Potassium Chloride0.34 g/L
Sodium Chloride7.00 g/L
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous)0.1   g/L
Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous)0.18 g/L
Sodium Bicarbonate1.26 g/L
Calcium Chloride0.2997 g/L

表4：配制KRB缓冲液所用的组分。

8. 统计分析

  1. 所有数据均以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。所有比较均使用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验，通过 统计软件完成。当p值**p ≤ 0.01 和*p ≤ 0.05时，认为差异具有统计学显著性。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脂肪间充质干细胞（Ad-MSCs）的分离与表征
如图2所示，从脂肪组织中分离出的细胞在分离后的第二天即呈现出由圆形细胞和成纤维细胞样细胞组成的异质性细胞群体（图2A）。分离后第4天，成纤维细胞样细胞数量和体积开始增加，并在第1代时形成均一的细胞群体（图2B、C）。这些细胞在传代至第3代期间持续表现为贴壁生长、形态类似成纤维细胞的细胞（图2D），符合间充质干细胞（MSCs）特性的第一个标准。这些Ad-MSCs表现出良好的体外培养特性，表明本实验方案是一种有效、简便且相对快速地从附睾脂肪垫中分离Ad-MSCs的方法。

下一步是对分离得到的Ad-MSCs进行表征。根据ISCT的标准，MSCs应满足三项标准：贴壁生长特性、表达间充质细胞标志物CD分子而不表达造血系标志物，以及具有...

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讨论

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在本实验方案中，我们详细介绍了从大鼠附睾脂肪组织中分离脂肪间充质干细胞（Ad-MSCs）并将其诱导分化为胰岛样细胞团（IPCs）的具体步骤。事实上，大鼠附睾脂肪是一种易于获取的脂肪组织来源，可用于分离Ad-MSCs，且在组织采集和处理过程中无需特殊设备15,26,27。所分离的Ad-MSCs具有良好的体外扩增能力，并符合间充质干细胞的所有鉴定标准。本研究所采用的方案此前已有报道，仅进行了轻微修改15，且已被证实有效且可重复。细胞自分离后第1天即呈现成纤维细胞样形态，并持续增殖，最终形成均一的细胞群体。有趣的是，我们使用相同的方案从人脂肪抽吸物中分离Ad-MSCs，获得了与大鼠组织相当的成功率（数据未显示）。该方法唯一的局限性在于采用了胶原酶化学消化法，与某些其他方案中使用的机械消化法相比存在差异28。此外，该步骤也是一个关键环节，因为化学消化可能对细胞活力产...

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披露

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所有共同作者声明本研究不存在利益冲突。

致谢

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我们感谢埃及英国大学（BUE）药学院兽医专家 Rawda Samir Mohamed 博士（理学硕士）在大鼠解剖过程中提供的帮助。

我们还要感谢并高度评价埃及英国大学（BUE）大众传播学院为本论文视频的制作与编辑所付出的努力。

我们谨感谢埃及英国大学（BUE）英语助教、理学硕士法特玛·马苏德女士对稿件的修改和英文语言校对。

本工作部分由埃及开罗英国大学（BUE）药学院药物研发中心（CDRD）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牛血清白蛋白 V 组分MP Biomedicals
阿利新蓝 8GXSigma-Aldrich, USAA3157
茜素红 SSigma-Aldrich, USAA5533
氢氧化铵Fisher Scientific, Germany
大鼠 CD90 抗体，FITC 标记Stem Cell Technologies60024FI
牛血清白蛋白Sigma AldrichA3912
氯化钙Fisher Scientific, Germany
CD105 单克隆抗体，FITC 标记Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USAMA1-19594
CD34 多克隆抗体Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USAPA5-85917
氯仿Fisher Scientific, USA
I 型胶原酶，粉末Gibco, Thermo Fisher, USA17018029
无水 D-葡萄糖，特纯Fisher Scientific, GermanyG/0450/53
二甲基亚砜 (DMSO)Fisher Scientific, GermanyBP231-100
二硫腙染色液Sigma-Aldrich, USAD5130
DMEM - 高糖 4.5 g/LLonza, Switzerland12-604F
DMEM - 低糖 1 g/LLonza, Switzerland12-707F
DMEM/F12 培养基Lonza, SwitzerlandBE12-719F
无 DNA 酶/RNA 酶水Gibco Thermo Fisher, USA10977-035
绝对乙醇，分子生物学级Sigma-Aldrich, Germany24103
艾塞那肽-4 (Exendin-4)Sigma-Aldrich, GermanyE7144
胎牛血清 (FBS)Gibco Thermo Fisher, 巴西10270-106
甲醛 37%Fisher Scientific
盐酸 (HCl)Fisher Scientific, Germany
异丙醇，分子生物学级Fisher Scientific, USABP2618500
L-谷氨酰胺Gibco Thermo Fisher, USA25030-024
氯化镁（无水）Fisher Scientific, Germany
间充质干细胞功能鉴定试剂盒R&D systems Inc., MN, USASC006
烟酰胺Sigma-Aldrich, GermanyN0636
油红 O 染色液Sigma-Aldrich, USAO0625
青霉素-链霉素-两性霉素Gibco Thermo Fisher, USA15240062
磷酸盐缓冲液 (PBS)，1X，不含 Ca/MgLonza, SwitzerlandBE17-516F
氯化钾Fisher Scientific, Germany
大鼠胰岛素 ELISA 试剂盒Cloud-Clone Corp., USACEA682Ra
碳酸氢钠Fisher Scientific, Germany
氯化钠Fisher Scientific, Germany
磷酸氢二钠（无水）Fisher Scientific, Germany
磷酸二氢钠（无水）Fisher Scientific, Germany
SYBR Green MaximaThermo Scientific, USAK0221
注射器滤器，0.2 微米Corning, USA431224
TRIzolThermo Scientific, USA15596026
台盼蓝Gibco Thermo Fisher, USA15250061
胰蛋白酶-Versene-EDTA，1XLonza, SwitzerlandCC-5012
Verso cDNA 合成试剂盒Thermo Scientific, USAAB-1453/A
β-巯基乙醇Sigma-Aldrich, GermanyM3148

参考文献

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