改良的小鼠新生心脏在兰格多夫装置中的应用技术

摘要

本方案描述了主动脉插管及逆行灌注 离体 新生小鼠心脏。采用双人操作策略，借助解剖显微镜和钝头细针，可实现可靠的插管。通过连接至左心室心尖部的力传感器，可定量测定纵向收缩张力。

摘要

使用 离体 逆行灌注心脏自一百多年前 Oskar Langendorff 建立以来，一直是缺血-再灌注研究的核心方法。尽管该技术在过去25年中已应用于小鼠，但在该物种中的应用仅限于成年动物。建立一种可稳定插管新生小鼠主动脉的有效方法，将能够在心脏发育关键时期，利用一种可进行遗传修饰且成本较低的物种，系统性地研究离体逆行灌注心脏。对 Langendorff 装置进行改良，可在尽量缩短缺血时间的前提下，实现新生小鼠心脏的插管与再灌注的建立。该方法的优化需要两人协作，借助解剖显微镜和经改造的商用针头，成功完成新生小鼠主动脉的插管。采用此方法可在3分钟内可靠地建立逆行灌注。由于新生小鼠心脏组织脆弱且心室腔较小，无法使用球囊直接测量心室内压力，因此必须采用连接缝线至左心室心尖的力传感器，以量化纵向收缩张力。该方法使研究人员能够成功建立离体恒流逆行灌注新生小鼠心脏模型，从而支持对发育期心脏生物学的深入研究。 离体 重要的是，该模型将成为研究新生心脏缺血-再灌注生理学和药理学反应的有力工具。

引言

离体心脏制备已作为生理学、病理生理学和药理学研究的重要手段超过一个世纪。该技术起源于19世纪60年代Elias Cyon的工作，随后Oskar Langendorff改进了离体蛙心模型，采用逆向灌注方式，通过对主动脉根部加压，使含氧灌注液进入冠状动脉循环¹。利用这一改进方法，Langendorff成功证明了冠状动脉循环与心脏机械功能之间的相关性²。这种离体逆向灌注心脏模型后来被命名为Langendorff技术，一直是生理学研究的核心方法之一，因其操作简便，可有效排除干扰因素，深入研究离体心脏的功能。Langendorff制备方法后续进一步被改良，使心脏能够射血（即所谓的"工作心脏"），并允许灌注液循环使用³。然而，主要关注的生理学终点指标始终未变，包括收缩功能、电传导、心肌代谢以及冠状动脉阻力等指标的测量⁴。

为了评估其原始蛙心制备中的心脏功能，朗根多夫（Langendorff）通过一根连接心尖与力传感器的缝合线，测量心室收缩在长轴方向上产生的张力。⁵ 通过在无心室充盈的情况下对心脏施加基础张力，以此方式定量测定等长收缩。该方法的改进促使采用充满液体的球囊置入左心室。 通过

方案

本研究所有方法均获得哥伦比亚大学医学中心机构动物护理和使用委员会的批准。实验使用野生型 C57Bl/6 雄性出生后第 10 天小鼠。

1. 兰格多夫装置的准备

1. 为降低复杂性，在Langendorff装置中使用非循环式含氧灌注液（参见 材料表) 通过 恒定流速或恒定压力
   1. 使用含有 120 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgSO₄ 的克雷布斯-亨塞尔莱特缓冲液（KHB）₄，1.2 mmol/L KH₂PO₄，1.25 mmol/L CaCl₂₂，25 mmol/L NaHCO₃₃, 以及 pH 7.4 条件下的 11 mmol/L 葡萄糖（参见 材料表），用含 95% O₂ 的混合气体平衡₂ 和5% CO₂₂ 在朗根多夫装置内并维持在37 °C。
2. 对于恒定流速法，保持约 2.5 mL∙min 的连续流速^-1.
   注意：鉴于出生10天（P10）小鼠心脏的平均重量约为30 mg，该流速将接近冠状动脉血流速度，约为75–80 mL/g....

结果

采用P10小鼠模拟人类婴儿期的一个时间点^26,27。成功获取并插管15个分离的C57Bl/6新生小鼠心脏。心脏以2.5 mL min^-1的恒定流速灌注加温且含氧的KHB溶液。检测代谢参数，包括葡萄糖摄取、耗氧量、乳酸生成，以及生理参数如心率、灌注压和冠状动脉阻力。使用表面电极连续记录心电图，以确定其固有心率和节律（图2）。采用Langendorff所述方法测定心脏纵向轴向的收缩力²⁸。

进行代谢评估以判断灌注是否充分。通过从灌注液的氧含量中减去冠状静脉流出液的氧含量，计算出氧提取百分比。心肌耗氧量通过冠状血流速率乘以灌注液与冠状静脉流出液之间氧含量的差值，再乘以氧的溶解度（假设在37 °C和760 mmHg条件下，每毫升H₂O中溶解24 µL氧气）来确定^29,.......

讨论

本研究描述了在离体新生小鼠心脏中成功进行主动脉插管和逆行灌注的方法。该方法尤为重要，因为它使研究人员能够克服以往因幼龄小鼠年龄小、心脏尺寸小而带来的技术障碍⁸。尽管该方法在设计上并不复杂，但仍需要较高的技术水平。其中，主动脉插管及固定插管位置是即使技术最熟练的研究人员也必然面临的关键挑战。新生儿期插管困难不仅源于主动脉管腔尺寸微小，升主动脉相对较短（从主动脉瓣至右锁骨下动脉起始处之间的主动脉组织）也可能使研究人员难以精确控制主动脉插管，因而需要团队成员之间仔细协调。若未能在该区域正确放置并固定插管，则可能导致实验失败。例如，插管插入过深可能损伤主动脉瓣或导致心室内插管；而插管位置过浅则可能引起灌注液从某一分支（如锁骨下动脉）外漏。此外，用力过猛的插管操作可能导致主动脉撕裂。这些不当插管所导致的后果通常表现为高流速或低灌注压¹。相反，低流速或高灌注压则可能提示存在血栓、空气栓塞、插管阻塞或冠状动脉阻塞等情况¹。无论病因如何，心律失常、心动过缓或心动过速均是灌注不足的表现

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
啮齿类动物朗根多夫装置	Radnoti	130102EZ
24 G 导管	BD	381511
1 mL 注射器组合 26 G 针头	BD	309597
26 G 钢针	BD	305111
5-0 丝线缝合线	Ethicon	S1173
生物放大器	ADInstruments	FE135
生物信号连接线	ADInstruments	MLA1515
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
循环加热水浴槽	Haake	DC10
弯头虹膜剪	Medline	MDS10033Z
解剖显微镜	Nikon	SMZ-2B
精细弹簧剪	Kent	INS600127
力传感器	ADInstruments	MLT1030/D
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270-100G
肝素	Sagent	400-01
高压管路	Edwards Lifesciences	50P184
虹膜敷料镊	Kent	INS650915-4
珠宝匠式弯头精细镊	Miltex	17-307-MLTX
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-25G
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662-25G
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506-500G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-25G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-25G
滚压泵	Gilson	Minipuls 3
直头解剖剪	Kent	INS600393-G
临时心脏起搏导线	Ethicon	TPW30
宽量程力传感器	ADInstruments	MLT1030/A