方法文章

土壤样品中昆虫病原真菌分离方法的比较

DOI：

10.3791/63353

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2022年1月6日

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1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 2Laboratório de Taxonomia Bioquímica e Bioprospecção de Fungos/Coleção de Cultura de Fungos Filamentosos, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

本文内容

摘要

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从热带土壤样品中分离昆虫病原真菌菌落 Tenebrio 诱饵， 大蜡螟 诱饵，以及选择性人工培养基，即.添加氯霉素、噻苯咪唑和环己酰亚胺的酵母提取物增强马铃薯葡萄糖琼脂（CTC 培养基）。

摘要

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本研究旨在比较使用昆虫诱饵与人工选择性培养基从土壤样品中分离昆虫病原真菌（EPF）的有效性。土壤是包括EPF在内的多种微生物的丰富生境，其中EPF主要属于Metarhizium和Beauveria属，能够调控节肢动物害虫。目前市场上已有基于真菌的生物产品，主要用于农业节肢动物害虫的防治。然而，尽管全球具有高度的特有生物多样性，目前在全球商业生物制品中应用的菌株却仅有少数。在本研究中，将524份土壤样品接种于添加酵母提取物并补充氯霉素、噻苯咪唑和放线菌酮的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（CTC培养基）上进行培养。连续观察真菌菌落生长情况达3周。所有Metarhizium和Beauveria属EPF均通过形态学方法鉴定至属水平，部分分离物还进行了分子水平的种级鉴定。从这524份土壤样品中另选取24份，采用昆虫诱饵法（Galleria mellonella和Tenebrio molitor）检测EPF的存在情况。共分离得到51株EPF菌株（41株Metarhizium spp. 和10株Beauveria spp.），所有真菌菌株均来自农田或草地土壤。在用于比较的24份样品中，采用Galleria诱饵法检测EPF阳性率为91.7%，采用Tenebrio诱饵法为62.5%，而使用CTC培养基仅为41.7%。研究结果表明，利用昆虫诱饵法从土壤中分离EPF比使用CTC培养基更为高效。分离方法的比较结合EPF的鉴定与保藏，有助于增进对生物多样性的认知。EPF菌种资源的丰富将促进科学研究与技术创新。

引言

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土壤是多种微生物的来源，包括昆虫病原真菌（EPF）。这类真菌因其能够定殖并常常导致节肢动物宿主（尤其是昆虫）死亡而被认知1。在完成分离、鉴定、毒力菌株筛选和注册后，EPF可被大规模生产用于节肢动物害虫的防治，这体现了其重要的经济价值2。因此，EPF的分离被认为是开发生物杀虫剂的第一步。Beauveria spp.（肉座菌目：线虫草科）和 Metarhizium spp.（肉座菌目：麦角菌科）是目前用于节肢动物害虫防治中最常见的真菌种类3。EPF已成功从土壤、表现出明显真菌感染症状的节肢动物、被定殖的植物以及植物根际中分离获得4,5。

分离胞内菌真菌（EPF）也有助于研究该特定类群的多样性、分布及生态学特性。近期文献报道指出，EPF的应用价值被低估，列举了EPF的一些非常规用途，例如促进植物生长4、去除土壤中的有毒污染物以及在医学领域的应用6。本研究旨在比较利用昆虫诱饵与人工培养基从土壤中分离EPF的效率7,

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方案

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由于本研究涉及巴西遗传资源，已在国家遗传资源及关联传统知识管理系统（Sisgen）注册，注册号为 AA47CB6。

1. 土壤采样

  1. 使用小铲子采集800 g土壤（可含或不含伴生的次生植物根系），采样深度为10 cm。将样品置于聚丙烯袋中，室温保存，直至实验开始。
    ​注意：由于已有报道表明内生真菌（EPF）具有根际定殖能力，因此也可同时采集细小根系。样品应尽快处理，因为真菌孢子的活力可能随时间推移而降低。在本研究中，所有样品均在采集后7天内完成分析。
  2. 使用GPS记录所采集样品的地理坐标（经纬度），并根据土壤类型对采样区域进行分类（例如草地、原始雨林、湖岸或农田）。

2. 昆虫病原真菌的分离方法

  1. 使用CTC选择性人工培养基进行分离。
    1. 配制CTC培养基[马铃薯葡萄糖琼脂加酵母提取物（PDAY），添加0.5 g/L氯霉素、0.001 g/L噻苯咪唑和0.25 g/L放线菌酮9]时，分别称取所有试剂，溶于蒸馏水中，并在高压灭菌器中对培养基进行灭菌。在生物安全柜中，将23 mL培养基倒入60 mm × 15 mm的培养皿中。
      注意：称量CTC试剂时应穿戴实验服、口罩、手套和....

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结果

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2015年至2018年间，在巴西里约热内卢州的草原地区共采集了524份土壤样品，包括畜牧牧场（165份）、原生热带森林（90份）、湖畔地带（42份）以及耕作/农田区域（227份）。EPF检测呈阳性的样品地理坐标详情见补充表1。

在524份土壤样品中，500份仅使用CTC培养基进行分析，24份同时采用三种分离方法（Galleria-诱饵法、Tenebrio-诱饵法和选择性CTC培养基）进行分析，以便评估这些方法的相对效率。总共从524份样品中分离出51株昆虫病原真菌（41株为Metarhizium属，10株为Beauveria属）（图1）。部分分离株的显微形态特征见图2。所有真菌菌株均来自草地或农田（补充表1）。结果表明，Metarhizium属的检出率高于Beauveria属（

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讨论

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自然和农业土壤生境是虫生真菌的典型生存环境22 以及一个优秀的天然储存库。在本研究中，探讨了两种昆虫病原真菌（EPF）分离方法，即使用昆虫诱饵与选择性培养基的方法。分离的第一步是土壤样品的采集。土壤样品的妥善保存和准确鉴定至关重要。有关纬度、经度、土壤类型和生物群落的信息对于涉及流行病学、模型构建和地理空间分析的研究具有重要意义。23,24采集后，建议尽快处理样品（最好在7天内），因为这些土壤样品中分生孢子的活力会随时间逐渐下降。采用CTC法分离EPF的关键步骤包括：a）在培养后1周和2周时观察CTC平板（前几周至关重要，因为后期其他真菌菌落可能抑制EPF的生长）；b）根据菌落的宏观形态准确鉴定EPF菌落 以及微形态学。使用昆虫诱饵进行分离时，必须保持土壤样品湿润，但不可将其浸泡在水中。

多项研究报道的结果表明，M. anisopliae 在农田土壤中的分布比在自然生态系统中更为常见

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致谢

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本研究部分由巴西高等教育人员进修协调机构（CAPES）资助，资助编号001，里约热内卢州卡洛斯·查加斯·菲略研究资助基金会（FAPERJ）（项目编号E-26/010.001993/2015）以及巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高压灭菌器Phoenix Luferco9451
生物安全柜Airstream ESCOAC2-4E3
氯霉素Sigma-AldrichC0378
气候箱EletrolabEL212/3
盖玻片RBR3871
放线菌酮Sigma-AldrichC7698
Drigalski 玻棒Marienfeld1800024
GPS 应用程序Geolocation app2.1.2005
乳酸酚蓝溶液Sigma-Aldrich61335
显微镜Zeiss Axio star plus1169 149
显微镜相机Zeiss Axiocam 105 color426555-0000-000
显微镜软件Zen lite Zeiss 3.0
载玻片Olenk5-7105-1
微量离心管BRANDZ336769-1PAK
培养皿KasviK30-6015
移液器吸头VattenVT-230-200C/VT-230-1000C
移液器HTL - LabmateproLMP 200 / LMP 1000
塑料花盆Prafesta descartáveis8314
聚丙烯袋Extrusa38034273/5561
马铃薯葡萄糖琼脂KasviK25-1022
Prism 软件 9.1.2Graph Pad
铲子Tramontina77907009
Tenebrio molitorSafariQP98DLZ36
噻苯唑Sigma-AldrichT8904
吐温 80Vetec60REAVET003662
涡旋振荡器BiomixerQL-901
酵母提取物KasviK25-1702

参考文献

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  1. Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
  2. do Nascimento Silva, J., et al.

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CTC

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