土壤样品中昆虫病原真菌分离方法的比较

摘要

从热带土壤样品中分离昆虫病原真菌菌落 Tenebrio 诱饵， 大蜡螟 诱饵，以及选择性人工培养基，即.添加氯霉素、噻苯咪唑和环己酰亚胺的酵母提取物增强马铃薯葡萄糖琼脂（CTC 培养基）。

摘要

本研究旨在比较使用昆虫诱饵与人工选择性培养基从土壤样品中分离昆虫病原真菌（EPF）的有效性。土壤是包括EPF在内的多种微生物的丰富生境，其中EPF主要属于Metarhizium和Beauveria属，能够调控节肢动物害虫。目前市场上已有基于真菌的生物产品，主要用于农业节肢动物害虫的防治。然而，尽管全球具有高度的特有生物多样性，目前在全球商业生物制品中应用的菌株却仅有少数。在本研究中，将524份土壤样品接种于添加酵母提取物并补充氯霉素、噻苯咪唑和放线菌酮的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（CTC培养基）上进行培养。连续观察真菌菌落生长情况达3周。所有Metarhizium和Beauveria属EPF均通过形态学方法鉴定至属水平，部分分离物还进行了分子水平的种级鉴定。从这524份土壤样品中另选取24份，采用昆虫诱饵法（Galleria mellonella和Tenebrio molitor）检测EPF的存在情况。共分离得到51株EPF菌株（41株Metarhizium spp. 和10株Beauveria spp.），所有真菌菌株均来自农田或草地土壤。在用于比较的24份样品中，采用Galleria诱饵法检测EPF阳性率为91.7%，采用Tenebrio诱饵法为62.5%，而使用CTC培养基仅为41.7%。研究结果表明，利用昆虫诱饵法从土壤中分离EPF比使用CTC培养基更为高效。分离方法的比较结合EPF的鉴定与保藏，有助于增进对生物多样性的认知。EPF菌种资源的丰富将促进科学研究与技术创新。

引言

土壤是多种微生物的来源，包括昆虫病原真菌（EPF）。这类真菌因其能够定殖并常常导致节肢动物宿主（尤其是昆虫）死亡而被认知¹。在完成分离、鉴定、毒力菌株筛选和注册后，EPF可被大规模生产用于节肢动物害虫的防治，这体现了其重要的经济价值²。因此，EPF的分离被认为是开发生物杀虫剂的第一步。Beauveria spp.（肉座菌目：线虫草科）和 Metarhizium spp.（肉座菌目：麦角菌科）是目前用于节肢动物害虫防治中最常见的真菌种类³。EPF已成功从土壤、表现出明显真菌感染症状的节肢动物、被定殖的植物以及植物根际中分离获得^4,5。

分离胞内菌真菌（EPF）也有助于研究该特定类群的多样性、分布及生态学特性。近期文献报道指出，EPF的应用价值被低估，列举了EPF的一些非常规用途，例如促进植物生长⁴、去除土壤中的有毒污染物以及在医学领域的应用⁶。本研究旨在比较利用昆虫诱饵与人工培养基从土壤中分离EPF的效率^7,8,9。使用大蜡螟Galleria mellonella L.（鳞翅目：螟蛾科）作为昆虫诱饵来分离EPF已被广泛接受。这些幼虫被全球科学界普遍用作研究宿主-病原体相互作用的实验模型^10,11。Tenebrio molitor L.（鞘翅目：拟步甲科） 幼虫也被视为另一种适用于毒力研究及EPF分离的昆虫模型，因为该昆虫易于在实验室条件下以较低成本进行饲养^7,12。

无需培养的方法（例如使用多种PCR技术）可用于检测和定量其基质（包括土壤）上的昆虫病原真菌（EPF）^13,14。然而，为了正确分离这些真菌菌落，应将其基质接种到选择性人工培养基上⁹，或利用敏感昆虫作为诱饵捕获样品中存在的真菌¹⁵。一方面，CTC是一种不含多宁的培养基，由添加酵母提取物的马铃薯葡萄糖琼脂组成，并补充氯霉素、噻苯咪唑和放线菌酮。该培养基由Fernandes等.⁹开发，旨在最大化从土壤中回收天然存在的Beauveria spp. 和Metarhizium spp.。另一方面，G. mellonella 和 T. molitor 幼虫也可成功用作诱饵，从土壤中获得EPF分离株。然而，据Sharma等¹⁵报道，同时使用并比较这两种诱饵昆虫的研究较少。在葡萄牙葡萄园土壤中，使用T. molitor 幼虫比使用G. mellonella幼虫显著提高了Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin 的回收率；相反，Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill 的分离则与使用G. mellonella诱饵相关¹⁵。因此，选择哪种EPF分离方法（即G. mellonella诱饵法、T. molitor诱饵法 或CTC培养基）应根据研究目标和实验室基础设施进行考虑。本研究的目的是比较使用昆虫诱饵与人工选择性培养基从土壤样品中分离EPF的有效性。

方案

由于本研究涉及巴西遗传资源，已在国家遗传资源及关联传统知识管理系统（Sisgen）注册，注册号为 AA47CB6。

1. 土壤采样

1. 使用小铲子采集800 g土壤（可含或不含伴生的次生植物根系），采样深度为10 cm。将样品置于聚丙烯袋中，室温保存，直至实验开始。
   ​注意：由于已有报道表明内生真菌（EPF）具有根际定殖能力，因此也可同时采集细小根系。样品应尽快处理，因为真菌孢子的活力可能随时间推移而降低。在本研究中，所有样品均在采集后7天内完成分析。
2. 使用GPS记录所采集样品的地理坐标（经纬度），并根据土壤类型对采样区域进行分类（例如草地、原始雨林、湖岸或农田）。

2. 昆虫病原真菌的分离方法

1. 使用CTC选择性人工培养基进行分离。
   1. 配制CTC培养基[马铃薯葡萄糖琼脂加酵母提取物（PDAY），添加0.5 g/L氯霉素、0.001 g/L噻苯咪唑和0.25 g/L放线菌酮⁹]时，分别称取所有试剂，溶于蒸馏水中，并在高压灭菌器中对培养基进行灭菌。在生物安全柜中，将23 mL培养基倒入60 mm × 15 mm的培养皿中。
      注意：称量CTC试剂时应穿戴实验服、口罩、手套和护目镜，因为放线菌酮和氯霉素具有毒性。
   2. 称取每份土壤样品（含或不含根系）0.35 ± 0.05 g，并置于1.5 mL微量离心管中。
   3. 在生物安全柜中，向含有土壤的微量离心管中加入1 mL无菌的0.01%（体积比）聚氧乙烯山梨醇单油酸酯水悬液，涡旋振荡30秒。
   4. 吸取50 µL上清液，滴加至含CTC培养基的培养皿中央，使用无菌Drigalski刮刀（直径6 mm）将悬液均匀涂布于培养基表面。
      注意：每份土壤样品应至少制备三个重复。
   5. 将培养皿置于气候培养箱中（25 ± 1 °C，相对湿度≥80%），避光培养，并在培养7、14和21天后观察真菌菌落的生长情况。
   6. 观察真菌菌落的大形态和微形态特征，寻找虫生真菌（EPF）。将EPF菌落转移至添加0.05%氯霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDAC）上，直至获得纯培养物。
      注意：使用下文第3步中提供的描述性鉴定特征进行EPF菌落的鉴定。
2. 使用昆虫诱饵法进行分离
   1. 使用表面消毒的G. mellonella和T. molitor末龄幼虫。将幼虫浸入0.5%次氯酸钠溶液中1分钟以进行灭菌，随后用无菌水清洗两次。
      注意：本研究中使用的是四龄期的G. mellonella幼虫。T. molitor的幼虫阶段未作标准化。
   2. 使用塑料培养盒组装诱饵。向每个塑料盒（98 mm宽 × 47 mm高 × 142 mm长）中加入250 g采集的土壤。将每种昆虫（T. molitor和G. mellonella）各15头幼虫分开，每盒放入5头幼虫。将培养盒置于25 ± 1 °C、相对湿度≥80%的黑暗环境中培养。
      注意：在培养盒盖上钻10个直径为2 mm的小孔以利于通风。可使用加热的尖头金属工具进行打孔。
   3. 每隔一天将土壤混匀一次，以使幼虫与土壤充分接触。
      注意：湿度对真菌感染幼虫至关重要。为维持土壤湿度，必要时可在土壤表面喷洒无菌蒸馏水，但切勿将土壤样品浸泡在水中。
   4. 每天检查培养盒，寻找死亡的昆虫。
      注意：应每日观察培养盒中存活幼虫是否出现无脊椎动物病理症状，以确保昆虫未被感染。作为替代方案，可在实验中设置含无菌土壤的对照组培养盒，以监测昆虫幼虫的健康状况。
   5. 取出死亡的昆虫，用0.5%次氯酸钠溶液表面灭菌1分钟，然后将灭菌后的昆虫置于湿度≥80%的保湿环境中，在25 ± 1 °C下培养7天，以促进虫生真菌的体表生长（真菌病）。
   6. 出现真菌病后，从昆虫体表收集分生孢子。在体视显微镜下，使用微生物接种环将分生孢子接种至PDAC培养基上。也可将整条感染的幼虫直接放置于PDAC培养基上。将培养皿置于气候培养箱中，在25 ± 1 °C、相对湿度≥80%条件下培养。
   7. 观察培养皿上真菌菌落的大形态和微形态特征，确认其是否为虫生真菌（EPF）。在PDAC培养基上反复继代培养，直至获得纯菌落。
      ​注意：使用下文第3步中提供的描述性鉴定特征进行EPF菌落的鉴定。

3. EPF（Metarhizium spp. 和 Beauveria spp.）的鉴定

1. 在25 ± 1 °C、相对湿度≥80%条件下培养14天后，分析平板上真菌培养物的宏观形态特征（即菌落的表面和背面、形状、边缘、生长速率、颜色、质地、可扩散色素、渗出物及气生分生孢子）。
2. 将气生分生孢子转移至载片培养（微培养技术）¹⁶ 在25 ± 1 °C、相对湿度≥80%的条件下培养3天，用乳酚蓝染色以观察显微特征（即分生孢子的排列方式、分生孢子梗、分生孢子的形状和大小）^17,18,19,20.
3. 使用光学显微镜在400倍下观察真菌的微观结构，以确认杀虫真菌（EPF）的鉴定。
   注意：EPF 的形态学鉴定依据已在 Bischoff 等、Rehner 等、Seifert 等以及 Humber 的报告中描述。^17,18,19,20菌落的宏观和微观形态是鉴定丝状真菌属级分类最常用的标准。不同种类的虫生真菌（EPF）其形态特征会有所差异。Humber²⁰ 提供了主要昆虫病原真菌属的鉴定检索表。 绿僵菌 spp. 菌落通常呈圆形、粉状，呈现不同深浅的绿色，并可产生渗出物。显微镜下观察，这些菌落的分生孢子梗广泛分枝、紧密交织，其顶端具有产孢细胞，形成致密的子实层；分生孢子呈圆柱形至椭圆形，以平行排列的链状结构组成柱状或板状团块。 球孢白僵菌 菌落通常为白色，呈粉状或棉絮状。其产孢细胞基部膨大，向顶端呈之字形延伸。 球孢白僵菌 分生孢子梗形成密集的球形分生孢子簇。需通过分子分析才能将昆虫病原真菌鉴定到种的水平。
4. 对分离物进行分子分析，以实现物种水平的分类学鉴定。对于本研究中分离的杀虫真菌菌株，即 绿僵菌 种（spp.）和 球孢白僵菌 spp.，根据 Bischoff 等人的报告进行分子分析。¹⁷ 和 Rehner 等人¹⁸.
5. 在确认分离株为虫生真菌（EPF）后，将分离株保藏于菌种保藏中心 真菌培养物。在本研究中，分离株已保存于昆虫病原真菌培养物保藏 collection 中 里约热内卢联邦农村大学微生物控制实验室（LCM）。

结果

2015年至2018年间，在巴西里约热内卢州的草原地区共采集了524份土壤样品，包括畜牧牧场（165份）、原生热带森林（90份）、湖畔地带（42份）以及耕作/农田区域（227份）。EPF检测呈阳性的样品地理坐标详情见补充表1。

在524份土壤样品中，500份仅使用CTC培养基进行分析，24份同时采用三种分离方法（Galleria-诱饵法、Tenebrio-诱饵法和选择性CTC培养基）进行分析，以便评估这些方法的相对效率。总共从524份样品中分离出51株昆虫病原真菌（41株为Metarhizium属，10株为Beauveria属）（图1）。部分分离株的显微形态特征见图2。所有真菌菌株均来自草地或农田（补充表1）。结果表明，Metarhizium属的检出率高于Beauveria属（

讨论

自然和农业土壤生境是虫生真菌的典型生存环境²² 以及一个优秀的天然储存库。在本研究中，探讨了两种昆虫病原真菌（EPF）分离方法，即使用昆虫诱饵与选择性培养基的方法。分离的第一步是土壤样品的采集。土壤样品的妥善保存和准确鉴定至关重要。有关纬度、经度、土壤类型和生物群落的信息对于涉及流行病学、模型构建和地理空间分析的研究具有重要意义。^23,24采集后，建议尽快处理样品（最好在7天内），因为这些土壤样品中分生孢子的活力会随时间逐渐下降。采用CTC法分离EPF的关键步骤包括：a）在培养后1周和2周时观察CTC平板（前几周至关重要，因为后期其他真菌菌落可能抑制EPF的生长）；b）根据菌落的宏观形态准确鉴定EPF菌落 以及微形态学。使用昆虫诱饵进行分离时，必须保持土壤样品湿润，但不可将其浸泡在水中。

多项研究报道的结果表明，M. anisopliae 在农田土壤中的分布比在自然生态系统中更为常见

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高压灭菌器	Phoenix Luferco	9451
生物安全柜	Airstream ESCO	AC2-4E3
氯霉素	Sigma-Aldrich	C0378
气候箱	Eletrolab	EL212/3
盖玻片	RBR	3871
放线菌酮	Sigma-Aldrich	C7698
Drigalski 玻棒	Marienfeld	1800024
GPS 应用程序	Geolocation app	2.1.2005
乳酸酚蓝溶液	Sigma-Aldrich	61335
显微镜	Zeiss Axio star plus	1169 149
显微镜相机	Zeiss Axiocam 105 color	426555-0000-000
显微镜软件	Zen lite Zeiss 3.0
载玻片	Olen	k5-7105-1
微量离心管	BRAND	Z336769-1PAK
培养皿	Kasvi	K30-6015
移液器吸头	Vatten	VT-230-200C/VT-230-1000C
移液器	HTL - Labmatepro	LMP 200 / LMP 1000
塑料花盆	Prafesta descartáveis	8314
聚丙烯袋	Extrusa	38034273/5561
马铃薯葡萄糖琼脂	Kasvi	K25-1022
Prism 软件 9.1.2	Graph Pad
铲子	Tramontina	77907009
Tenebrio molitor	Safari	QP98DLZ36
噻苯唑	Sigma-Aldrich	T8904
吐温 80	Vetec	60REAVET003662
涡旋振荡器	Biomixer	QL-901
酵母提取物	Kasvi	K25-1702