一种测量大鼠视觉功能的新型视动反应检测方法

摘要

视动性眼震（OKN）行为检测方法用于评估啮齿类动物的视力。本文展示了一种简单的方法，可在研究实验室中轻松建立，以对正常和实验大鼠的视觉功能进行可靠评估。

摘要

视动性眼震（OKN）是由视野中视觉刺激运动引发的一种反射性眼球运动。与OKN相关联的头部追踪运动常被用作评估啮齿类动物视觉功能的指标。为了记录正常和实验大鼠的OKN反应，已开发出一种简单且低成本的装置。该装置使用两块平板屏幕来显示视动性眼震视觉刺激，刺激内容为高对比度黑白条纹，条纹由免费提供的“OKN Stripes Visualization Web Application”软件生成。大鼠被放置在一个透明的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglass）固定装置内，以限制 其 活动，确保大鼠头部始终面向OKN显示屏幕。可通过调节大鼠固定装置的位置，改变大鼠与显示屏幕之间的距离。在固定装置上方设置一个微型摄像机，用于记录大鼠的视觉活动。这些录像可用于进行定量评估。根据是否存在清晰的头部追踪运动，可判定不同空间频率下的OKN反应。所收集的数据展示了一种可靠测量正常大鼠及视网膜变性大鼠视力的新技术。

引言

当眼睛暴露于持续的全视野视觉运动时，会出现一种特定模式的眼球快速平滑追踪运动以及低加速度的头部运动，其方向与视觉运动方向一致，这种现象称为视动性眼震（optokinetic nystagmus, OKN）^1,2。OKN 的神经通路从视网膜开始，经外侧膝状体、枕叶皮层，最终到达小脑绒球，并与眼动神经元相连接³。该神经通路中任何部位的神经损伤都可能导致 OKN 反应的改变。临床上，OKN 反应被用作评估大脑对称性、心因性失明以及人类患者视力敏锐度的工具^4,5。通过量化功能反应来评估视敏度，对于判断以恢复神经退行性疾病所致视力丧失为目标的治疗和实验的成功与否具有重要意义^3,6,7。在动物模型中，OKN 反应可用于精确评估视敏度，使研究人员能够获取有关视觉功能的定量与定性数据。在啮齿类动物中，可通过顺时针和逆时针方向旋转条纹图案，独立测量左眼和右眼的视敏度⁸。逆时针和顺时针运动分别使每只眼睛暴露于鼻侧至颞侧（N-T）或颞侧至鼻侧（T-N）的运动刺激⁹。由于啮齿类动物对来自后方或侧方的潜在威胁更为敏感，因此 T-N 刺激引发的反应显著强于 N-T 刺激。

既往研究采用不同的视动性眼震（OKN）检测方法对正常实验大鼠和视网膜变性大鼠的视觉功能进行了测试^{6,10,11,12,13}。然而，不同研究之间观察到视觉敏锐度评分存在一定的变异性，包括本研究中所展示的数据。这种变异性主要归因于所使用的检测装置的差异。检测环境的尺寸以及所采用的OKN视觉刺激类型^6,10可能是主要影响因素。这些实验中使用的刺激包括 用于呈现虚拟圆柱体的正弦光栅¹⁴、可更换的旋转圆柱体¹⁵，以及在四台计算机显示器上呈现的高对比度（黑白）条纹¹⁰。与这些OKN检测设备和方法相关的主要局限性包括设备体积较大、动物在检测区域内的活动，以及动物频繁从检测平台跌落^7,11,12。

为了尽量减少上述局限性，研究人员开发了一种用于大鼠OKN检测的新装置。该装置成本相对较低，已被证明高效、易于操作，并可实现视觉功能的评估（图1）。该装置采用两个平板屏幕，以不同空间频率显示OKN视觉刺激（可视化软件）。测试过程中使用微型摄像机记录动物活动，以便后续数据分析。为了便于在科研实验室中快速搭建OKN装置，本研究提出了一种对现有OKN测试装置的关键改进方案。此处使用的OKN刺激由不同空间频率、不同旋转方向（从左到右或从右到左）的黑白条纹组成。OKN测试装置的主要组成部分包括两个触控平板屏幕（7.9英寸），用于显示OKN刺激（图2）。两个可调节支架用于固定平板屏幕至所需位置。支架牢固地安装在实验台边缘，可调节高度和角度。大鼠被置于一个面向显示屏的固定装置中。该固定装置由透明塑料（聚甲基丙烯酸甲酯）管制成。固定管连接在底座和金属支架上，以确保在实验台上稳定放置。固定管的尺寸根据所用大鼠的体型而定，长度为4至6英寸，直径为2.5至3英寸。通过调整大鼠固定装置的位置，可调节大鼠与显示屏之间的距离。该固定装置有助于使大鼠头部持续面向显示屏，并减少其在测试过程中的移动。使用微型摄像机记录头部追踪反应。该新装置的不足之处包括屏幕刷新率不同，以及使用窄条纹时可能出现视觉错觉 。然而，这些 可被视为 基于计算机的OKN装置常见的问题。除上述问题外，在当前装置中，大鼠未使用虚拟圆柱体¹⁴进行测试，这可能影响最佳OKN反应。该方法的创新之处在于其技术本身及所采用的装置。该技术可在科研实验室中轻松搭建，用于啮齿类动物视觉敏锐度的可靠测量。

方案

所有动物实验均遵循经地区主管部门批准并由南加州大学（USC）机构动物护理和使用委员会（IACUC）认可的实验指南，同时符合视力与眼科学研究协会（ARVO）关于动物在眼科和视觉研究中使用的声明以及欧盟关于用于科学目的动物保护的指令2010/63/EU。

注意：本研究中使用的大鼠为有色系视网膜变性皇家外科学院（RCS）大鼠和朗格汉斯（LE）大鼠。图3 展示了OKN测试与分析不同阶段的示意图。

1. 实验步骤

1. 实验装置的准备
   1. 将大鼠置于笼中，在测试房间内放置30分钟，期间关闭房间灯光。
      注意：这有助于最小化运输过程中产生的应激反应，并为所有实验提供一致的光照条件。
   2. 将两个平板屏幕相对放置，夹角为155°，用于显示OKN条纹可视化网络应用程序。
   3. 将大鼠固定装置置于两个平板屏幕正中间，距离中心4.5英寸处。
      注意：在此位置，大鼠头部距离显示屏约3.5英寸。
   4. 点击平板桌面上的OKN Stripes Visualization Web Application，以显示视觉刺激（黑白条纹），从最低空间频率开始。
      注意：使用0.08、0.15、0.2、0.24、0.28、0.33、0.38 周/度（c/d）的空间频率，从最低频率（0.08 c/d）逐步升高至最高频率（0.38 c/d）。在每个空间频率下，均需测试条纹顺时针和逆时针旋转方向（各1分钟）。
2. OKN测试流程
   1. 选择合适尺寸的大鼠固定装置。
   2. 将大鼠移至固定装置开口处，并小心引导其进入内部。
   3. 在开始测试前，让大鼠在固定装置内适应1-2分钟。
      注意：通过适当操作，大多数情况下可使大鼠保持在固定装置内；必要时可将固定装置抬高（离桌面最高2英尺）数秒，直至大鼠安静下来。高度带来的恐惧感可减少大鼠试图爬出固定装置的倾向。如需更多时间，可额外给予1-2分钟让大鼠适应。
   4. 将固定装置的底座插入金属支架中，以确保稳定放置。
      注意：该设置允许调节大鼠与平板屏幕之间的观察距离。
   5. 打开摄像机，开始视频录制。
   6. 点击平板屏幕桌面上的OKN Stripes Visualization Web Application，启动程序。
   7. 运行从左到右或从右到左方向的OKN刺激。
      注意：条纹顺时针旋转激活左眼，逆时针旋转激活右眼。初始旋转方向随机选择，以避免可能的习惯化效应。
   8. 观察大鼠的头部追踪行为。
   9. 使用最低空间频率（0.08 c/d）开始测试，随后逐步按升序增加空间频率。
   10. 注意记录是否存在OKN反应。
   11. 继续测试，不同空间频率之间不设置休息间隔。
   12. 完成所有空间频率测试后停止视频录制，并使用大鼠编号保存数据。
   13. 将大鼠从固定装置中取出，放回笼中，连续测试之间给予约30分钟的休息时间。
   14. 每只大鼠重复测试三次。

2. 数据分析

1. 回看录制的视频，通过确定大鼠产生反应的空间频率来评估每只大鼠的视敏度。
2. 在电子表格中记录所有反应（是否存在明显的头部追踪行为）。
3. 从三次测试中找出大鼠产生反应的最高空间频率，该值即为最终的视敏度。
   注意：由于视敏度测量具有主观性，数据将由两名独立的研究人员进行评估，以确认每只大鼠的视敏度评分¹²。结果将交叉核对，直至达成一致的最终评分。阳性OKN反应定义为存在明显且持续的头部追踪活动；随机的头部运动（与OKN视觉刺激无关）或无任何头部运动则被视为阴性OKN反应。
4. 进行统计分析，以比较不同组之间或双眼之间（左眼 vs 右眼）的差异。
   注意：根据需要回看视频记录，以明确阳性或阴性反应的判定。

结果

使用视网膜变性（RD）皇家外科学院（RCS）大鼠以及年龄匹配的正常Long Evans（LE）大鼠进行OKN检测。LE大鼠（n = 4）用于建立基线数据，以利用新装置确定正常大鼠的视敏度评分。统计分析使用Microsoft Excel进行（均值 ± 标准差）。LE大鼠在空间频率为0.15 c/d至0.33 c/d时表现出强烈的头部追踪反应。为评估新OKN装置在测量RD大鼠视敏度方面的可靠性与有效性，在出生后（P）35天至P100期间的五个不同时间点对RCS大鼠（n = 9）进行了测试（图4）。RCS大鼠在P50之前表现出强烈且持续的头部追踪反应。P50之后，视敏度出现显著下降。P80之后，RCS大鼠的视觉敏感性急剧降低。P100之后，RCS大鼠的视觉功能严重受损，即使在低空间频率下也未观察到头部追踪反应。在较晚时间点测试时，RCS大鼠仅表现出微弱且随机的头部追踪反应。RCS大鼠双眼的视敏度下降模式进展相似。使用该新装置进行的OKN测试还提示，大鼠的视敏度可能受到视觉刺激与大鼠眼睛之间距离的影响。在使用LE大鼠进行的初步实验中，当大鼠头部距离显示屏约3.5英寸时，可观察到强烈的O...

讨论

视动性眼震（OKN）是眼睛对漂移刺激产生的一种反射性锯齿状运动，可用于评估人类受试者的视力敏锐度³。在包括灵长类和啮齿类动物在内的动物中，OKN测试被用作视觉功能的定量测量手段。本研究描述了一种新型且低成本的OKN装置，可在研究实验室中轻松搭建，用于大鼠的OKN行为测试。啮齿类动物的OKN评估已通过不同方法实现。此前，曾使用连接电机的可更换OKN转鼓来旋转光栅刺激⁶。最近，则采用计算机屏幕显示视觉刺激进行OKN测试¹⁰，包括编程生成虚拟圆筒图像的方法¹⁴。多种商业化的OKN测试设备已被不同研究者用于评估正常及视网膜变性动物模型中的视觉功能变化^16,17,18。将动物置于配备四个显示OKN刺激的计算机屏幕的测试舱内，即可测量其视力敏锐度

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
iPad Mini	Apple	A1489	使用两台 iPad Mini 显示 OKN Stripes 可视化软件。
微型相机/微型相机附件	Lanon	B097H6WWDS	微型相机用于记录实验过程。微型相机附件连接至桌面，固定相机使其对准大鼠。头部追踪反应在不同距离、空间频率和方向下进行记录和评估。
有机玻璃管/大鼠固定装置	Best Acrylics	B07KMF31MC	有机玻璃管用于在实验期间固定大鼠，使其头部暴露在外。该管通过连接另一个垂直的有机玻璃管附件，以在实验过程中稳定大鼠固定装置。整个装置由实验室自行设计和制作。
有机玻璃管附件	Best Acrylics	B07KMF31MC	该附件用于将大鼠固定装置置于 iPad 屏幕前方，并可调节大鼠与 iPad 之间的距离。
屏幕支架	Kabcon	B08JLRPKQ1	使用两个屏幕支架将 iPad 竖直固定，以便向大鼠呈现 OKN Stripes 可视化软件。
OKN Stripes 可视化网页应用程序	The MIT License (MIT) Copyright (c) 2016 Anton Yakushin	https://antonyakushin.github.io/okn-stripes-visualization/	该应用程序为免费提供的软件，可用于以不同频率显示视觉刺激（黑白条纹）。