记录间隙连接电流 非洲爪蟾 卵母细胞

摘要

本文介绍了一种在Xenopus卵母细胞中表达间隙连接蛋白，并利用专为双卵母细胞电压钳记录设计的商用放大器，以高侧电流测量模式记录两个相邻卵母细胞之间连接电流的实验方案。

摘要

在Xenopus卵母细胞中异源表达连接蛋白（connexins）和无脊椎动物连接蛋白（innexins）是研究缝隙连接（gap junctions, GJs）生物物理特性的有力方法。然而，该方法在技术上具有挑战性，因为它需要对两个共用同一接地端的相对卵母细胞进行差分电压钳制。尽管已有少数实验室成功实现了该技术，但基本上所有这些实验室均使用自制放大器或专为单卵母细胞记录设计的商用放大器，这使得其他实验室难以推广应用。尽管一种高侧电流测量模式已被整合到用于双卵母细胞电压钳记录的商用放大器中，但在我们最近的研究之前，尚未有关于其应用的报道。我们通过引入多项技术改进，使高侧电流测量方法更加实用和便捷，这些改进包括：构建基于磁力的记录平台，以实现卵母细胞及各种电极的精确定位；利用浴液作为电压差分电极中的导电介质；采用商用低泄漏KCl电极作为参考电极；使用薄壁玻璃毛细管制作电流和电压电极；以及利用基于磁力的装置对所有电极进行定位。本文所述方法可方便且稳定地记录两个相对的Xenopus卵母细胞之间的连接电流（I_j）。

引言

间隙连接（GJs）是细胞间的通道，可能允许电流流动以及相邻细胞间小分子细胞质物质的交换。它们存在于多种细胞类型中，并执行多样的生理功能。脊椎动物中的间隙连接由连接蛋白（connexins）构成，而无脊椎动物中的间隙连接则由innexins构成。每个间隙连接由两个相对的半通道组成，每个半通道含有6个或8个亚基，具体数目取决于其为连接蛋白还是innexins^1,2,3。人类具有21个连接蛋白基因⁴，而常用的无脊椎动物模型秀丽隐杆线虫（C. elegans）和黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）分别具有25个和8个innexin基因^5,6。基因转录本的可变剪接可能进一步增加间隙连接蛋白的多样性，至少在innexins中如此^7,8。

根据分子组成，间隙连接（GJ）可分为三类：同型、异型和杂合型。同型GJ的所有亚基均相同。异型GJ包含两个同源半通道，但这两个半通道由两种不同的GJ蛋白构成。杂合型GJ至少包含一个杂合半通道。GJ的分子多样性可能赋予其不同的生物物理特性，这些特性对其生理功能具有重要意义。GJ的生物物理特性也受到调节蛋白的调控⁹。为了理解GJ如何执行其生理功能，了解其分子组成、生物物理特性以及调节蛋白在其功能中所起的作用至关重要。

异源表达系统常用于研究离子通道（包括间隙连接通道，GJs）的生物物理特性以及调控蛋白对它们的影响。由于异源表达系统能够特异性表达目标蛋白，因此通常比天然组织更易于解析蛋白功能——在天然组织中，具有冗余功能的蛋白可能使分析复杂化，且难以记录到 I_j。遗憾的是，除 Neuro-2A 细胞外，大多数常用细胞系因内源性连接蛋白（connexins）的干扰而不适合用于研究 GJ 的生物物理特性。即使 Neuro-2A 细胞也并非总是适用于此类分析。例如，我们在转染了 innexin 蛋白 UNC-7 和 UNC-9 的 Neuro-2A 细胞中，无论是否存在 UNC-1（未发表数据），均未能检测到任何 I_j；而 UNC-1 是 C. elegans 中 UNC-9 GJ 功能所必需的^9,10。另一方面，Xenopus 卵母细胞是进行 GJ 电生理分析的一种有效替代系统。尽管该细胞表达内源性 GJ 蛋白 connexin 38（Cx38）¹¹，但通过注射特异性反义寡核苷酸可轻松避免潜在干扰¹²。然而，利用 Xenopus 卵母细胞进行 GJ 分析需要对两个相邻细胞实施双电压钳制，技术上具有挑战性。对蛙类卵裂球进行双电压钳制的最早成功报道距今已有约 40 年^13,14。此后，许多研究采用该技术在成对的 Xenopus 卵母细胞中记录 I_j。然而，几乎所有先前的研究均使用自制放大器^12,15,16 或专为单个卵母细胞记录设计的商用放大器（GeneClamp 500、AxoClamp 2A 或 AxoClamp 2B，Axon Instruments，Union City，CA）^{8,17,18,19,20}。由于即使是商用放大器也未提供双卵母细胞电压钳制的操作说明，因此对于新手或电生理技术不够成熟的实验室而言，实施该技术往往颇具挑战性。

目前仅有一种商用放大器专为双卵母细胞电压钳技术开发，即 Warner Instruments 公司生产的 OC-725C材料表, 图1A）。该放大器可根据其电压探头上的两个插孔是否连接，选择标准模式（用于单个卵母细胞）或高侧电流测量模式（用于单个或双卵母细胞）。图1B，C）。然而，直到我们最近的研究⁷，尚未有任何出版物描述过该放大器在其高端电流测量模式下的应用。尽管另一实验室曾使用该放大器进行双卵母细胞记录，但其使用的是标准模式而非高端模式。^21,22这种缺乏使用放大器高侧电流测量模式的报道可能是由于技术上的困难所致。我们曾按照制造商的说明，尝试采用高侧模式进行双卵母细胞记录，但未能获得稳定的记录结果。多年来，我们尝试了三种不同的双卵母细胞记录方法，包括使用两台OC-725C放大器在高侧电流测量模式下工作、使用两台OC-725C放大器在标准模式下工作，以及使用另一厂商的两台放大器。经过大量反复试验，我们最终仅在第一种方法下成功获得了稳定的记录。本文描述并演示了我们用于在卵母细胞中表达GJ蛋白的实验流程 非洲爪蟾 卵母细胞，记录 我_j 使用高侧电流测量模式，并利用常用的商业软件分析电生理数据。有关双电压钳技术的更多信息可参见其他出版物^19,23.

方案

手术操作遵循康涅狄格大学医学院机构动物护理委员会批准的方案进行。

1. 青蛙手术及去滤泡卵母细胞的制备

1. 麻醉一只成年雌性非洲爪蟾（*Xenopus laevis*）Xenopus laevis) (材料表通过浸入冰冷（含冰）的三卡因溶液（~300 mg/L）中进行麻醉。
2. 等待约15分钟，直至青蛙对其脚蹼受挤压无明显或无任何反应。将青蛙仰卧置于手术台上。
3. 在左侧或右侧下腹部做一个纵向切口（8–10 mm长），用镊子轻轻拉出一小块卵巢组织，再用小剪刀将卵巢组织剪下。
4. 立即将游离的卵巢组织浸入含钙的溶液中²⁺-无ND96溶液（NaCl 99 mM，KCl 2 mM，MgCl₂ 1 mM，HEPES 5 mM，pH 7.5）₂ 1 mM，HEPES 5 mM，pH 7.5）置于60 mm培养皿内。
5. 使用5-0丝线进行单纯间断缝合关闭切口后（材料表将青蛙放回浅水缸中以恢复。
   注意：切口分两步闭合：先缝合腹膜层和肌肉层，然后缝合皮肤层。每只青蛙接受5次手术，连续两次手术之间至少间隔4周。
6. 将分离的卵巢组织转移至含有10 mL Ca的50 mL离心管中²⁺无 ND96 溶液，含 20 mg 胶原酶（材料表）和20 mg透明质酸酶（hyaluronidase）材料表).
7. 在室温（RT）下，将试管置于旋转摇床中振荡，直至所有卵母细胞均分离（单个存在）。
8. 随后，使用玻璃巴斯德吸管将30–50个卵母细胞转移至培养皿中，并在体视显微镜（最高放大倍数≥25倍）下频繁观察卵母细胞，以判断其是否已去滤泡。
   注意：巴斯德吸管应 "切割" 使用金刚石刻划笔扩大尖端开口材料表）并用火焰灼烧以使切口光滑。
9. 当70%-80%的卵母细胞完成去滤泡后，轻轻倾斜试管，倾去酶溶液。用ND96溶液（NaCl 96 mM，KCl 2 mM，CaCl₂ 1.8 mM，HEPES 5 mM，pH 7.5）将卵母细胞清洗5次，每次加满试管。₂ 1.8 mM MgCl₂₂ 1 mM，HEPES 5 mM，pH 7.5）并倾去溶液。
10. 最后一次洗涤后，将卵母细胞转移至含有 ND96 溶液的 60 mm 培养皿中。用洁净的玻璃巴斯德吸管挑选外观大而健康的卵母细胞，转移至另一含有添加了丙酮酸钠（2 mM）和青霉素-链霉素（100 U/mL）的 ND96 溶液的 60 mm 培养皿中。
    注意： "大而外观健康的卵母细胞" 为V期和VI期的样本，且无酶消化过度的迹象。
11. 将含有已挑选卵母细胞的培养皿放入环境培养箱中（15–18 °C）。

2. 缝隙连接蛋白表达

1. 合成特定连接蛋白（connexin）或缝隙连接蛋白（innexin）的互补RNA（cRNA） 体外 使用RNA转录试剂盒（材料表按照制造商的说明书进行操作。
2. 使用RNA转录试剂盒用户手册中所述的氯化锂方法沉淀cRNA。
3. 用70%乙醇洗涤沉淀，然后将其溶解于20 µL无核酸酶的H₂O，并加入1 µL核糖核酸酶抑制剂（40 U， 材料表).
4. 使用分光光度计测定cRNA的浓度（材料表).
5. 将cRNA与Cx38反义寡核苷酸混合，使终浓度为200-1,000 ng/µL cRNA和100 ng/µL寡核苷酸。
   注意：引物序列为 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3′，对应于 -5 至 +25 位的核苷酸 非洲爪蟾 Cx38 mRNA（NCBI登录号：NM_001088018）¹¹寡聚核苷酸在与cRNA混合前以储存液（2.0 mg/mL）形式保存。
6. 通过微型离心机离心（约16,000 x g）去除cRNA中的颗粒 g）2 分钟，然后用移液器将全部上清液迅速转移至新管中（避免触碰微量离心管底部）。
7. 将cRNA分装成若干份（每管2.5 µL），于-80 °C冰箱中保存。
8. 通过将一小块尼龙网（约 1 cm × 1 cm）粘附于培养皿底部来制备卵母细胞注射用培养皿（材料表使用快干环氧树脂胶将35毫米培养皿底部固定。
   注意：卵母细胞注射皿可重复使用。每次使用后需用70%乙醇清洗。
9. 将ND96溶液（添加丙酮酸钠和青霉素-链霉素）注入卵母细胞注射皿中，液面高度约为皿的一半。
10. 将25-30枚卵母细胞在培养皿内排列成行。
11. 按照自动纳升注射仪的用户手册中的说明，制备用于卵母细胞注射的玻璃微量移液管材料表).
    注意：使用微电极斜面仪（材料表）有助于制备锋利的注射微吸管，从而对卵母细胞造成最小损伤。
12. 用轻质矿物油回填注射微量移液管，并将其插入注射器的微量移液管支架中。
13. 用移液器将储存的分装cRNA转移至培养皿盖或底部的内表面。
14. 按下注射控制器上的 FILL 按钮，将 cRNA 液滴吸入微量移液器的尖端。
15. 注射cRNA（约50 nL/卵母细胞），通过按压 注射 按钮
    注意：注射体积可通过注射器控制器上的拨动开关进行设定。
16. 将已注射的卵母细胞转移至含有ND96溶液（添加丙酮酸钠和青霉素-链霉素）的新培养皿中，置于环境培养箱（15–18 °C）内孵育1–3天（具体时间取决于间隙连接蛋白的表达速度和水平）。每天通过将卵母细胞转移至新的培养皿更换溶液。

3. 卵母细胞配对

1. 将少量已注射的卵母细胞转移至含有 ND96 溶液的 35 mm 培养皿中。
2. 使用两把精细镊子（材料表）轻轻剥离包裹卵母细胞的透明卵黄膜。
   注意：首次使用前及使用过程中需不时用细砂纸（600 目）打磨镊子尖端以使其更锋利。
3. 将两个卵母细胞放入含 ND96 溶液（添加丙酮酸钠和青霉素-链霉素）的卵母细胞配对室的每个孔中（图 1D）。
   注意：卵母细胞配对室的制备方法是用快干环氧胶将微型孔小托盘（材料表）的一小块粘附于 35 mm 培养皿（材料表）底部。微型托盘使用热丝切割器（材料表）切割成小片。利用微型托盘进行卵母细胞配对的方法最初由他人报道²⁴。尽管间隙连接蛋白在卵母细胞膜上的分布可能因其胞内区氨基酸残基的电荷特性而呈现不均匀性²⁵，但通常情况下，随机配对（不区分卵母细胞的动物极与植物极）已足够满足实验需求。
4. 将装有配对卵母细胞的培养皿置于室温下的隔离台上，用于后续电生理记录。
   ​注意：配对时间可从数小时至一天不等。一种便捷的操作方式是在傍晚时分完成卵母细胞配对，并于次日进行记录。

4. 采集系统的准备

1. 通过调节内部拨动开关，将两台OC-725C卵母细胞钳制放大器（材料表）配置为高侧电流测量模式（图1B）。
2. 通过首先连接后板上的接地电路插座，然后将放大器接地至法拉第笼以及用于照亮记录室的光纤光源，实现放大器的接地。
3. 将放大器连接至模数信号转换器（材料表），并根据放大器制造商的说明，在pClamp软件的Clampex模块（材料表）中进行配置。
4. 使用放大器配套的模型细胞测试采集系统。
   1. 将V_DIFF探头和电流（I）电缆连接至模型细胞，使用附带的跳线将V_DIFF探头的红色和黑色插座连接，将跳线任一端连接至模型细胞的任一插针，并将模型细胞中的接地线连接至放大器GROUNDS CIRCUIT插座的电缆（图1E）。
   2. 分别旋转Vm OFFSET和Ve OFFSET旋钮，将放大器的电压电极（Vm）和浴槽电极（Im）表头归零；将钳制模式从OFF切换至Fast或SLOW，顺时针旋转GAIN旋钮至适当水平以实现良好的电压钳制（图1A）。直流增益（D.C. GAIN）开关可置于OUT或IN位置。
   3. 运行一个包含若干电压阶跃的简单采集程序，确认Vm表头显示的电压随采集程序变化，且电压和电流信号在Clampex中正确显示。
      注意：每次仅可测试一台放大器。

5. 记录配对卵母细胞之间的 I_j

1. 创建用于记录的采集方案 我_j 在 pClamp 软件中。
   注意：创建两个采集协议。其中一个使用放大器 #1 来产生一系列膜电位（V_m）步骤（例如，以10 mV为间隔从-150 mV到+90 mV），而放大器#2用于维持恒定 V_m （例如，-30 mV）。在另一种方案中，使用放大器#2来产生 V_m 步骤，而放大器 #1 用于维持恒定 V_m阳性与阴性 V_m 步骤应交替应用（例如，-150、+90、-140、+80……），可在 Clampex 中通过编程实现 用户列表 采集协议中的特征。
2. 设置记录装置
   1. 将一个含有配对卵母细胞的培养皿放入记录平台的培养皿托盘中（图2A)
   2. 选择一对卵母细胞，必要时旋转培养皿，使两个卵母细胞位于左右方向，并通过磁性底座将载物台固定在位。
   3. 将固定磁力支架的电流和电压探头置于隔振台上的合适位置。
      注意：确保一个放大器的电流探针和电压探针位于左侧，另一个放大器的探针位于右侧，且每侧的电压探针位于电流探针前方（图2B，C).
3. 设置参比电极
   1. 放置一个参考电极（材料表）朝向使用者一侧的培养皿边缘附近（图 2B，C).
   2. 将参比电极连接至两个装置中其中一个的黑色插孔（电路接地）。 V_差异 探针
4. 设置 V_差异 电极
   1. 用拉针仪拉制一对玻璃微量移液管，使用金刚石刻刀折断尖端一小部分（材料表），并通过火焰抛光使尖端边缘平滑。
      注意：微电极尖端电阻应小于 150 kΩ（使用含 ND96 溶液的移液管测量）。通常使用尖端电阻为 20–150 kΩ 的微移液管。
   2. 将微量移液器置于酒精灯火焰上方，距离尖端约1 cm处加热，使其弯曲成平滑的角度（约130°）。
      注意：制备的微移液管可重复使用。每次使用后需用水冲洗。
   3. 用ND96溶液完全回填玻璃移液管，将其插入已预装ND96溶液的微电极架中材料表, 图2D），并确保系统中无气泡存在。
   4. 将微电极夹持器的2-mm针插入2-mm插座中 V_差异 电极连接线（图 2D).
   5. 将2毫米套筒夹在磁性底座夹具上（图 2D），并将尖端对准 V_差异 电极朝向两个卵母细胞中的一个图2E).
      注意：调整夹持器的位置和角度，使电极尖端非常接近卵母细胞
   6. 插入1-mm的针 V_差异 将电极连接线插入红色插孔（V_差异 输入）在 V_差异 同一侧的探针。
   7. 制备并连接一个 V_差异 为另一个卵母细胞和放大器安装电极，操作步骤类似。
      注意：图中显示了一对卵母细胞及其所有电极的特写视图 图2E.
5. 安装电流和电压电极
   1. 使用玻璃毛细管制备电压和电流电极，用氯化钾溶液（3.0 M KCl，10 mM EGTA，10 mM HEPES，用KOH调节pH至7.4）反向填充约一半体积，然后插入放大器配套的电极 holder 中。
      注意：电极的电阻应约为 ~1 MΩ。可使用某种薄壁玻璃毛细管制备合适的电极（材料表）使用一组特定的拉制参数（表1）。此类尖端可轻松穿透卵母细胞膜，无需按压放大器上的 Vm 或 Ve BUZZ 按钮。
   2. 将电极放入浴液中，通过调节使膜电位（Vm）和电流（Im）表归零 膜电位偏移 和 Ve偏移量 调节并按下以检查电极电阻 膜电位电极测试 和 Ve电极测试.
   3. 将电流电极和电压电极插入卵母细胞，观察到负的膜电位（通常为 -20 至 -50 mV）。
      注意：同一放大器的 Vm 和 Im 测量表应显示两个相同或非常接近的数值。
6. 数据采集
   1. 在放大器的钳制部分，确认直流增益（D.C. GAIN）处于 在 位置，转动 增益 顺时针旋转旋钮至适当位置，以实现正确的电压钳制（通常为满量程的三分之一至二分之一），然后将钳制开关从 关闭 到 快速.
      注意：打开钳制开关后，Vm 和 Im 表将分别显示钳制电压和钳制电流。尽管钳制电流可能因卵母细胞状态不同而略有变化，但通常较小且在钳制状态下保持稳定 V_m （例如，-30 mV）。
   2. 运行采集程序。
      ​注意：屏幕上将显示四条曲线。来自一个放大器的电压和电流曲线表示 Vm 应用于卵母细胞#1的步骤及产生所需电流 Vm 步骤，而来自另一放大器的则表示恒定值 Vm (-30 mV) 的卵母细胞 #2，并注入电流以维持该恒定电位 Vm注入卵母细胞#2的电流代表了 我_j.

6. 数据分析

1. 使用 Clampfit 进行分析。
   1. 打开已录制的 abf 在 pClamp 的 Clampfit 模块中保存文件。
   2. 使用光标1和光标2圈定基线中峰出现前的一段区域 我_j 痕迹
   3. 点击图标 调整基线 调出基线窗口。选择 减去光标1至2的均值 用于方法，并确认 所有可见信号 和 所有可见痕迹 选择用于轨迹选择。
   4. 点击后 好的基线窗口关闭后，所有电流和电压迹线的基线将汇聚于零电平。注意，电压阶跃变为新的水平，其值等于原始电压减去保持电压（例如，-30 mV）。
   5. 绘制 我_j 和 V_j 关系利用稳态 I_j，圈选所需的片段 我_j 代表稳态的曲线 我_j 使用光标1和2，在电压阶跃的时间窗口内将光标3放置在任意位置。
   6. 前往 分析/快速图表/I-V 打开一个 I-V 窗。
   7. 下 X轴 （电压），选择 Signal 公司的 Cursor 3，从下拉菜单中选择电压阶跃信号（例如 Voltage 1），并勾选该复选框 倒置.
      注意：已勾选“反转”框以进行转换 V_m 与……相当的值 V_j，其定义为 V_m 卵母细胞#2的V_m 卵母细胞#1
   8. 下 Y轴 （当前），选择源 我_j 信号（例如， 当前 0下拉菜单中选择） 信号，定义 区域 作为 光标 1..2 从下拉菜单中选择 平均值.
      注意：用于绘制峰图 我_j 和 V_j 关系，光标1和2应框选该片段的区间 我_j 含有峰的曲线 我_j 在步骤 6.1.5 中选择 峰值 （而不是 平均值）在步骤 6.1.8 中。
   9. 下 目标 选项，选择其中一项 替换 或 附加.
   10. 点击后 好的 在 I-V 窗口，一个 我_j - V_j 关系在屏幕上显示，并且相应的 我_j 和 V_j 点击此处可查找数值 窗口/结果.
2. 绘制并拟合 G_j-V_j 在 OriginPro 中的关系材料表)
   1. 复制包含的两列 V_j 和 我_j 将 Clampfit 结果窗口（步骤 6.1.10）中的数值复制到 Origin 的新工作簿中。确保 V_j 和 我_j 数值分别位于 X 列和 Y 列中。
   2. 通过单击在工作簿中添加四个新列 列 / 添加新列.
   3. 将第一列新列命名为 G_j，通过输入方程来填充 "柱 我_j/栏目 V_j * 1,000" 在 设置列值 窗口，并创建散点图 G_j-V_j 关系
      注意：乘以1,000（可选）是为了避免在后续步骤中处理过小数值带来的不便。
   4. 安装 G_j 阴性和阳性数据点 V_j 独立地拟合到玻尔兹曼函数。计算 G_j 在 V_j = 0 mV，通过输入 G_jmax, G_jmin, A，以及 V₀ 将拟合得到的数值代入Boltzmann方程，该过程可在电子表格中完成。 G_j 因此获得的将被用作 G_jmax 下一步。
      注意：拟合Boltzmann函数的方程为： G_j = (G_jmax-G_jmin)/{1 + exp[A(V_j-V₀)]} + G_jmin，其中 V₀ 是 V_j 电导为最大值一半时的 G_jmax 是最大电导， G_jmin 是 V_j-不敏感的残余电导²³. 进行拟合时，首先将Boltzmann方程作为新的拟合函数添加到OriginPro中，然后选择该函数进行拟合。输入参数的近似初始值 G_jmax, G_jmin, V₀，以及 A 在执行拟合函数之前。确保 G_jmax 该参数在此拟合中不固定。
   5. 将第二列和第三列分别命名为 nGj-L 和 nGj-R（"n" 用于 "标准化"），并通过分割填充它们 G_j 柱由 G_jmax 由左侧和右侧得出的数值 G_j - V_j 曲线（步骤 6.2.4）。
   6. 将第四个新列命名为 nGj-LR，并通过复制负值和正值中的数据来填充该列 V_j nGj-L 和 nGj-R 列的范围，分别对应。
   7. 创建 nGj-LR 的散点图 V_j，并对负相和正相中的数据点进行拟合 V_j 将各范围分别拟合到Boltzmann函数。确保 G_jmax 参数在拟合过程中固定为1.0。
   8. 保留拟合结果的记录（例如，拟合曲线图和拟合参数） G_jmin, V₀，以及 A 值）。

结果

UNC-7 和 UNC-9 是秀丽隐杆线虫（C. elegans）的连接子蛋白（innexin）。虽然 UNC-9 仅有一种亚型，但 UNC-7 具有多种亚型，主要在其氨基末端的长度和氨基酸序列上存在差异^7,8。当在非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞中表达时，这些连接子蛋白可形成同型以及异型（UNC-7 与 UNC-9）间隙连接（GJ）^7,8。UNC-7b 和 UNC-9 同型间隙连接的代表性 I_j 电流轨迹及其归一化的 G_j-V_j 关系曲线如图3所示。在成对卵母细胞的实验中，卵母细胞1的膜电位（V_m）被钳制在相对于保持电压（-30 mV）的不同水平，而...

讨论

双卵母细胞电压钳实验似乎需要进行系统优化。若不优化，记录可能极不稳定，放大器可能需要注入过量电流才能达到目标膜电位（Vm），从而导致卵母细胞损伤和记录失败。采用高侧电流测量法获得稳定的双卵母细胞记录时，多个因素至关重要。首先，电流电极和电压电极必须具有适当的电阻（约 1 MΩ），且其电极夹必须保持清洁。其次，V_DIFF 电极必须具有低电阻（<150 kΩ），并应靠近卵母细胞。第三，同一卵母细胞的所有电极（电压、电流和 V_DIFF）必须置于同一侧（左侧或右侧），且电极排列顺序（从后到前）应为电流电极、电压电极、V_DIFF 电极。最后，参考电极应位于 35 mm 培养皿边缘靠近操作者的一侧。

我们对制造商推荐的部分实验步骤进行了修改，并做了一些其他改进。主要包括：1）使用充满ND96溶液的微电极代替KCl负载的琼脂桥作为V_DIFF电极。这种玻璃微电极易于制作、可重复使用，且对卵母细胞无损伤；2）采用低渗...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂桥磁力支架	ALA Scientific Instruments	MPSALT-H	由于其磁性底座更大，比Narishige管夹更稳定，但需要改装以适配2毫米雌性插座。
自动纳升级注射器	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA	Nanoject II	自动化纳升级注射装置
胶原酶 II型	Gibco-USA, Langley, OK, USA	17101-015
金刚石刻划刀	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	62108-ST
差分电压探针	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	7255DI
模数信号转换器	Molecular Devices, San Jose,CA, USA	Digidata 1440A
Dumont #5 镊子	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	500341
玻璃毛细管	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA	3-000-203-G/X
热丝切割器	Amazon.com	Proxxon 37080	可选替代型号为Hercules 8500 DHWT，配备脚踏控制踏板。
透明质酸酶 I-S型	MilliporeSigma, Burlington, MA, USA	H3506
磁力支架底座	Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA	MB-L-45
微电极斜面研磨仪	Sutter Instrument, Novato, CA, USA	BV-10
微电极夹持器	World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA	MEH1S15
微量移液器拉制仪	Sutter Instrument, , Novato, CA, USA	P-97
mMESSAGE mMACHINETM T3	Invitrogen-FisherScientific	AM1348
Nunc MicroWell MiniTray	Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA	438733	微孔板迷你托盘
尼龙网筛	Component Supply Company, Sparta, TN, USA	U-CMN-1000
卵母细胞钳制放大器	Warner Instruments, , Hamden, CT, USA	OC-725C
OriginPro	OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA	2020b
pClamp	Molecular Devices, , San Jose,CA, USA	Version 10
参比电极	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	DRIREF-2SH	技术规格：https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT（核糖核酸酶抑制剂）	Invitrogen-FisherScientific	10777-019
5-0 丝线缝合线	Covidien, North Haven, CT, USA	VS890
分光光度计 NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-LITE-PR
薄壁玻璃毛细管	World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA	TW150F-4
管夹	Narishige International USA, Amityville, NY, USA	CAT-1	可直接使用，但由于磁性底座较小，其位置容易发生偏移。
Xenopus laevis	Xenopus Express, Brooksville, FL, USA	IMP-XL-FM