方法文章

定量测定小鼠胎盘中的铁转运 在体 内 使用非放射性铁同位素

DOI：

10.3791/63378

⸱

2022年5月10日

 , 
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文演示了如何制备和施用转铁蛋白结合的非放射性同位素铁，用于小鼠妊娠期间铁转运的研究。同时描述了定量胎盘胎儿各部分中同位素铁含量的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

铁对妊娠期间的母体和胎儿健康至关重要，人类维持一次健康妊娠大约需要1克铁。胎儿体内的铁完全依赖于通过胎盘的铁转运，而这种转运过程的紊乱可能导致不良妊娠结局。在小鼠中，传统上测量胎盘铁通量依赖于放射性铁同位素，这种方法虽然灵敏度高，但操作繁琐。稳定铁同位素（57Fe 和 58Fe）为人类妊娠研究提供了非放射性的替代方案。

在生理条件下，转铁蛋白结合铁是胎盘摄取铁的主要形式。因此， 58转铁蛋白-铁通过静脉注射给予妊娠母鼠，以直接评估胎盘铁转运，并规避母体肠道铁吸收这一混杂因素的影响。采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）定量胎盘及小鼠胚胎组织中的同位素铁含量。这些方法也可应用于其他生理或疾病动物模型系统中，用于定量分析 体内 铁动态

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

铁对于多种代谢过程至关重要，包括生长发育、能量生成和氧气运输1。铁稳态的维持是一个动态且协调的过程。铁在十二指肠从食物中被吸收，并与铁转运蛋白转铁蛋白（transferrin, Tf）结合，通过血液循环输送到全身。几乎所有细胞都利用铁参与酶促反应，铁被整合到新生红细胞的血红蛋白中，并由巨噬细胞从衰老的红细胞中回收再利用。当体内铁过量时，铁储存在肝脏中，并通过出血或细胞脱落而丢失。循环中铁的含量取决于铁的消耗与供给之间的平衡，其中铁的供给受到肝脏激素铁调素（hepcidin, HAMP）的严格调控，HAMP是铁稳态的核心调节因子1。铁调素通过封闭铁输出蛋白ferroportin（FPN）或诱导其泛素化并降解，从而限制血液中铁的生物可利用性2。功能性FPN减少会导致膳食铁吸收降低、肝脏中铁的隔离增加以及巨噬细胞中铁的再循环减少1。

铁调素（hepcidin）受铁状态、炎症、促红细胞生成作用以及妊娠的影响（详见文献3综述）。鉴于铁稳态具有高度动态性，了解并测量总铁池、铁的分布与周转至关重要。动物研究传统上依赖放射性铁同位素来测定铁代谢动态，该方法虽然灵敏度高，但操作繁琐。然而，在包括本研究在内的近期研究中4，已采用非放射性的稳定铁同位素（58Fe）来测定妊娠期间的铁转运过程5,6,7,8,9。稳定同位素是研究营养素代谢的有力工具（详见文献10综述）。在人体研究中应用稳定铁同位素已表明：i）铁吸收在妊娠末期增加5,6；ii）膳食铁向胎儿的转运依赖于母体的铁状态7；iii）母体摄入的血红素铁比非血红素铁更容易被胎儿利用8；iv）铁向胎儿的转运与母体铁调素水平呈负相关8,9。这些实验通过检测血清中铁同位素或其在红细胞（RBCs）中的掺入量来评估铁代谢；然而，仅测量掺入红细胞的铁可能低估真实的铁吸收量9。在本研究中，同时检测了组织中血红素铁和非血红素铁的含量。

妊娠期间，铁元素对于支持母体红细胞容量的增加以及通过胎盘向胎儿转运以支持其生长发育至关重要11。胎儿体内的铁储备完全依赖于铁通过胎盘的转运。在人类12和啮齿类动物4,13妊娠期间，铁调素（hepcidin）水平显著下降，从而增加血浆中铁的可利用性，促进其向胎儿的转运。

胎盘铁转运的基本原理最初是在20世纪50至70年代利用放射性示踪剂（59Fe 和 55Fe）进行表征的。这些研究确定，铁通过胎盘的转运是单向的14,15，而转铁蛋白结合双铁（diferric transferrin）是胎盘和胎儿获取铁的主要来源16,17。目前对胎盘铁转运的理解已更为全面，但仍有一些关键的铁转运蛋白和调控机制尚未明确。小鼠模型对于理解铁的调控与转运至关重要18，因为其关键转运蛋白和机制与人类极为相似。人和小鼠的胎盘均为血绒毛膜型（hemochorial），即母体血液直接与胎儿绒毛膜接触19。然而，两者在结构上仍存在一些显著差异。

合体滋养层是胎盘中分隔母体与胎儿血液循环的细胞层，可主动转运铁及其他营养物质20在人类中，合体滋养层为单层融合细胞。相比之下，小鼠胎盘则包含两层合体滋养层。21，Syn-I 和 Syn-II。然而，Syn-I 与 Syn-II 界面处的缝隙连接允许营养物质在两层之间扩散22,23因此，这些细胞层发挥着类似于人类合体滋养层的单一合胞体层功能。Rossant 和 Cross 综述了人类与小鼠胎盘之间的其他相似性与差异。21胎盘铁转运由母体血液中的转铁蛋白结合铁（iron-Tf）与合体滋养层顶膜侧的转铁蛋白受体（TfR1）结合而启动24该相互作用通过网格蛋白介导的内吞作用诱导铁-转铁蛋白/转铁蛋白受体1（iron-Tf/TfR1）内化25铁随后在酸性内体中从转铁蛋白（Tf）释放26，通过一种尚未明确的铁还原酶还原为亚铁离子，并由一种尚未确定的转运蛋白从内体转运至细胞质。铁在合体滋养层细胞内的分子伴侣机制仍有待阐明。最终，铁通过定位于合体滋养层基底侧或面向胎儿侧膜上的铁输出蛋白FPN转运至胎儿侧（详见综述于27).

为了理解转铁蛋白受体1（TfR1）、铁转运蛋白（FPN）和铁调素（hepcidin）的生理与病理调控如何影响胎盘铁转运，研究中采用了稳定铁同位素，以定量测定铁从母体循环向胎盘及胚胎的转运过程体内4。本文介绍了向妊娠小鼠制备和给予同位素标记的转铁蛋白-铁的方法、组织样本的处理以用于电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析，以及组织中铁浓度的计算方法。稳定铁同位素的体内应用可被推广至不同动物模型，用于研究生理和病理条件下的铁代谢调控与分布。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有动物实验方案和实验操作均经加州大学洛杉矶分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 58Fe-Tf 的制备

注意：本实验方案使用58Fe；然而，57Fe也可采用完全相同的实验方案。这两种同位素均可作为常规铁化学试剂使用和处置，无需采取额外防护措施。

  1. 将58Fe溶解于12 N HCl中，每毫克58Fe使用50 µL HCl。
    1. 将HCl加入供应商提供的玻璃小瓶中的金属中，并松松地盖上盖子。为溶解铁，将58Fe/HCl溶液在60 °C下加热1小时。若仍未完全溶解，将溶液在通风橱中室温下静置过夜以完成溶解。
      注意：58Fe/HCl溶液溶解后呈黄橙色。
      Fe3O4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl2(aq) + 2Fe(III)Cl3(aq) + 4H2O
  2. 将残留的Fe(II)Cl2氧化，以生成Fe(III)Cl3溶液。
    1. 将58Fe/HCl溶液在60 °C下加热，并打开盖子以促进氧化。
    2. 每50 µL 58Fe/HCl溶液中加入1 µL 35% H2O2，以进一步促进氧化。
      Fe(II)Cl2(aq) + O2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) + 2H2O
  3. 制备三氯化铁（58Fe(III)Cl3）溶液。
    1. 将三氯化铁溶液在通风橱中60 °C下敞口放置，以蒸发样品。
      注意：蒸发过程可能需要一至数天。
    2. 用超纯H2O将58Fe(III)Cl3重新溶解至100 mM，并根据步骤1.1中使用的初始金属质量计算所需超纯H2O的体积（58Fe(III)Cl3的分子量为162.2）。
  4. 通过将58Fe(III)Cl3与NTA在20 mM NaHCO3存在下以1:5的摩尔比孵育，制备58Fe(III)-次氮基三乙酸盐（NTA）。
    1. 用1 N NaOH配制500 mM NTA溶液。
    2. 配制5倍转铁蛋白加样缓冲液（0.5 M HEPES，pH 7.5；0.75 M NaCl）。
    3. 用超纯H2O配制1 M NaHCO3溶液。
    4. 向一个15 mL锥形管中加入150 µL 100 mM 58Fe(III)Cl3溶液（来自步骤1.3.2）、150 µL用1 N NaOH配制的500 mM NTA溶液、480 µL超纯H2O、200 µL 5倍转铁蛋白加样缓冲液和20 µL 1 M NaHCO3溶液。
    5. 在室温下孵育5分钟。
  5. 将脱铁转铁蛋白（apo-Tf）与58Fe(III)-NTA结合，形成58Fe-Tf。
    注意：本方案改编自McCarthy和Kosman28。
    1. 将500 mg apo-Tf溶解于4 mL 1倍Tf加样缓冲液中。
    2. 向步骤1.4.4中的15 mL锥形管（含1 mL 58Fe(III)-NTA溶液）中加入4 mL apo-Tf溶液。
      注意：此为58Fe-NTA与apo-Tf的3:1摩尔比。每个转铁蛋白含有两个铁结合位点；添加过量58Fe-NTA以确保转铁蛋白完全载铁。
    3. 为实现58Fe-NTA在apo-Tf上的最大载入量，检查溶液pH是否为7.5，必要时用NaHCO3或HCl调节pH。
    4. 在室温下孵育2.5小时。
  6. 去除未结合的过量58Fe(III)-NTA及游离NTA。
    1. 将58Fe-Tf溶液转移至分子量截留柱（截留分子量30 kDa），在室温下以2,500 × g离心15分钟。
    2. 用10 mL 1倍转铁蛋白加样缓冲液洗涤柱子，在室温下以2,500 × g离心15分钟。重复洗涤和离心一次，再用10 mL生理盐水进行盐洗，并在室温下以2,500 × g离心15分钟。
  7. 计算58Fe-Tf的浓度。
    注意：由于在步骤1.5.2中加入了过量58Fe，可假设所有转铁蛋白均为双铁形式。由于使用了500 mg apo-Tf，因此在步骤1.5.4中约生成了500 mg 58Fe-Tf。
    1. 测量步骤1.6.2盐洗后离心所得回收液体积。
    2. 用500 mg除以回收体积，计算58Fe-Tf溶液的浓度（单位为mg/mL）。
  8. 使用0.22 µm注射器滤器对58Fe-Tf溶液进行除菌；储存于4 °C，待用时取出。
    注意：58Fe-Tf溶液在制备后1至4周内使用。

2. 建立定时小鼠妊娠模型

  1. 使用6至8周龄的雌性小鼠。在交配前2周将动物置于低铁饮食（4 ppm 铁）或标准饲料（185 ppm 铁）中，并在整个妊娠期间维持相应的饮食。
  2. 选项 01：通过E7.5时的体重增加确认妊娠。
    1. 设置多个繁殖笼。每个笼子中放入2只雌鼠和1只雄鼠过夜；次日将动物分开的当天记为胚胎期（E）0.5。在E7.5时称量雌鼠体重以判断是否妊娠。对未增重的雌鼠再次与雄鼠交配。
      注意：在野生型C57BL/6小鼠中，E7.5时体重增加1 g是妊娠的良好指标。该方法可确保着床发生在特定的16小时时间窗内，从而使同一繁殖周期内妊娠的所有动物能够同步接受处理。
  3. 选项 02：通过阴栓检查确认妊娠。
    1. 将2只雌鼠与1只雄鼠合笼，并每日进行阴栓检查以确定是否发生交配。
      注意：该方法可能导致妊娠时间不一致，且出现阴栓并不能保证一定妊娠。

3. 对 E17.5 孕鼠静脉注射 58Fe-Tf

  1. 准备 58步骤1.8中用于注射的Fe-Tf。
    1. 准备 58生理盐水中含 Fe-Tf 溶液，浓度为 35 mg/mL；每只小鼠注射 100 µL。
    2. 用胰岛素注射器吸取 100 µL 的 58Fe-Tf 溶液
      注意：每剂含有 3.5 mg 人源 58Fe-Tf（5 µg 的 58Fe
  2. 使用异氟烷麻醉一只怀孕的小鼠。
    1. 使用带有麻醉舱的异氟烷调节器。
    2. 使用以下设置：5% 异氟烷，2 L/mL 氧气2，2 分钟
    3. 通过脚趾夹捏无反应来确认小鼠已麻醉。
    4. 在眼球表面涂抹眼用润滑剂，并将小鼠置于加热垫上。
  3. 缓慢而小心地注射 58将Fe-Tf溶液注入眶后窦。
  4. 让小鼠从麻醉中恢复；在动物恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。
  5. 注射后6小时，通过过量异氟烷使E17.5孕鼠安乐死。
    1. 通过心脏穿刺对小鼠进行放血，作为辅助安乐死方法。
    2. 用针固定脚部以保持稳定。
  6. 收集胎盘和胚胎肝脏。
    1. 使用无菌镊子和解剖剪，小心地从怀孕小鼠体内取出子宫。剪下一个胎盘-胎儿单位，该单位包含一个完整的胎儿和胎盘，连同其所在的羊膜囊及部分子宫组织。
    2. 小心切开子宫和羊膜囊，避免扰动胎儿和胎盘。
    3. 剥离羊膜囊，取出胎儿和胎盘。
    4. 剪断脐带。
    5. 用干净的擦拭纸轻轻吸干胎儿和胎盘表面，以去除多余的羊水。
    6. 记录整个胎盘的重量。
    7. 用剃刀片将每个胎盘切成两半，分别放入2.0 mL离心管中，并在液氮中速冻。
      注意：由于 58Fe无需特殊的处理注意事项和处置，可将一半的胎盘用于 58铁含量测定，另一半用于其他分析，包括通过蛋白质印迹法和qPCR检测转铁蛋白受体（TFR1）和铁输出蛋白（FPN）的表达水平。
    8. 为收集胚胎肝脏，处死胚胎：使用剃须刀片迅速切断胚胎头部。
      注意：在E17.5时，必须对子宫内的所有胚胎逐一实施安乐死，即使这些胚胎未用于研究。
    9. 固定胚胎以保持稳定，暴露腹部区域。
    10. 使用解剖剪在脐带附着处做一个小切口，将解剖剪的一端插入切口，沿中线平面朝冠状面方向剪开约¼英寸。然后进行横断面剪切，以暴露胎儿肝脏。
    11. 使用镊子取出胎肝。
    12. 记录整个胚胎肝脏的重量。
    13. 将整个胚胎肝脏放入2 mL离心管中，并在液氮中速冻。
      注意：也可仅使用胚胎肝脏的一部分进行后续操作 58如需进行额外分析，可测量铁含量。使用2.0 mL离心管比1.5 mL离心管更有利于组织匀浆。
  7. 将组织在 -80 °C 下长期保存。

4. 通过 ICP-MS 进行定量铁分析的组织样品处理

  1. 处理胎盘和胎肝，用于定量非血红素铁。
    1. 解冻胎盘半块组织和完整的胎肝组织，并称量胎盘半块组织的重量（胎肝重量的记录见步骤3.6.12）。
    2. 加入400 µL蛋白沉淀溶液（0.53 N HCl，5.3% TCA）。
    3. 使用电动匀浆器匀浆组织。
    4. 将样品在100 °C下孵育1小时。
    5. 将样品在室温水中冷却2分钟。
    6. 打开管盖释放压力，然后重新盖紧管盖。
    7. 在室温下以17,000 × g离心10分钟，使组织碎片沉淀。
    8. 小心地将上清液转移至新的标记管中。
    9. 送样进行ICP-MS分析。
  2. 处理胎盘和胎肝，用于定量血红素铁。
    注意：在步骤1提取非血红素铁后，沉淀物中残留的铁主要为血红素铁。
    1. 记录步骤4.1.7中每个沉淀物的重量。
    2. 将沉淀物在10 mL浓70% HNO3中消化，并添加1 mL 30% H2O2
      注意：请咨询ICP-MS核心实验室或中心，根据具体研究优化HNO3的用量；用量部分取决于样品重量。
    3. 将样品加热至200 °C，持续15分钟。
    4. 送样进行ICP-MS分析。
      注意：如果无需区分血红素铁与非血红素铁来源，仅需测定总铁含量，则可直接将完整组织在HNO3中消化作为第一步。

5. 数据分析

注意：ICP-MS 数据以 ng/mL 或 mg、ppb 为单位提供了 56Fe 和 58Fe 的浓度（表1）。56Fe 是自然界中丰度最高的铁同位素，其测量值反映了整个妊娠期间铁在胎盘/胚胎中的累积情况，而 58Fe 的测量值则反映了注射后 6 小时内转移的铁量。

  1. 从测得的 58Fe 值中减去天然丰度的 58Fe（占总铁的 0.28%）。
  2. 计算胚胎肝脏总非血红素 58Fe。
    1. 首先将步骤 5.1 中计算出的铁浓度（ng/mL）乘以步骤 4.1.2 初始处理时的体积（mL），估算胚胎肝脏总非血红素铁（ng），从而得到总 58Fe。
    2. 通过将步骤 3.6.6 中测得的胎盘总重量除以步骤 4.1.1 中处理的胎盘重量，计算整个胎盘中的铁含量。将该值乘以步骤 5.2.1 中计算出的总非血红素铁（ng），得到胎盘的总非血红素 58Fe 含量。
  3. 计算总血红素 58Fe。
    1. 首先将步骤 5.1 中计算出的铁浓度（ng/mg）乘以步骤 4.2.1 中测得的沉淀物重量（mg），计算总血红素 58Fe。
    2. 然后将步骤 3.5.1 中测得的胎盘总重量除以步骤 4.2.1 中测得的胎盘沉淀物重量。将该值乘以步骤 5.3.1 中计算出的总血红素铁（ng），得到胎盘的总血红素 58Fe 含量。
  4. 将计算出的非血红素和血红素 58Fe 值相加，以确定每种组织的总铁含量。

Preparation of ⁵⁶Fe-Tf, administration, and tissue processing workflow; mouse tissue collection, ICP-MS.
图1：实验方案步骤的可视化概要。 (A) 制备 58Fe-转铁蛋白。B) 在体 给药 58Fe-转铁蛋白。C组织采集与保存D胎盘和胚胎肝脏中金属元素种类的定量处理（采用ICP-MS法）。缩写：Fe = 铁；NTA = 氮川三乙酸；Tf = 转铁蛋白；PPS = 蛋白沉淀液；Sup = 上清液；TCA = 三氯乙酸；ICP-MS = 电感耦合等离子体质谱 请点击此处以查看此图的放大版本。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一项早期研究利用稳定的铁同位素测量铁的转运，结果表明母体铁缺乏会导致胎盘铁输出蛋白FPN表达下调4。FPN是目前已知唯一的哺乳动物铁输出蛋白，其在胚胎发育过程中的缺失会导致胚胎在E9.5之前死亡29。为了确定FPN表达的降低是否在功能上导致胎盘铁转运减少，研究人员将58Fe-Tf经静脉注射入妊娠母鼠体内，并在母体铁缺乏条件下定量分析了胎盘和胚胎中的铁含量。

为了研究母体铁状态如何影响胎盘铁转运，研究人员在小鼠中建立了铁缺乏模型4。雌性C57BL/6小鼠在妊娠前及整个妊娠期间被饲喂低铁饮食（4 ppm 铁）或标准饲料（185 ppm 铁），持续2周。该饮食方案导致与饲喂标准饲料的小鼠相比，实验组母鼠在E12.5、E15.5和E18.5时期的肝脏非血红素铁、血清铁及血红蛋白水平降低4。在E18.5时，来自铁缺乏母鼠的胚胎其肝脏铁含量较低，且表现为低血清铁和贫血，而来自铁充足母...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

铁在许多生物过程中具有重要作用，其在体内的转运和分布具有高度动态性并受到严格调控。稳定铁同位素为评估铁稳态动态提供了可靠且便捷的替代方案，可取代放射性同位素。该实验方案中的关键步骤是准确记录所有组织的重量和体积。铁是一种元素，既不能被合成，也不能被分解。因此，只要仔细记录所有重量和体积数据，即可通过计算精确追踪系统内全部铁的去向。如文中所述，该方法可用于区分血红素铁与非血红素铁来源。然而，若无需区分铁的存在形式，仅需测定总铁含量，则可通过仅使用浓硝酸（HNO3）处理组织来简化实验流程，具体操作如方案第4.2步所述。需要注意的是，若组织在分析前未进行灌注处理，尤其是胎盘等高度血管化的组织，残留血液可能导致组织中血红素铁含量被高估。

选择转铁蛋白结合铁作为研究对象，因为它是胎盘摄取铁的主要来源16,17。在小鼠中全局敲低TFR1会导致胚胎在E12.5之前死亡，表明转铁蛋白结合铁对发育至关重要。其他铁形态，如铁蛋白和非转铁蛋白结合铁...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EN 是 Intrinsic LifeSciences 和 Silarus Pharma 的科学联合创始人，并担任 Protagonist、Vifor、RallyBio、Ionis、Shield Therapeutics 和 Disc Medicine 的顾问。VS 声明不存在利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢加州大学洛杉矶分校（UCLA）纳米系统研究所（CNSI）内加州大学纳米技术环境影响中心（UC Center for Environmental Implications of Nanotechnology）的ICP-MS设施，为优化58Fe测定方案提供了支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）糖尿病与消化及肾脏疾病国家研究所（NIDDK）（项目编号K01DK127004，授予VS）以及美国国立卫生研究院儿童健康与人类发展国家研究所（NICHD）（项目编号R01HD096863，授予EN）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
58Fe-铁金属Trace Sciences InternationalFe-58
Amicon ultra-15 离心滤器，30 kDa 截留分子量Millipore SigmaUFC903024
离心管，15 mLFisher Scientific14-959-49B
离心管，50 mLMillipore SigmaCLS430829
离心机，Sorvall Legend Micro 17 微型离心机Fisher Scientific75002432
离心机，Sorvall Legend RT
精密操作擦拭纸Fisher Scientific06-666
饲料：缺铁型（4 ppm 铁）Envigo TekladTD.80396
饲料：标准饲料（185 ppm 铁）PicoLab5053
解剖剪，30 mm 刃口VWR25870-002
镊子，4-1/2 英寸长度McKesson157-469
HEPESFisher ScientificBP310-500
匀浆器，Bio-Gen PRO200PROScientific01-01200
人脱铁转铁蛋白（apo-Tf）Celliance4452-01已不再供应，替代品：Millipore 616419
盐酸（HCl）Fisher ScientificA144S-500
过氧化氢（H2O2），35 wt.% 水溶液Cole-ParmerEW-88216-36
胰岛素注射器，BD Lo-Dose U-100Fisher Scientific14-826-79
异氟烷VETone502017
异氟烷蒸发器Summit Anesthesia Solutions
金属加热块Fisher Scientific
带平头螺旋盖的微量离心管VWR16466-064
微量离心管，1.5 mL 低吸附Fisher Scientific02-681-320
微量离心管，2.0 mL 低吸附Fisher Scientific02-681-321
Millex-GP 注射式滤器，0.22 µm，聚醚砜材质，33 mm，伽马射线灭菌Millipore SigmaSLGP033RS
次氮基三乙酸（NTA）Sigma72560-100G
针头，25 G × 5/8 英寸，皮下注射通用型Fisher Scientific14-826AA
pH 试纸，塑料包被，pH 5.0–9.0Fisher Scientific13-640-519
剃须刀片，0.22 mmVWR55411-050
天平（克级）Mettler ToledoPB1502-S
天平（毫克级）Mettler ToledoBalance XS204
碳酸氢钠（NaHCO3）SigmaS5761-500G
氯化钠（NaCl）Fisher ScientificS671-3
氢氧化钠（NaOH）Fisher ScientificSS266-1
无菌注射器，滑动接头（1 mL）Fisher Scientific309659
三氯乙酸（TCA）Fisher ScientificA322-500
软件
ImageLabBio-Rad
SigmaPlotSystat

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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