定量测定小鼠胎盘中的铁转运 在体 内 使用非放射性铁同位素

摘要

本文演示了如何制备和施用转铁蛋白结合的非放射性同位素铁，用于小鼠妊娠期间铁转运的研究。同时描述了定量胎盘胎儿各部分中同位素铁含量的方法。

摘要

铁对妊娠期间的母体和胎儿健康至关重要，人类维持一次健康妊娠大约需要1克铁。胎儿体内的铁完全依赖于通过胎盘的铁转运，而这种转运过程的紊乱可能导致不良妊娠结局。在小鼠中，传统上测量胎盘铁通量依赖于放射性铁同位素，这种方法虽然灵敏度高，但操作繁琐。稳定铁同位素（⁵⁷Fe 和 ⁵⁸Fe）为人类妊娠研究提供了非放射性的替代方案。

在生理条件下，转铁蛋白结合铁是胎盘摄取铁的主要形式。因此， ⁵⁸转铁蛋白-铁通过静脉注射给予妊娠母鼠，以直接评估胎盘铁转运，并规避母体肠道铁吸收这一混杂因素的影响。采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）定量胎盘及小鼠胚胎组织中的同位素铁含量。这些方法也可应用于其他生理或疾病动物模型系统中，用于定量分析 体内 铁动态

引言

铁对于多种代谢过程至关重要，包括生长发育、能量生成和氧气运输¹。铁稳态的维持是一个动态且协调的过程。铁在十二指肠从食物中被吸收，并与铁转运蛋白转铁蛋白（transferrin, Tf）结合，通过血液循环输送到全身。几乎所有细胞都利用铁参与酶促反应，铁被整合到新生红细胞的血红蛋白中，并由巨噬细胞从衰老的红细胞中回收再利用。当体内铁过量时，铁储存在肝脏中，并通过出血或细胞脱落而丢失。循环中铁的含量取决于铁的消耗与供给之间的平衡，其中铁的供给受到肝脏激素铁调素（hepcidin, HAMP）的严格调控，HAMP是铁稳态的核心调节因子¹。铁调素通过封闭铁输出蛋白ferroportin（FPN）或诱导其泛素化并降解，从而限制血液中铁的生物可利用性²。功能性FPN减少会导致膳食铁吸收降低、肝脏中铁的隔离增加以及巨噬细胞中铁的再循环减少¹。

铁调素（hepcidin）受铁状态、炎症、促红细胞生成作用以及妊娠的影响（详见文献³综述）。鉴于铁稳态具有高度动态性，了解并测量总铁池、铁的分布与周转至关重要。动物研究传统上依赖放射性铁同位素来测定铁代谢动态，该方法虽然灵敏度高，但操作繁琐。然而，在包括本研究在内的近期研究中⁴

方案

所有动物实验方案和实验操作均经加州大学洛杉矶分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. ⁵⁸Fe-Tf 的制备

注意：本实验方案使用⁵⁸Fe；然而，⁵⁷Fe也可采用完全相同的实验方案。这两种同位素均可作为常规铁化学试剂使用和处置，无需采取额外防护措施。

1. 将⁵⁸Fe溶解于12 N HCl中，每毫克⁵⁸Fe使用50 µL HCl。
   1. 将HCl加入供应商提供的玻璃小瓶中的金属中，并松松地盖上盖子。为溶解铁，将⁵⁸Fe/HCl溶液在60 °C下加热1小时。若仍未完全溶解，将溶液在通风橱中室温下静置过夜以完成溶解。
      注意：⁵⁸Fe/HCl溶液溶解后呈黄橙色。
      Fe₃O_4(s) + 8HCl_(aq) → Fe^(II)Cl_2(aq) + 2Fe^(III)Cl_3(aq) + 4H₂O
2. 将残留的Fe^(II)Cl₂

结果

一项早期研究利用稳定的铁同位素测量铁的转运，结果表明母体铁缺乏会导致胎盘铁输出蛋白FPN表达下调⁴。FPN是目前已知唯一的哺乳动物铁输出蛋白，其在胚胎发育过程中的缺失会导致胚胎在E9.5之前死亡²⁹。为了确定FPN表达的降低是否在功能上导致胎盘铁转运减少，研究人员将⁵⁸Fe-Tf经静脉注射入妊娠母鼠体内，并在母体铁缺乏条件下定量分析了胎盘和胚胎中的铁含量。

为了研究母体铁状态如何影响胎盘铁转运，研究人员在小鼠中建立了铁缺乏模型⁴。雌性C57BL/6小鼠在妊娠前及整个妊娠期间被饲喂低铁饮食（4 ppm 铁）或标准饲料（185 ppm 铁），持续2周。该饮食方案导致与饲喂标准饲料的小鼠相比，实验组母鼠在E12.5、E15.5和E18.5时期的肝脏非血红素铁、血清铁及血红蛋白水平降低⁴。在E18.5时，来自铁缺乏母鼠的胚胎其肝脏铁含量较低，且表现为低血清铁和贫血，而来自铁充足母.......

讨论

铁在许多生物过程中具有重要作用，其在体内的转运和分布具有高度动态性并受到严格调控。稳定铁同位素为评估铁稳态动态提供了可靠且便捷的替代方案，可取代放射性同位素。该实验方案中的关键步骤是准确记录所有组织的重量和体积。铁是一种元素，既不能被合成，也不能被分解。因此，只要仔细记录所有重量和体积数据，即可通过计算精确追踪系统内全部铁的去向。如文中所述，该方法可用于区分血红素铁与非血红素铁来源。然而，若无需区分铁的存在形式，仅需测定总铁含量，则可通过仅使用浓硝酸（HNO₃）处理组织来简化实验流程，具体操作如方案第4.2步所述。需要注意的是，若组织在分析前未进行灌注处理，尤其是胎盘等高度血管化的组织，残留血液可能导致组织中血红素铁含量被高估。

选择转铁蛋白结合铁作为研究对象，因为它是胎盘摄取铁的主要来源^16,17。在小鼠中全局敲低TFR1会导致胚胎在E12.5之前死亡，表明转铁蛋白结合铁对发育至关重要。其他铁形态，如铁蛋白和非转铁蛋白结合铁.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
58Fe-铁金属	Trace Sciences International	Fe-58
Amicon ultra-15 离心滤器，30 kDa 截留分子量	Millipore Sigma	UFC903024
离心管，15 mL	Fisher Scientific	14-959-49B
离心管，50 mL	Millipore Sigma	CLS430829
离心机，Sorvall Legend Micro 17 微型离心机	Fisher Scientific	75002432
离心机，Sorvall Legend RT
精密操作擦拭纸	Fisher Scientific	06-666
饲料：缺铁型（4 ppm 铁）	Envigo Teklad	TD.80396
饲料：标准饲料（185 ppm 铁）	PicoLab	5053
解剖剪，30 mm 刃口	VWR	25870-002
镊子，4-1/2 英寸长度	McKesson	157-469
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
匀浆器，Bio-Gen PRO200	PROScientific	01-01200
人脱铁转铁蛋白（apo-Tf）	Celliance	4452-01	已不再供应，替代品：Millipore 616419
盐酸（HCl）	Fisher Scientific	A144S-500
过氧化氢（H2O2），35 wt.% 水溶液	Cole-Parmer	EW-88216-36
胰岛素注射器，BD Lo-Dose U-100	Fisher Scientific	14-826-79
异氟烷	VETone	502017
异氟烷蒸发器	Summit Anesthesia Solutions
金属加热块	Fisher Scientific
带平头螺旋盖的微量离心管	VWR	16466-064
微量离心管，1.5 mL 低吸附	Fisher Scientific	02-681-320
微量离心管，2.0 mL 低吸附	Fisher Scientific	02-681-321
Millex-GP 注射式滤器，0.22 µm，聚醚砜材质，33 mm，伽马射线灭菌	Millipore Sigma	SLGP033RS
次氮基三乙酸（NTA）	Sigma	72560-100G
针头，25 G × 5/8 英寸，皮下注射通用型	Fisher Scientific	14-826AA
pH 试纸，塑料包被，pH 5.0–9.0	Fisher Scientific	13-640-519
剃须刀片，0.22 mm	VWR	55411-050
天平（克级）	Mettler Toledo	PB1502-S
天平（毫克级）	Mettler Toledo	Balance XS204
碳酸氢钠（NaHCO3）	Sigma	S5761-500G
氯化钠（NaCl）	Fisher Scientific	S671-3
氢氧化钠（NaOH）	Fisher Scientific	SS266-1
无菌注射器，滑动接头（1 mL）	Fisher Scientific	309659
三氯乙酸（TCA）	Fisher Scientific	A322-500
软件
ImageLab	Bio-Rad
SigmaPlot	Systat