本方案详细描述了美洲大蠊（P. americana）中RNAi操作技术的逐步操作指南。
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摘要
摘要
蜚蠊是一种卫生害虫，但由于其易于饲养且具有不完全变态的特征，成为昆虫发育与变态研究中的重要物种。结合其基因组序列已得到充分注释的优势，美洲大蠊（Periplaneta americana）已成为重要的不完全变态昆虫研究模型。由于基因敲除技术手段的缺乏，基于RNA干扰（RNAi）的有效基因沉默技术在P. americana的功能基因研究中变得不可或缺。本实验方案详细描述了在P. americana中实施RNAi的操作技术，内容包括：（1）选择合适发育阶段的P. americana个体，（2）注射实验条件的准备，（3）双链RNA（dsRNA）的注射，以及（4）基因沉默效率的检测。RNAi是P. americana中一种强大的反向遗传学工具。大多数P. americana组织对细胞外dsRNA具有敏感性。该方法操作简便，研究人员可通过单次或多次靶向dsRNA注射快速获得功能缺失的表型，从而更有效地利用P. americana开展发育与变态相关研究。
引言
RNA干扰（RNAi）是一种在进化上保守的机制，自安德鲁·菲尔（Andrew Fire）和克雷格·梅洛（Craig Mello）2建立双链RNA（dsRNA）介导的基因沉默策略以来，RNAi已逐渐成为在多种生物中抑制基因表达的重要反向遗传学工具1。在细胞内，dsRNA被Dicer酶切割为21-23个核苷酸长度的小片段，即小干扰RNA（siRNA），从而激活RNAi通路。随后，siRNA被整合到RNA诱导的沉默复合体（RISC）中，该复合体与靶标mRNA结合，导致mRNA被切割，最终使基因功能丧失3,4,5。在昆虫中，目前已在多个目中报道了大量系统性RNAi实验，包括直翅目（Orthoptera）、等翅目（Isoptera）、半翅目（Hemiptera）、鞘翅目（Coleoptera）、脉翅目（Neuroptera）、双翅目（Diptera）、膜翅目（Hymenoptera）、鳞翅目（Lepidoptera）和蜚蠊目（Blattodea）5,6,7,8。
蜚蠊（Blattaria）因其快速的生长周期、对环境的强大适应能力以及高度的发育可塑性，成为发育与变态研究中重要的昆虫类群9。在发现RNA干扰（RNAi）技术适用于蜚蠊之前，由于缺乏有效的遗传操作手段，相关研究主要集中于蜚蠊的防治。蜚蠊卵鞘独特的结构使得基于CRISPR-Cas9系统的胚胎注射基因敲除难以实施。此外，蜚蠊多数组织（如 P. americana）表现出强烈的系统性RNAi反应，通过注射一种或多种靶向的双链RNA（dsRNA），可快速获得功能缺失的表型9,10,11。这些特性使RNAi成为研究 P. americana 基因功能不可或缺的技术。
尽管已有文献报道在美洲大蠊（P. americana）的功能基因研究中使用RNA干扰（RNAi）技术，但此前尚无详细或逐步的操作说明。本报告提供了一套针对美洲大蠊（P. americana）的RNAi实验逐步操作指南，该方法也可用于其他蟑螂的基因功能研究。此外，本指南不仅限于蜚蠊目（Blattodea），稍加修改后还可应用于多种其他昆虫。
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方案
P. americana 品系最初由 Dr. Huiling Hao 提供。该物种已通过近交方式维持繁殖30年9。
1. 美洲大蠊（P. americana）的孵化与喂养
- 采集美洲大蠊（P. americana）的新鲜卵鞘（产卵后立即采集），在25 °C、60%湿度的黑暗培养箱中培养约25天。孵化前3天将温度和湿度 提高至30 °C和75%。
- 使用孔径为4 mm的筛子将孵化出的若虫与卵鞘分离。
- 将若虫饲养于圆柱形容器（直径12 cm，高10 cm）中，置于28 °C、70%湿度的黑暗环境中。在容器内壁边缘涂抹凡士林，防止蟑螂逃逸。提供大鼠饲料、水和庇护所（蛋托）。注意观察若虫活动情况，并定期清理粪便和杂物。
2. 选择合适龄期的若虫
- 使用玻璃管挑出刚蜕皮的 P. americana （体色为白色）。将它们置于新的容器中，并等待合适的阶段进行处理。
注意：在上述饲养条件下约19天后，3龄若虫中的rd 蜕皮后的若虫即可用于注射。刚蜕皮的蟑螂体色为白色，若虫的龄期通过蜕皮次数来确定。
3. 带有T7启动子的目标片段的制备
- 以美洲大蠊（P. americana）的cDNA为模板，设计成对引物进行PCR扩增，获得长度为300-800 bp的目标基因DNA片段9。随后将PCR产物克隆至pTOPO载体（见材料表）中进行测序。
- 以目标片段DNA为模板，设计一对新的引物，在其5'端加入T7启动子序列（5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3'），再次进行PCR扩增，获得两端均带有T7启动子的目标片段9。
4. 转录与dsRNA合成 体外
- 在反应体系中加入10 µL T7 2X Buffer、2 µL 酶混合物T7 Express（见材料表）和2 µg PCR产物（步骤3.2中获得），用ddH2O补至总体积20 µL。手动轻轻颠倒混匀，37 °C孵育30分钟，70 °C孵育10分钟，然后缓慢冷却至室温。
- 用ddH2O按1:200比例稀释RNase A溶液（4 µg/µL）。然后向体系中加入1 µL RQ1无RNase DNase（1 U/µL）和1 µL稀释后的RNase A溶液（见材料表）。
注：此时单个反应体系体积为22 µL。 - 37 °C孵育30分钟。然后加入总体积10%的乙酸钠（当同时进行N个反应时，总体积为N × 22 µL）和三倍总体积的异丙醇。
- 手动轻轻颠倒混匀，冰上放置5分钟，4 °C下以13,000 × g离心10分钟。
- 用移液器吸除上清液，用75%乙醇（含25%焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水）洗涤沉淀，然后在4 °C下以13,000 × g离心5分钟。
- 再次吸除上清液。室温下空气干燥沉淀15分钟。用约100 µL DEPC水溶解双链RNA（dsRNA），然后将dsRNA稀释至终浓度2 µg/µL。
注：dsRNA可在-80 °C保存6个月。
5. 将dsRNA溶液装入注射器
- 提前在显微注射泵（参见材料表）中设置好程序，以确保每次注射的体积保持一致。使用注射器前，用DEPC水冲洗注射器8–10次，以清洁注射器。
- 将10 µL注射器安装到显微注射泵上，启动泵，用10 µL的dsRNA溶液（步骤4.6中制备）充满注射器。向3龄若虫（参见步骤2）注射1 µL dsRNA，并确保溶液未泄漏至体外。
6. 向美洲大蠊（P. americana）注射dsRNA
- 用高浓度的 CO2 麻醉蟑螂2 将蟑螂放入容器中，直至其不再移动，然后立即进行注射。
- 用镊子轻轻夹起蟑螂，用手将蟑螂移向针头。接着，将针头插入 通过 两个腹部体节与表皮水平方向之间的间隙。约 插入深度，越浅越好。
- 然后，将dsRNA溶液注射到蟑螂体内。最后，抽出针头。确保针尖尽可能靠近表皮，以避免损伤内部器官。
注意：注射应在解剖显微镜下进行。 - 将注射后的蟑螂放入干净的生物测定容器中。静置约10-20分钟，使其从CO₂麻醉中恢复。2 效应。在容器上标记注射日期、dsRNA 类型及剂量、以及虫龄 P. americana.
- 将注射后的蟑螂置于28 °C、70%湿度的黑暗环境中，提供水、饲料和庇护所，并定期观察蟑螂表型的可能变化。
7. 沉默效果验证与表型分析
- 使用任何可用的分子生物学技术（如定量实时 PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹法）评估 RNA 干扰的效率。有关详细的 qRT-PCR 和蛋白质印迹实验步骤，请参见参考文献1,12。
- 为观察和分析与 RNA 干扰相关的表型，应使用适用于活体动物的显微镜。
注意：RNA 干扰可能影响蜚蠊的形态、行为、蜕皮、附肢再生及其他生理活动。表型出现的具体频率需根据具体条件进行计算。
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结果
图1 显示注射成功。应将带有微细针头的微量注射器水平放置在增压器上图1A）。针头插入 通过 腹部体节之间沿表皮水平方向的间隙（图1B）。确保液体进入 P. americana 腹部。针头角度过陡会损伤内脏器官（图1C），而注射不当会导致dsRNA溶液从腹部泄漏出来（图1D）。如果有任何dsRNA泄漏，该动物需弃用，并重新进行一次注射。 P. americana 注射过程中需要完全麻醉。
与其他生物学实验一样，在进行RNAi处理时需要设置对照组。必须确认处理差异是由靶向RNAi引起的，而非由dsRNA的脱靶效应、注射过程中的损伤或CO2 麻醉。此处 Ddc (多巴脱羧酶）和
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讨论
本报告描述了一种在P. americana中实施RNA干扰的逐步方法学策略；值得注意的是，该方法经微小调整后也可应用于其他蟑螂（例如Blattella germanica）以及多种其他昆虫。然而，RNA干扰的基因沉默效率并不总是足够高，与基因敲除策略相比存在明显劣势13。基因水平的残留效应可能干扰对真实表型的观察。为确保RNA干扰处理成功，需考虑多个关键条件，包括动物的生理状态、对照组的选择、dsRNA分子的长度与浓度、避免脱靶效应（OTE）的可能性，以及不同组织对dsRNA的敏感性差异。
身体状况 P. americana
健康的动物是RNAi及不同基因功能研究成功的基础 P. americana此外，为了保持实验的一致性，仅选择在相同条件下饲养的蟑螂。并且只选用龄期大于3的若虫rd 三龄若虫（孵化后约19天）可用于实验，因为 younger 若虫体型过小，无法...
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究得到国家自然科学基金（项目编号：32070500、31620103917、31330072 和 31572325，授予 C.R.、Sh.L.）、广东省自然科学基金（项目编号：2021B1515020044 和 2020A1515011267，授予 C.R.）、广东省科学技术厅（项目编号：2019B090905003 和 2019A0102006）、广州市科学技术局（项目编号：202102020110）以及深圳市科技计划项目（项目编号：KQTD20180411143628272，授予 Sh.L.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 701 N 10 µL 注射器 (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | 注射 |
| 培养箱 | 宁波江南仪器厂 | RXZ-380A-LED | 用于蜚蠊的孵化与饲养 |
| 微量注射泵 | Alcott 生物技术公司 | ALC-IP600 | 注射 |
| pTOPO-Blunt 克隆试剂盒 | Aidlab 生物技术公司 | CV16 | 用于基因克隆 |
| 定量实时荧光 PCR 系统 | Bio-Rad | CFX Connect | 用于 qRT-PCR 分析 |
| T7 RiboMAX Express RNAi 系统 | Promega | P1700 | 用于合成 dsRNA，包含 RNase A 溶液 (4 μg/μL)、乙酸钠 3.0 M (pH 5.2)、酶混合液 T7 Express、无核酸酶水、Express T7 2× 缓冲液、RQ1 无 RNase 的 DNase |
| PCR 扩增仪 | Bio-Rad | S1000 | 用于 DNA 扩增 |
参考文献
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