本方案详细描述了美洲大蠊（P. americana）中RNAi操作技术的逐步操作指南。
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摘要
摘要
蜚蠊是一种卫生害虫，但由于其易于饲养且具有不完全变态的特征，成为昆虫发育与变态研究中的重要物种。结合其基因组序列已得到充分注释的优势，美洲大蠊（Periplaneta americana）已成为重要的不完全变态昆虫研究模型。由于基因敲除技术手段的缺乏，基于RNA干扰（RNAi）的有效基因沉默技术在P. americana的功能基因研究中变得不可或缺。本实验方案详细描述了在P. americana中实施RNAi的操作技术，内容包括：（1）选择合适发育阶段的P. americana个体，（2）注射实验条件的准备，（3）双链RNA（dsRNA）的注射，以及（4）基因沉默效率的检测。RNAi是P. americana中一种强大的反向遗传学工具。大多数P. americana组织对细胞外dsRNA具有敏感性。该方法操作简便，研究人员可通过单次或多次靶向dsRNA注射快速获得功能缺失的表型，从而更有效地利用P. americana开展发育与变态相关研究。
引言
RNA干扰（RNAi）是一种在进化上保守的机制，自安德鲁·菲尔（Andrew Fire）和克雷格·梅洛（Craig Mello）2建立双链RNA（dsRNA）介导的基因沉默策略以来，RNAi已逐渐成为在多种生物中抑制基因表达的重要反向遗传学工具1。在细胞内，dsRNA被Dicer酶切割为21-23个核苷酸长度的小片段，即小干扰RNA（siRNA），从而激活RNAi通路。随后，siRNA被整合到RNA诱导的沉默复合体（RISC）中，该复合体与靶标mRNA结合，导致mRNA被切割，最终使基因功能丧失3,4,5。在昆虫中，目前已在多个目中报道了大量系统性RNAi实验，包括直翅目（Orthoptera）、等翅目（Isoptera）、半翅目（Hemiptera）、鞘翅目（Coleoptera）、脉翅目（Neuroptera）、双翅目（Diptera）、膜翅目（Hymenoptera）、鳞翅目（Lepidoptera）和蜚蠊目（Blattodea）5,6,7,
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方案
P. americana 品系最初由 Dr. Huiling Hao 提供。该物种已通过近交方式维持繁殖30年9。
1. 美洲大蠊（P. americana）的孵化与喂养
- 采集美洲大蠊（P. americana）的新鲜卵鞘（产卵后立即采集），在25 °C、60%湿度的黑暗培养箱中培养约25天。孵化前3天将温度和湿度 提高至30 °C和75%。
- 使用孔径为4 mm的筛子将孵化出的若虫与卵鞘分离。
- 将若虫饲养于圆柱形容器（直径12 cm，高10 cm）中，置于28 °C、70%湿度的黑暗环境中。在容器内壁边缘涂抹凡士林，防止蟑螂逃逸。提供大鼠饲料、水和庇护所（蛋托）。注意观察若虫活动情况，并定期清理粪便和杂物。
2. 选择合适龄期的若虫
- 使用玻璃管挑出刚蜕皮的 P. americana （体色为白色）。将它们置于新的容器中，并等待合适的阶段进行处理。
注意：在上述饲养条件下约19天后，3龄若虫中的rd 蜕皮后的若虫即可用于注射。刚蜕皮的蟑螂体色为白色，若虫的龄期通过蜕皮次数来确定。....
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结果
图1 显示注射成功。应将带有微细针头的微量注射器水平放置在增压器上图1A）。针头插入 通过 腹部体节之间沿表皮水平方向的间隙（图1B）。确保液体进入 P. americana 腹部。针头角度过陡会损伤内脏器官（图1C），而注射不当会导致dsRNA溶液从腹部泄漏出来（图1D）。如果有任何dsRNA泄漏，该动物需弃用，并重新进行一次注射。 P. americana 注射过程中需要完全麻醉。
与其他生物学实验一样，在进行RNAi处理时需要设置对照组。必须确认处理差异是由靶向RNAi引起的，而非由dsRNA的脱靶效应、注射过程中的损伤或CO2 麻醉。此处 Ddc (多巴脱羧酶）和
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讨论
本报告描述了一种在P. americana中实施RNA干扰的逐步方法学策略；值得注意的是，该方法经微小调整后也可应用于其他蟑螂（例如Blattella germanica）以及多种其他昆虫。然而，RNA干扰的基因沉默效率并不总是足够高，与基因敲除策略相比存在明显劣势13。基因水平的残留效应可能干扰对真实表型的观察。为确保RNA干扰处理成功，需考虑多个关键条件，包括动物的生理状态、对照组的选择、dsRNA分子的长度与浓度、避免脱靶效应（OTE）的可能性，以及不同组织对dsRNA的敏感性差异。
身体状况 P. americana
健康的动物是RNAi及不同基因功能研究成功的基础 P. americana此外，为了保持实验的一致性，仅选择在相同条件下饲养的蟑螂。并且只选用龄期大于3的若虫rd 三龄若虫（孵化后约19天）可用于实验，因为 younger 若虫体型过小，无法.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究得到国家自然科学基金（项目编号：32070500、31620103917、31330072 和 31572325，授予 C.R.、Sh.L.）、广东省自然科学基金（项目编号：2021B1515020044 和 2020A1515011267，授予 C.R.）、广东省科学技术厅（项目编号：2019B090905003 和 2019A0102006）、广州市科学技术局（项目编号：202102020110）以及深圳市科技计划项目（项目编号：KQTD20180411143628272，授予 Sh.L.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 701 N 10 µL 注射器 (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | 注射 |
| 培养箱 | 宁波江南仪器厂 | RXZ-380A-LED | 用于蜚蠊的孵化与饲养 |
| 微量注射泵 | Alcott 生物技术公司 | ALC-IP600 | 注射 |
| pTOPO-Blunt 克隆试剂盒 | Aidlab 生物技术公司 | CV16 | 用于基因克隆 |
| 定量实时荧光 PCR 系统 | Bio-Rad | CFX Connect | 用于 qRT-PCR 分析 |
| T7 RiboMAX Express RNAi 系统 | Promega | P1700 | 用于合成 dsRNA，包含 RNase A 溶液 (4 μg/μL)、乙酸钠 3.0 M (pH 5.2)、酶混合液 T7 Express、无核酸酶水、Express T7 2× 缓冲液、RQ1 无 RNase 的 DNase |
| PCR 扩增仪 | Bio-Rad | S1000 | 用于 DNA 扩增 |
参考文献
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431(2012).
- Fire, A., et al.
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