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方法文章

一种基于 cryoSPARC、RELION 和 Scipion 的稳健单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）处理流程

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DOI：

10.3791/63387

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2022年1月31日

 , 
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

本文内容

摘要

本文介绍了如何有效利用三种冷冻电镜处理平台——cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3，构建一个适用于多种单颗粒数据集的单一且稳健的工作流程，以实现高分辨率结构解析。

摘要

近年来，仪器设备和图像处理软件的不断进步已使单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）成为结构生物学家解析多种大分子高分辨率结构的首选方法。目前有多个软件套件可供新手和专家用户进行图像处理与结构计算，这些软件均遵循相似的基本流程：显微镜探测器采集的原始电影数据首先进行辐照诱导运动校正和对比度传递函数（CTF）估计；随后，从校正后的电影帧平均图像中选取并提取颗粒图像，进行迭代式的二维和三维分类，继而完成三维重构、精修与验证。由于不同软件包采用的算法各异，且操作所需的专业水平不同，其生成的三维图谱在质量和分辨率上常存在差异。因此，用户通常需要在多个程序之间转换数据，以获得最优结果。本文旨在为用户提供一份操作指南，介绍如何在常用软件平台 cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3 之间构建连贯的工作流程，以解析腺相关病毒（AAV）的近原子分辨率结构。我们首先详细描述使用 cryoSPARC v3 的图像处理流程，因其高效的算法和用户友好的图形界面可帮助用户快速获得三维图谱。接下来，利用 PyEM 工具及自研脚本，将 cryoSPARC v3 中获得的最佳质量三维重构所对应的颗粒坐标转换并导入 RELION-3 和 Scipion 3，并重新计算三维图谱。最后，我们概述如何结合 RELION-3 和 Scipion 3 中的算法，对所得结构进行进一步精修与验证。本文阐述了如何有效整合三个处理平台，构建统一且稳健的工作流程，适用于多种数据集的高分辨率结构解析。

引言

冷冻电子显微镜技术（cryo-EM）与单颗粒分析（SPA）能够解析多种生物大分子复合体在水合状态下的结构，有助于在原子水平上阐明这些大分子的功能。显微镜光学系统、计算机硬件以及图像处理软件的进步，使得生物大分子结构的分辨率已达到2 Å以下1,2,3。2020年，共有超过2,300个cryo-EM结构被提交至蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB），而2014年仅为192个4，表明cryo-EM已成为许多结构生物学家的首选方法。本文介绍了一种结合三种不同单颗粒分析程序的工作流程，用于高分辨率结构解析（图1）。

单颗粒分析（SPA）的目标是从显微镜探测器记录的含噪声二维图像中重建目标样品的三维结构。探测器以电影形式采集图像，其中每一帧均为同一视野的图像。为了保护样品，各帧图像采用低电子剂量采集，因此信噪比（SNR）较低。此外，电子束照射可能引起玻璃态冷冻电镜载网内部的运动，导致图像模糊。为克服这些问题，需对各帧图像进行对齐以校正电子束诱导的运动，并通过平均化处理获得信噪比提升的显微照片。随后，对这些显微照片进行对比度传递函数（CTF）估计，以校正显微镜所引入的离焦和像差效应。在CTF校正后的显微照片中，挑选、提取单个颗粒，并将其分类为二维类别平均图像，以代表样品在玻璃态冰中所呈现的不同取向。所得的均一颗粒集合被用作从头（ab initio ）三维重建的输入，以生成粗略的一个或多个初始模型，随后通过迭代优化获得一个或多个高分辨率结构。重建完成后，进一步进行结构精修，以提高冷冻电镜密度图的质量与分辨率。最终，可直接从密度图中构建原子模型，或将该密度图与来自其他途径的原子坐标进行拟合。

可用于完成上述任务的软件包包括 Appion5、cisTEM6、cryoSPARC7、EMAN8、IMAGIC9、RELION10、Scipion11、SPIDER12、Xmipp13 以及其他软件。尽管这些程序遵循相似的处理步骤，但在例如颗粒挑选、初始模型生成和重构优化等环节采用了不同的算法。此外，这些程序在操作时对用户知识水平和干预程度的要求各不相同，其中一些程序依赖于参数的精细调节，可能对新用户构成使用障碍。这些差异常常导致不同平台获得的重构图谱在质量和分辨率上不一致14，因此许多研究人员倾向于使用多个软件包对结果进行优化和验证。本文重点介绍如何利用 cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3 获得腺相关病毒（AAV）的高分辨率三维重构，AAV 是基因治疗中广泛使用的载体15。上述软件包对学术用户免费；但 cryoSPARC v3 和 Scipion 3 需要获取许可证。

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方案

1. 创建新的 cryoSPARC v3 项目并导入数据

注意：数据由位于波特兰的俄勒冈健康与科学大学（OHSU）使用配备Falcon 3直接电子探测器的300 kV Titan Krios透射电子显微镜采集。图像以计数模式采集，总剂量为28.38 e−/Å2，分129帧采集，欠焦范围为-0.5 µm至-2.5 µm，像素尺寸为1.045 Å，使用EPU软件完成。AAV-DJ样品由OHSU工作人员提供。

  1. 在网页浏览器中打开 cryoSPARC v3，点击 Projects 标题。选择 + Add 以创建一个新项目。为项目命名，并提供一个现有目录的路径，用于保存作业和数据。
  2. 通过打开项目，点击 + Add，然后选择 New Workspace 来为该项目创建一个工作区。为工作区命名后点击 Create。
  3. 进入新创建的工作区，在右侧面板打开 Job Builder。该选项卡显示了 cryoSPARC v3 中所有可用的功能。点击 Import Movies，并提供电影文件路径、增益参考文件路径，以及设置以下采集参数：Raw Pixel Size 1.045 Å，Accelerating Voltage 300 kV，Spherical Aberration 2.7 mm，Total Exposure Dose 28.38 e-/Å^2。
  4. 点击 Queue，选择一个用于运行任务的计算节点和工作区，然后点击 Create。
    注意：采集参数取决于样品和显微镜的配置。

2. CryoSPARC v3 - 电影对齐与CTF估计

  1. 打开 Patch Motion Correction (Multi)。此任务需要步骤 1.3 中导入的电影文件作为输入。在工作区中打开导入电影的任务卡片，将 Imported_movies 输出拖动到新任务中的电影占位符上，然后点击 Queue 启动任务。
    注意：有关本文所述 cryoSPARC 方法的更多信息，请参见 cryoSPARC 教程16。
  2. 进行 CTF 估计时，打开 Patch CTF Estimation (Multi)，输入步骤 2.1 中生成的显微图像，并点击 Queue 启动任务。
  3. 为检查平均化和 CTF 校正后的显微图像并选择部分图像用于后续处理，打开 Curate Exposures，输入步骤 2.2 中获得的曝光图像，然后点击 Queue 启动任务。
  4. 当任务进入 Waiting 模式后，点击任务卡片上的 Interaction 标签页，调整参数阈值，逐个接受或拒绝显微图像用于后续处理。应接受估计 CTF 与实验 CTF 匹配良好的显微图像（图 2），并剔除存在严重像散、CTF 拟合差或冰层过厚的图像。
  5. 在处理当前数据时，将像散的上限阈值设为 400 Å，CTF 拟合分辨率设为 5 Å，相对冰层厚度设为 2。点击 Done 以选定用于下游处理的显微图像。

3. CryoSPARC v3 — 手动与基于模板的颗粒挑选

  1. 打开手动挑选器，输入步骤 2.4–2.5 中接受的曝光图像，然后提交任务。点击交互式选项卡，将框选尺寸（像素）设置为 300，在多张显微照片中手动挑选数百个颗粒，并避免选择重叠的颗粒。本实验共在 29 张显微照片中挑选了 340 个颗粒。完成后，点击完成挑选！提取颗粒。
    注意：本方案采用手动颗粒挑选以生成用于自动挑选的模板，但也可使用其他方法17。
  2. 为生成自动颗粒挑选的模板，点击二维分类，输入步骤 3.1 中生成的颗粒挑选结果。将二维类别数量更改为 10，并提交任务。
  3. 打开选择二维类别，输入步骤 3.2 中获得的颗粒和类别平均图像，然后点击交互式选项卡。选择信噪比较高的代表性二维类别，点击完成。
    注意：类别平均图像反映了颗粒的不同视角。应选择能够代表各个视角的类别平均图像。目标是生成能够代表样品不同视角的清晰模板，用于后续自动挑选。
  4. 打开模板挑选器，输入步骤 3.3 中选定的二维类别以及步骤 2.4–2.5 中的显微照片。将颗粒直径（Å）设置为 220 Å，并提交任务。
  5. 为检查自动挑选结果，打开选择颗粒挑选结果，输入步骤 3.4 中生成的颗粒和显微照片，并提交任务。
  6. 在选择颗粒挑选结果的任务卡片中，点击交互式选项卡，并将框选尺寸（像素）设为 300。点击单张显微照片，调节低通滤波器直至颗粒清晰可见，将归一化互相关（NCC）阈值设为 0.41，功率阈值设为 54000 至 227300 之间。
  7. 检查多张显微照片，必要时调整阈值，以确保大多数真实颗粒被选中，同时避免假阳性。完成后，点击完成挑选！提取颗粒。
    注意：真实颗粒通常具有较高的 NCC 值和功率得分，分别表明其与模板相似且信噪比较高。
  8. 打开从显微照片中提取，输入步骤 3.7 中的显微照片和颗粒。将提取框尺寸（像素）设为 300，并提交任务。

4. CryoSPARC v3 - 二维分类

  1. 点击2D 分类，并输入步骤 3.8 中提取的颗粒。将2D 类别数量设置为 50，然后提交任务。
  2. 为选择适用于后续处理的最佳 2D 类别，请打开选择 2D 类别。输入在步骤 4.1 中获得的颗粒和类别平均图像。点击交互式选项卡，并根据分辨率和类别中颗粒的数量选择 2D 类别（图 3）。请勿选择包含伪影的类别。完成选择后，点击完成。
    注意：通常需要进行多轮 2D 分类，以去除未能聚类为清晰、明确定义类别的颗粒。根据需要重复进行多轮 2D 分类，以从数据集中去除此类颗粒（图 3）。

5. CryoSPARC v3 - 从头算 重构与均一化精修

  1. 为生成初始的三维结构，打开Ab-initio Reconstruction，并输入步骤4.2中获得或最终二维分类得到的颗粒。将Symmetry调整为二十面体对称性，然后Queue该任务。
    注意：对称性取决于样品，应根据实际情况进行调整。若未知，可使用C1对称性。
  2. 打开Homogeneous Refinement，输入步骤5.1得到的体积结构以及来自步骤4.2或最终二维分类的颗粒。更改Symmetry后Queue该任务。任务完成后，检查傅里叶壳层相关（FSC）曲线，并下载该体积结构在UCSF Chimera18中进行观察。

6. 使用 PyEM 从 cryoSPARC v3 导出颗粒坐标并导入到 RELION-3

注意：颗粒坐标包含每张显微照片中各个颗粒位置的信息。将坐标而非颗粒堆栈导入 RELION-3，可实现原本无法执行的精修步骤。例如，颗粒抛光（particle polishing）需要访问原始电影帧。因此，在将颗粒坐标从 cryoSPARC v3 导出至 RELION-3 之前，需先在 RELION-3 中导入电影文件，并进行运动校正和CTF估计。详见 RELION-3 教程19 。

  1. 进入 RELION-3 项目目录并启动 RELION-3。
  2. 在任务类型浏览器中打开 Import，并按照步骤 1.3 指定电影文件和采集参数的路径。
  3. 为进行运动校正，通过 RELION-3 图形用户界面使用 UCSF MotionCor220 ，打开 Motion Correction，并将默认参数设置为与 UCSF MotionCor2 手册21 中一致。输入步骤 6.2 中导入的电影文件路径。在 Motion 选项卡中，指定 motioncor2 可执行文件 的路径。
    注意：MotionCor2 可使用多个 GPU 并行运行。
  4. 通过 RELION-3 图形用户界面使用 CTFFIND-4.122 进行 CTF 估计。打开 CTF Estimation，并输入步骤 6.3 生成的 micrographs.star 文件。在 CTFFIND-4.1 选项卡中，指定 CTFFIND-4.1 可执行文件的路径，并按照 RELION-3.1 教程19 设置参数。
  5. 为将粒子堆栈从 cryoSPARC v3 导入 RELION-3，需首先从 cryoSPARC v3 导出。在 cryoSPARC v3 中，打开步骤 4.2 或最终 2D 分类的 Select 2D class 任务卡片。在 Details 选项卡中，点击 Export Job。Export job 将输出 particles_exported.cs 文件。
  6. 在将粒子坐标从 cryoSPARC v3 导入 RELION-3 之前，必须将步骤 6.5 中的 particles_exported.cs 文件转换为 .star 格式。使用 PyEM23，通过执行以下命令将 particles_exported.cs 文件转换为 .star 格式：csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. 在 RELION-3 中，点击 Manual Picking 选项卡，在 I/O 选项卡中输入步骤 6.4 中描述的 CTF 精修后的显微照片。在 Display 选项卡中输入以下参数：Particle diameter (A): 220，Lowpass Filter (A): -1，Scale for CTF image: 0.5。然后 Run 该任务。将在 RELION-3 主目录下生成一个名为 ManualPick 的文件夹。
    注意：此步骤旨在在 RELION-3 中创建手动挑选的文件夹结构。在执行手动挑选时，对于在 RELION-3 图形用户界面中用于挑选的每张平均显微照片，都会生成一个包含所选粒子坐标的 .star 文件。
  8. 进入包含步骤 6.6 中 particles_exported.star 文件的文件夹，并运行一个自编脚本，为每张用于 cryoSPARC v3 粒子挑选并参与步骤 6.5 导出的最终 2D 分类的平均显微照片生成一个单独的 manualpick.star 文件。生成的坐标文件将保存在 ManualPick/Movies 文件夹中。
  9. 返回 RELION-3 并重新打开 Manual Picking 任务，点击 Continue。这将在 RELION-3 图形用户界面中显示先前在 cryoSPARC v3 中挑选的粒子。检查几张显微照片，以确认粒子坐标的转移是否成功，以及粒子是否被正确选择。

7. RELION-3 - 颗粒提取与二维分类

  1. 点击Particle Extraction。在I/O选项卡中，输入步骤6.4中获得的CTF校正后的显微照片以及步骤6.9中获得的坐标文件。切换至Extract选项卡，将Particle Box Size (pix)修改为300，然后运行该任务。
  2. 进行2D分类，以进一步筛选在cryoSPARC v3中生成的粒子集，从而获得更高分辨率的重构结果。点击2D Classification，在I/O选项卡中输入步骤7.1生成的particles.star文件。在Optimisation选项卡中，将Number of Classes设置为50，将Mask Diameter (A)设置为280，然后运行该任务。
    注意：掩膜应覆盖整个粒子。
  3. 为选择最优的2D分类结果，点击Subset Selection方法，输入步骤7.2生成的_model.star文件，然后运行该任务。按照步骤4.2中的描述选择分类结果。
  4. 重复步骤7.2和7.3，以去除未收敛的粒子。

8. RELION-3 - 三维重构、掩模创建与后处理

  1. 使用在 cryoSPARC v3 中生成的图谱（步骤 5.2）作为 RELION-3 中进行 3D 精修的初始模型。选择导入方法，并在输入/输出选项卡中设置以下参数：导入原始电影/显微照片：否，原始输入文件：Movies/*.mrc。
  2. 提供 MTF 文件，并按照步骤 1.3 的描述输入电影采集参数。在其他选项卡中，选择 cryoSPARC v3 图谱作为输入文件，将节点类型更改为 3D 参考图谱 (.mrc)，然后运行该任务。
  3. 选择3D 自动精修，在输入/输出选项卡中，将步骤 7.3 或上一次筛选任务生成的 particles.star 文件设为输入图像。将 cryoSPARC v3 重构结果作为参考图谱。点击参考选项卡，将初始低通滤波 (Å)设为 50，对称性设为二十面体。在优化选项卡中，将掩膜直径 (Å)改为 280，然后运行该任务。
  4. 任务完成后，在 UCSF Chimera 中打开 run_class001.mrc。
  5. 在 UCSF Chimera 中，点击工具，在体积数据下选择体积查看器。这将打开一个新窗口以调整体积设置。将步长设为 1，并调节滑块直至达到图谱无噪声的阈值水平。记录此数值，下一步创建掩膜时将使用该值。
  6. 自动精修生成的图谱不能真实反映 FSC，因为周围溶剂区域的噪声会降低分辨率。在进行后处理之前，需创建一个掩膜以区分样品与溶剂区域。
    1. 点击掩膜创建，输入步骤 8.3 生成的 run_class001.mrc。
    2. 点击掩膜选项卡并按如下方式调整参数：图谱低通滤波 (Å)：10，像素尺寸 (Å)：1.045，初始二值化阈值：步骤 8.5 中获得的水平值，将二值图扩展若干像素：3，添加若干像素的软边缘：3。然后运行该任务。
  7. 在 UCSF Chimera 中检查掩膜。如果掩膜过紧，可增加将二值图扩展若干像素和/或添加若干像素的软边缘的数值。创建具有软边缘的掩膜非常重要，因为锐利的掩膜可能导致过拟合。
  8. 点击后处理，在输入/输出选项卡中输入步骤 8.3 生成的半图谱以及步骤 8.6 生成的掩膜。将校准像素尺寸设为 1.045 Å。在锐化选项卡中输入以下内容：是否自动估计 B 因子？：是，自动 B 因子拟合的最低分辨率 (Å)：10，使用自定义 B 因子？：否。在滤波选项卡中，将跳过 FSC 加权？设为否。然后运行该任务。

9. RELION-3 - 精修训练与颗粒精修

  1. 在对每个粒子的束流诱导运动进行校正之前，首先使用训练模式为数据集确定最佳的运动轨迹。打开Bayesian Polishing，在I/O选项卡中输入第6.3步得到的运动校正后的显微照片、第8.3步得到的粒子以及第8.8步得到的后处理.star文件。点击Training选项卡并设置以下参数：Train Optimal Parameters: 是，Fraction of Fourier Pixels for Testing：0.5，Use this many Particles：5000。然后点击Run运行任务。
    注意：该脚本将在RELION-3 Polish文件夹中生成一个名为opt_params_all_groups.txt的文件，其中包含执行下一步所需的最佳化抛光参数。
  2. 当训练任务完成后，点击Bayesian Polishing，进入Training选项卡并将Train Optimal Parameters?设置为否。选择Polish选项卡，在Optimised Parameter File中指定第9.1步生成的opt_params_all_groups.txt文件的路径，然后点击Run。
  3. 使用一组经过抛光处理的粒子，重复进行3D精细重构（第8.3步）和后处理（第8.8步）。

10. RELION-3 - CTF 与单颗粒精细化

  1. 为了估算高阶像差，打开 CTF 精修 以及，在 输入/输出 标签下方 颗粒选择最近的3D精修任务中包含抛光后颗粒的.star文件路径（run_data.star）。
    1. 下方 后处理 Star 文件，设置为最新后处理任务（步骤 9.3）的输出路径。
    2. 选择 适合 选项卡并设置以下参数： 估计（各向异性放大）： 不， 执行CTF参数拟合？ 不， 估算光束倾斜度： 是的， 还应估算三叶因子吗？ 是的， 估算 4th 像差排序？ 是。 运行 工作。
  2. 使用以下输入重复步骤 10.1 颗粒（来自 Refine3D） 在上一个任务中生成（particles_ctf_refine.star）。在 适配 标签，更改 估计（各向异性放大） 是和 运行 工作。
  3. 使用输入重复步骤 10.2 颗粒（来自 Refine3D） 在上一个任务中生成的（particles_ctf_refine.star）。在 适配 选项卡，设置以下参数： 估算（各向异性放大）：不， 执行CTF参数拟合？是的， 拟合离焦？每个颗粒 矫正散光？ 每张显微照片 拟合B因子？：不， 拟合相移：不， 估算光束倾斜？：不， 估算 4th 像差排序？：否。 运行 它。
    注意：只要颗粒具有足够的对比度，即可 矫正散光？ 标签可设置为 单颗粒。对于本数据集， 单颗粒 散光校正并未提高图谱的质量和分辨率。
  4. 使用第10.3步中的粒子进行3D分类重构，并在I/O选项卡中设置 使用溶剂压平的FSCs？ 是。运行完成后，执行后处理作业（步骤 8.8），并在 UCSF Chimera 中查看图谱（步骤 5.2）。

11. 将 RELION-3 粒子坐标和 3D 图谱传递到 Scipion 3

  1. 为了进一步优化和验证 RELION-3 重构图谱，首先将上一步后处理任务（步骤 10.4）中的体积图和粒子导入 Scipion 3。启动 Scipion 3 并创建一个新项目。
  2. 在左侧的 Protocols 面板中，选择 Imports 下拉菜单，然后点击 Import Particles。修改以下参数：Import From：RELION-3，Star File：postprocess.star，并按照步骤 1.3 设置采集参数。点击 Execute。
  3. 点击 Imports 下拉菜单，选择 Import Volumes。在 Import From 中指定 RELION-3 图谱的路径。将 Pixel Size (Sampling Rate) Å/px 更改为 1.045，然后点击 Execute。

12. Scipion 3 - 高分辨率重构

  1. 首先，进行全局比对。在 Protocols 面板中选择 Refine 下拉菜单，点击 Xmipp3 - highres24。将步骤 11.2 和 11.3 中导入的颗粒和体积分别作为 Full-Size Images 和 Initial Volumes 输入，并将 Symmetry Group 设置为二十面体对称。在 Angular Assignment 下的 Image Alignment 选项卡中，选择 Global，并将 Max Target Resolution 设置为 3 Å，然后 Run 该任务。
  2. 任务完成后，点击 Analyze Results。在新窗口中，点击 UCSF Chimera 图标以查看优化后的体积。此外，点击 Display Resolution Plots (FSC) 查看精修后FSC的变化情况，并点击 Plot Histogram with Angular Changes 查看欧拉角分配是否发生变化。
    注：根据输入的 RELION-3 结构的分辨率，此步骤可能需要在 Angular Assignment 选项卡下使用不同的 Max Target Resolution 值重复多次。更多信息请参见 Scipion 教程25。
  3. 使用局部比对重复步骤 12.1。复制上一个任务，并将 Select Previous Run 更改为 Xmipp3 - highres Global。在 Angular Assignment 选项卡中，将 Image Alignment 更改为 Local，并将 Max Target Resolution 设置为 2.1 Å。
  4. 在 UCSF Chimera 中检查优化后的图谱，并分析 FSC 和角度分配的变化（见步骤 12.2）。重复局部精修，直到分辨率不再提升且角度分配趋于收敛，必要时调整 Max Target Resolution。
  5. Scipion 3 输出的图谱可在 Phenix26 中进一步进行密度修饰和锐化处理。

13. Scipion 3 - 三维密度图验证

  1. 在 Xmipp3 - highres 中生成的最终图谱中检查局部分辨率。打开 Xmipp - local MonoRes27，输入上一步作业得到的最终体积图以及第 8.6 步生成的掩膜。将分辨率范围设置为 1 到 6 Å，间隔为 0.1 Å，并执行该任务。
  2. 运行完成后，点击分析结果，查看分辨率直方图以及按分辨率着色的体积图切片。
  3. 为判断颗粒是否良好对齐，打开多参考对齐性分析（Multireference Alignability）28，输入第 12.3 步中的颗粒和体积图。点击分析结果以显示验证图。理想情况下，所有点应聚集在 (1.0,1.0) 附近。
  4. 打开Xmipp3 - 验证过拟合（Validate Overfitting），输入第 12.3 步中的颗粒和体积图。运行完成后，分析结果并检查过拟合图。若对齐的高斯噪声曲线与对齐的颗粒曲线发生交叉，则表明存在过拟合现象。

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结果

我们介绍了一种全面的单颗粒冷冻电镜（SPA）分析流程，该流程使用三种不同的处理平台：cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3，以获得高分辨率结构。图1 和 图4 概括了通用的处理工作流程，表1 详细列出了精修所用的实验方案。这些方案在腺相关病毒（AAV）2.3 Å 结构的精修过程中得到应用，最终达到了接近奈奎斯特分辨率的水平。

首先将电影文件导入 cryoSPARC v3，并进行运动校正和CTF校正，以生成平均显微照片。在选择用于后续处理的显微照片时，应优先选取CTF拟合良好且像散较低的图像（图2），因为纳入质量较差的显微照片可能会影响后续处理步骤，导致重构分辨率降低。随后从选定的显微照片中挑选并提取了27,364个颗粒。由于AAV的直径约为220 Å，像素尺寸为1.045 Å，因此采用300像素的盒尺寸。接下来通过迭代的2D分类去除伪影以及未能...

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讨论

本文介绍了一种稳健的单颗粒分析（SPA）工作流程，适用于多种软件平台的冷冻电镜数据处理，以实现高分辨率三维重构图1）。该工作流程适用于多种生物大分子。本实验方案的后续步骤概述如下 图4，包括电影预处理、颗粒挑选与分类，以及多种结构精修方法（表格 1）以及验证。本文展示了在 cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3 中的处理步骤，以及在不同软件包之间传输数据的方法。我们展示了在整个流程中逐步获得的中间结构及其分辨率的提升情况。图4, 图6 和 图7).

尽管本文所述方法可用于不同蛋白质和生物复合物的结构测定，但需要注意的是，腺相关...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Carlos Oscar Sorzano在Scipion3安装方面提供的帮助，以及Kilian Schnelle和Arne Moeller在不同处理平台间数据传输方面的协助。本研究的部分工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目U24GM129547支持，并在俄勒冈健康与科学大学（OHSU）的PNCC开展，通过EMSL（grid.436923.9）进行访问；EMSL是美国能源部科学办公室下属的用户设施，由生物与环境研究办公室资助。本研究还得到了罗格斯大学向Arek Kulczyk提供的启动资金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CryoSPARCStructura Biotechnology Inc.https://cryosparc.com/
CTFFIND 4霍华德·休斯医学研究所，马萨诸塞大学陈医学院https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2加州大学旧金山分校大分子结构研究组https://msg.ucsf.edu/software
Phenix大分子中子晶体学计算工具（MNC）http://www.phenix-online.org/
PyEM加州大学旧金山分校https://github.com/asarnow/pyem
RELION英国医学研究理事会结构生物学实验室https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
ScipionInstruct 图像处理中心（I2PC），SciLifeLabhttp://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera加州大学旧金山分校生物计算、可视化与信息学资源中心https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

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一种基于 cryoSPARC、RELION 和 Scipion 的稳健单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）处理流程
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