使用荧光团辅助碳水化合物电泳（FACE）方法测定糖原的葡聚糖链长分布

摘要

在本方案中，荧光团辅助碳水化合物电泳（FACE）技术用于确定糖原的链长分布（CLD）和平均链长（ACL）。

摘要

糖原颗粒是由由α-1，4葡糖苷键连接的葡萄糖基单元的线性链组成的支链多糖。后者通过α-1，6葡萄糖苷键相互连接，称为分支点。在不同形式的碳储存（即淀粉， β葡聚糖）中，糖原可能是生物世界中发现的最古老，最成功的储存多糖之一。葡聚糖链的组织使得大量的葡萄糖可以在需要时快速储存或燃料在细胞中。在过去的几十年中，已经开发了许多互补技术来解决糖原颗粒的精细结构。本文介绍了荧光团辅助碳水化合物电泳（FACE）。该方法量化了组成糖原颗粒的葡聚糖链的群体。也称为链长分布（CLD），此参数反映了颗粒大小和支化百分比。它也是糖原生物合成数学建模的基本要求。

引言

糖原用作碳和能量储存，是葡萄糖的均聚物，由由（1→4）-α键连接的葡萄糖基单元的线性链组成，并通过（1→6）-α糖苷键或分支点连接。它们在各种生物体的细胞质基质中表现为β和α颗粒。β颗粒是微小的水溶性颗粒，主要在原核生物中观察到。它们的直径范围为20-40nm，可能由糖原代谢酶和空间位阻^1，2决定。

首先在动物细胞中描述，较大的α颗粒显示直径可达300nm，具有花椰菜状形状。这种特殊的组织可能起源于几个β粒子的聚集，或者可能通过从单个β粒子³中萌出而产生。有趣的是，最近的一项研究报告了 大肠杆菌⁴中存在α颗粒。然而，与来自动物细胞的α颗粒不同，后者在提取过程中迅速分崩离析，这可以解释文献中缺乏数据⁴。真核生物和原核生物中α颗粒的出现涉及系统发育上不相关的糖原代谢酶⁵。这就提出了关于这种颗粒的功能以及β颗粒⁵之间潜在交联剂的性质的问题。

尽管针对糖原分子形成提出了两种相反的数学模型^{6，7，8，9}，但人们普遍认为，β颗粒已经响应于它们的代谢功能而进化，作为快速释放大量葡萄糖的高效燃料储备。大量证据表明，糖原特性（如消化率和在水中的溶解度）与平均链长（ACL）相关，这将决定分支点的百分比和粒径^{2，6，7，8，10，11}.ACL由葡萄糖残基总数与分支点数量之间的比率定义。通常，真核生物和原核生物中的ACL值分别为11-14和7-23葡萄糖残基，为¹⁰。在人类中，几种糖原紊乱疾病是由于异常的糖原积累。例如，安徒生氏病与糖原分支酶的活性不足有关，导致异常糖原¹¹的积累。在原核生物中，累积研究表明，前交叉韧带是影响糖原降解速率和细菌存活能力的关键因素^12，13。据报道，合成低ACL值β颗粒的细菌降解速度较慢，因此承受饥饿条件的时间更长。因此，了解β颗粒的结构对于了解人类糖原贮积病中异常糖原颗粒的形成和原核生物在营养缺乏的环境中的生存至关重要。

自从法国生理学家克劳德·伯纳德（Claude Bernard）在¹⁹世纪后期首次从狗肝中分离出糖原以来，已经开发了许多技术来详细表征糖原颗粒。例如，用于糖原形态学（α或β颗粒）的透射电子显微镜¹⁵，用于确定α-1，6键16百分比的质子-NMR光谱^法，用于推断分子量的多检测器的尺寸排阻色谱，荧光团辅助碳水化合物电泳（FACE）¹⁷ 或具有脉冲安培检测（HPAEC-PAD）的高性能阴离子交换色谱（HPAEC-PAD）用于链长分布（CLD）和ACL 确定¹⁸.

本研究的重点是荧光团辅助碳水化合物电泳方法，该方法依赖于伯胺功能对半缩醛基团的还原胺化。从历史上看，8-氨基-1，3，6-萘三磺酸（ANTS）首先用于标记。后来，它被更灵敏的荧光团，8-氨基1，3，6芘三磺酸（APTS）¹⁹所取代。

图1:与8-氨基1，3，6芘三磺酸（APTS）的还原胺化反应。 在还原条件下，8-氨基1，3，6芘三磺酸（APTS）的伯胺功能对半缩醛基团的还原胺化反应 请单击此处查看该图的大图。

如图 1所示，葡聚糖链还原端的半缩醛功能在还原条件下与APTS的伯胺相互作用。APTS的磺基团带有负电荷，能够根据其聚合度（DP）分离葡聚糖链。还原胺反应具有高度的可重复性和效率。DP3至DP135的平均效率标记为80%，麦芽糖（DP2）和葡萄糖的平均效率标记分别为88%和97%，分别为^17，20。由于APTS的一个分子与每个葡聚糖链的还原端反应，因此可以定量单个链并在摩尔基础上相互比较。

方案

1. 用去分枝酶孵育

1. 将200μL纯化的糖原以0.5-2mg / mL与200μL的100mM乙酸盐缓冲液（pH 4.8）混合。加入2μL异淀粉酶（180 U / mg蛋白质）和1.5μL支链淀粉酶（30 U / mg蛋白质）（参见 材料表），通过上下移液轻轻混合，并在42°C下在1.5mL管中孵育16小时。
   注意:在糖原纯化过程中可能会发生降解或淀粉酶污染。为了了解游离麦芽低聚糖的存在，可以在没有去分枝酶混合物的情况下同时孵育样品。在分析中包括标准品（例如麦芽七糖）以确定洗脱时间与聚合度之间的关系。
2. 通过在95°C下孵育5分钟来停止反应。
3. 在室温下以16，100× g 离心5分钟以沉淀并除去任何不溶性物质。
4. 使用移液器除去上清液，并将其转移到新的注释管中。通过加入相当于100μL阴离子/阳离子交换树脂珠（AG-501-X8，见 材料表）并搅拌来脱盐上清液。
   1. 定期搅拌珠子5分钟。通过移液收集样品，并将其放入新的带注释的试管中。
5. 冷冻干燥或使用在30°C下设置的真空蒸发器（参见 材料表）来干燥样品。
6. 将干燥的样品储存在室温或-20°C下。
   注意:样品可以储存1个月。

2. 还原胺化

1. 将干燥的样品与2μL1M氰基硼氢化钠在四氢呋喃（THF）和2μLAPTS（5mgAPTS重悬于48μL15%乙酸中）混合（参见 材料表）。
2. 在42°C下在黑暗中孵育16小时。
   注意:氰基硼氢化钠使用经过改装的个人防护设备和化学罩进行处理。吸入和接触皮肤是剧毒的，可能是致命的，导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。当氰基硼氢化钠与乙酸混合时，会产生剧毒气体。与水接触时，氰基硼氢化钠释放出易燃气体，可自燃。从此步骤开始，浓缩样品在化学罩下处理，并使用合适的个人防护设备。

3. 人脸分析

1. 向每个样品中加入46μL超纯水。
2. 通过将1μL样品加入49μL超纯水中，将样品直接稀释至1/50在100μL的微量小瓶中。将样品保持在黑暗中，同时设置面部（5-10分钟）。
3. 使用带有激光诱导荧光（LIF）检测器的毛细管电泳仪器进行反极性电泳（参见 材料表）。将极性设置为"反向模式"进行分离，将LIF设置为488 nm发射波长，将检测器设置为512 nm。
4. 将注射时间设置为 10 秒，将注射压力设置为 0.5 psi。
5. 在N连接的碳水化合物分离缓冲液中，在60.2厘米长，内径为50μm（375μm）的裸熔融石英毛细管中，在N连接的碳水化合物分离缓冲液中以30 kV进行APTS标记的葡聚糖分离（参见 材料表）。
   注意:N-连接的碳水化合物分离缓冲液每20次运行更换一次。

4. 数据处理

1. 导出 ".ASC"和"。CDF"文件分别包含电泳图轮廓和积分数据。
2. 打开 .ASC 文件并根据时间图表绘制相对荧光单位。
3. 打开 .CDF 文件，继续进行第一次自动积分并调整以下参数:宽度;山谷到山谷的整合;最小面积。
4. 手动检查并更正任何不正确的集成事件。

结果

糖原平均链长的测定
图2 表示推断糖原的链长分布和平均链长（ACL）所需的工作流程。

图 2:确定链长分布 （CLD） 和平均链长的过程。请单击此处查看此图的放大版本。

图3 显示了商用麦芽六糖和去支链牛肝糖原的电泳图。在所有实验中观察到的荧光信号在4.13-4.67分钟之间来自未反应的APTS。标记麦芽六糖（DP6）的洗脱时间估计为8.49分钟（图3A）。根据DP6的洗脱时间鉴定出牛糖原的APTS标记葡聚糖（图3B）。在对照样品中未检测到微量游离麦芽低聚糖（未与去分枝酶一起孵育的糖原）（图3C）。

图3:标准品和牛肝糖原的电泳图 （A）以葡聚糖标准品麦芽六糖（DP6）的时间洗脱（8.49分钟）作为参考，以确定APTS标记葡聚糖在去分枝酶活性作用后从牛肝糖原释放的聚合度（DP）).插图显示了高达44 DP的葡聚糖链的分离。同时，用APTS标记未经处理的牛糖原，以检测样品（C）中可能存在的游离麦芽低聚糖痕迹。 请点击此处查看此图的大图。

可以得出结论，APTS标记的葡聚糖的释放是由于异淀粉酶和拉鲁淀粉酶活性对分支点的裂解。应该注意的是，毛细管电泳曲线可以以更合适的格式重绘，以创建包含多个轮廓的镶嵌图。为此，使用"asc"扩展名生成包含荧光值的数据文件，并通过选择CSV（逗号分隔值）格式在电子表格程序中打开。不幸的是，导出的荧光值与相应的洗脱时间无关。因此，必须根据FACE设备上的采集频率设置手动添加它们（4 Hz表示每0.25秒采集一次值）。

然后使用FACE仪器的本机应用程序推断峰值面积，或导出为扩展名为"cdf"的数据文件以使用另一个应用程序。面积值在电子表格程序中导出，并通过将DP表示为总表面积的百分比进行归一化（图4）。

图 4:数据归一化、链长分布和平均链长值。 在电子表格中导入荧光峰区域并归一化。链长分布显示为每个 DP 的 DP 百分比。平均链长（ACL）是通过对每个百分比链乘以相应的聚合度来计算的。 请点击此处查看此图的大图。

最后，通过计算每个百分比链的总和乘以相应的聚合度来推断平均链长（ACL）。对兔肝糖原（图5A），牛肝糖原（图5B）和牡蛎糖原（图5C）进行了一式三份的实验。

图5:商业糖原的链长分布。 兔肝（A），牛肝（B）和牡蛎糖原（C）在去分枝酶（异淀粉酶和支链淀粉酶）存在下孵育。然后使用FACE分析根据其聚合度（DP）分离APTS标记的葡聚糖。麦芽糖（DP2），麦芽六糖（DP6）麦芽七糖（DP7）分别是兔肝，牡蛎和牛肝糖原中最丰富的葡聚糖。均值标准误（SEM）是从三个独立实验中推断出来的。 请点击此处查看此图的大图。

兔肝糖原链长分布明显显示出低麦芽低聚糖短糖（DP2）含量高于牛肝糖原（DP7）或牡蛎糖原（DP6）。因此，与牛肝糖原（ACL = 11.9）和牡蛎糖原（ACL = 12.6）相比，兔肝糖原的平均链长（ACL = 9.8）最低。需要注意的是，这些商业糖原通常用于测定糖原磷酸化酶或糖原合酶活性。这表明糖原代谢酶活性的动力学参数（V_max 和K_m）的测定将根据糖原的来源而变化。

减法分析
减法分析是比较两个样品的葡聚糖链分布的简单方法。例如，测定了由野生型（WT）集胞藻PCC6803菌株和单一等基因glgaA1和glgaA2突变株产生的糖原CLD（图6A）。

图6:使用减法分析比较链长分布。 （A）从蓝藻菌株纯化的糖原的链长分布:野生型（WT） 集胞藻 PCC6803和单等基因 glgaA1 和 glgaA2 突变株使用FACE分析测定。均值标准误（SEM）是从三个独立实验中推断出来的。（B）减法分析是通过将WT的每个DP的%减去 ΔglgA1 的每个DP的%，并将WT的每个DP的%减去DP ΔglgA2的每个DP的%来执行减法分析。这种简单的数学操作显示了突变菌株（黑线）中葡聚糖链的改变。（C）根据观察到的每个CLD的最大峰（所有样品均为DP6），对来自 火连囊虫 野生型和突变体的糖原的平均链长分布进行归一化。通过在对数尺度（N_de （DP））上绘制归一化CLD来证明两个分量。每个组件都表示不同的生长停止机制（有关更多信息，请参阅参考文献²）。 请点击此处查看此图的大图。

回想一下，大多数蓝藻菌株具有两个编码糖原合酶活性的基因:GlgA1和GlgaA2²¹。两种酶都将ADP-葡萄糖的残基葡萄糖转移到线性葡聚糖链的非还原末端。如图 6A所示，仅通过查看链长分布曲线来比较样品具有挑战性。减法分析包括减去样品之间每个DP的百分比（图6B）。对WT的%DP减去DP ΔglgA1 突变体的%的减法分析显示DP3，4和5（负值）过量，DP 10-20的含量降低。相比之下，WT的%DP和DP ΔglgA2 突变体%之间的减法分析表明具有相反的效果。由于GlgaA1和GlgaA2之间的减法分析谱不同，这表明每种糖原合成酶亚型在糖原生物合成²¹中的特定功能。

重要的是要注意，减法分析仅适用于涉及与样品并行执行的参考样品的实验。否则，减法分析可以是经验性的，因为它位于参考的归一化CLD上。2015年，Deng和合作者研究了小鼠和人类糖原生长的停止机制，提出了一种替代绘制和解释糖原CLDs来解决这个问题。此图使用最大峰面积对每个 CLD 进行归一化。然后以对数刻度绘制数据，突出显示两个分量。后者说明了链伸长停止²的两种不同机制。通过绘制拟合到较高DP分量的线，绝对参数（即线的斜率和截距）可用于CLD比较，而无需归一化到参考轮廓。在对数尺度上绘制野生型（WT）集胞藻PCC6803菌株的CLD和单个等基因glgaA1和glgaA2突变体，并确定每个谱的拟合线（图6C）。第一种组分在样品之间高度相似，在DP 6处达到最大值。这说明支化酶明确地产生最大这样的链。第二种成分表现为宽肩，已经为小鼠和人类糖原²进行了描述。在Δ glgA1中，第二组分的倾角在较高的DP处出现，并且相应拟合线（红线）的斜率低于野生型剖面。因此，GlgA1的缺乏减缓了生物合成过程中链伸长的停滞，这是由小鼠和人糖原²的空间位阻发生的。这些数据表明，剩余的伸长酶（即GlgaA2）在链拥挤之前产生更长的链。在ΔglgA2中，观察到相反的效应，拟合线的下降幅度更大，证实了剩余的GlgaA1产生的链总体上比GlgaA2在空间位阻之前单独合成的链短。该分析表明，两种亚型都具有不同的动力学和/或它们各自与分支酶活性的协同作用不同。

讨论

糖原颗粒的物理化学性质（例如，大小，形态，溶解度）与组成颗粒的葡聚糖的长度直接相关。生物合成酶和分解代谢酶之间的任何不平衡都会导致链长分布的改变， 并且本身 会导致异常糖原的积累，这可能对细胞¹¹有害。FACE分析是确定糖原链长分布（CLD）的首选方法。如图 2所示，CLD的测定允许推断糖原（ACL）的平均链长值，其反映了糖原颗粒的结构。具有高ACL值的动物糖原与异常颗粒的出现有关。减法分析是比较来自不同遗传背景（突变型与野生型）的两个糖原样品的有用方法。另一方面，通过在对数尺度上绘制归一化到最大峰的CLD，具有独立于参考进行比较CLD的优点，并为我们提供了有关生长糖原机制的信息。

此外，FACE分析是表征糖原代谢酶催化特性的强大技术。例如，所有糖原支化酶都切割（1→4）-α键并将寡麦芽糖基团转移到（1→6）-α位置或分支点上。尽管催化机制相似，但支化酶由于其对多糖（例如，支链淀粉，糖原）的亲和力和转移葡聚糖的长度而具有可区分性²²。因此，可以使用FACE分析²³通过一系列孵育实验和CLD比较来表征和分类分支酶的各种来源（人，植物，细菌）。

如引言中所述，HPAEC-PAD也是确定链长分布^{的替代方法18}。这两种技术都需要通过异淀粉酶型去分枝酶完全水解（1→6）-α键或支化点，然后根据其聚合度（DP）分离直列葡聚糖池。然而，与FACE相比，HPAEC-PAD方法有两个缺点:（1）随着葡聚糖链的增加，安培脉冲响应降低，这不能提供定量信息。这种质量偏差问题可以使用HPAEC-ENZ-PAD来规避，HPAEC-ENZ-PAD涉及阴离子交换柱和PAD²⁴之间的柱后酶反应器。柱式酶反应器将麦芽低聚糖水解成葡萄糖残基，允许恒定的脉冲安培响应。（2） HPAEC-PAD允许分离葡聚糖链，聚合度高达70。虽然分辨率足以测定糖原样品的CLD，但FACE分离DP高达150的链，适用于淀粉样品¹⁷。必须记住，HPAEC-PAD和FACE分析都有优点和缺点。例如，胺化反应需要游离的半缩醛基团与APTS的伯胺功能反应。这意味着APTS标记不能用于缺乏还原末端的葡聚糖链（例如菊粉）。HPAEC-PAD方法不需要存在还原末端。HPAEC-PAD方法的第二个有趣的方面是阴离子交换柱可以加载几毫克的线性葡聚糖，允许用特定的DP或 ¹⁴个C放射性标记的麦芽低聚糖纯化麦芽寡糖用于酶法^{测定18，25}。最后，尽管质谱法（例如，MALDI-TOF）是确定链长分布的快速而灵敏的技术，但该技术的可重复性似乎较低。它高估了长葡聚糖链²⁶的量。然而，后者可用于特定应用，例如MALDI成像以映射细胞组织中糖原的存在²⁷。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AG-501-X8 树脂	BioRad	#1436424	储存 室温
100 mM 乙酸钠缓冲液，pH 4.8			0.82 g 乙酸钠溶于 80 mL 水中。用乙酸将 pH 调节至 4.8，然后用水完成体积至 100 mL—常温保存。
APTS 储备液	Merck	09341-5MG	将 5 mg APT 溶于 48 mL 乙酸 0.2 M. 下储存于 -20 °C。
毛细管	Sciex 分离，Les Ulis，法国
Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623	Thermofisher		在打开的窗口中选择：文件>导入/恢复>ANDI/色谱：选择"添加"选择cdf 文件>导入>下一步 选择文件将在Chromeleon软件中下载的文件夹>完成单击QNT编辑器>参数"最小面积"选择"范围"0.05[信号]*分钟
Excel	Microsoft		打开 Excel> 新建文件> > 文件菜单 点击导入> 在打开的窗口中选择"csv."作为文件类型>选择您的 asc 文件>出现新窗口 第 1 步：选择 Macintosh 或 Window 的 Window，然后对步骤 2 和 3 使用默认设置。> Y 值显示在列 A 中>通过向与采集数据的频率 （4Hz） 对应的每个单元格增加 0.25 秒来手动添加 Time 列。然后绘制图形。
自由干燥仪	Christ	alpha 2-4 LO plus	在冷冻干燥过程之前，将样品储存在 -80 °C 1 小时。
异淀粉酶	Megazyme	E-ISAMY	180 U/mg 蛋白质
麦芽庚糖	Merck	M7753
N-连接碳水化合物分离缓冲液	Sciex Separations，Les Ulis，法国	477623	储存在 4 °C
普鲁兰酶	Megazyme	E-PULKP	30 U/mg 蛋白质
氰基硼氢化钠	Sigma-Aldrich	296813-100ML	1 M 氰基硼氢化钠，溶于 THF
真空蒸发器	Eppendorf	浓缩仪 5301	温度设置为 30 °C。离心直至样品干燥